Глюкозоизомераза: общая характеристика

Размещено на http://www.allbest.ru/

Глюкозоизомераза: общая характеристика

Глюкозоизомераза (КФ 5.3.1.5) принадлежит к классу изомераз, подклассу внутримолекулярных оксидоредуктаз. Расшифровка шифра: 5 - изомераза; 3 - внутримолекулярная оксидоредуктаза; 1 - осуществляющая взаимопревращения альдоз и кетоз; 5 - ксилозоизомераза).

Истинное название фермента - D-ксилоза кетол-изомераза.

Катализируемая реакция.

Фермент глюкозоизомеразу следовало бы назвать ксилозо/глюкозоизмеразой, поскольку основная катализируемая им реакция - это превращение пятиуглеродного моносахарида D-ксилозы в D-ксилулозу, а реакция изомеризации D-глюкозы в D-фруктозу является побочной. Ксилозо/глюкозоизомераза имеет более низкую константу kcat и более высокую константу связывания KM для глюкозы, чем для ксилозы. Это означает, что ксилоза прочнее связывается с ферментом и быстрее превращается в ксилулозу, чем глюкозы превращается во фруктозу (Глик Б., Пастернак Дж., 2002).

Глюкозоизомераза обладает групповой специфичностью, поскольку может изомеризовать: D-глюкозу и D-ксилозу; в меньшей степени-- D-рибозу, а также D-арабинозу, D-аллозу, D-рамнозу и L-арабинозу. Несмотря на то что, наибольшую степень сродства глюкозоизомераза проявляет к D-ксилозе, известны случаи, когда изомераза обнаруживает почти одинаковое сродство как к D-ксилозе, так и к D-глюкозе (Осетров С.Б., 1998-2010)

Предположительно, что на активном центре глюкозоизомеразы происходит по крайней мере 7 стадий, обуславливающих процесс изомеризации. Часть из них носит лишь гипотетический характер:

1. Связывание фермента с субстратом, механизм которого пока не известен

2. Превращение конформации кресла С в форму скошенной лодки В; только эта форма дает цис-ендиол, способный к изомеризации.

Рис. 1 Конформации глюкопиранозы

3. Разрыв глюкозного кольца, который катализируется глутаминовой кислотой в активном центре фермента. Одновременно протон переносится между атомами кислорода карбоксильных групп цис-ендиола. Этот этап ограничивает реакцию, поскольку процесс дециклизации происходит значительно медленнее, чем процесс циклизации.

Рис. 2 Процесс дециклизации глюкозы

4. Связывание альдегидной группы глюкозы за счет водородной связи с гуанидиновым остатком аргиновой кислоты в активном центре глюкозоизомеразы и связывание протона второго атома углерода с атомом N имидазольной группы гистидина из активного центра.

5. Образование цис-ендиола.

6. Перенос протона к первому атому углерода с образованием у второго кетогруппы. Этот механизм изомеризации является внутримолекулярным и не обменивается протонами с водой.

7. Циклизация фруктозы (Грачева И. М., 1987).

Рис. 3 Предполагаемый механизм изомеризации D-глюкозы в D-фруктозу на активном центре глюкозоизомеразы

Строение

Глюкозоизомераза представляет собой олигомерный белок с молекулярной массой 160 кДа, состоящий из 4 субъединиц с молекулярной массой каждой 40 кДа. Фермент относится к группе металлзависимых, содержащих в своей структуре 4 атома Co2+ и до 33 атомов Mg2+. Кобальт участвует в формировании и поддержании четвертичной структуры фермента, а также его стабильности. Удаление трех атомов Co2+ не приводит к полной потери автономности фермента, хотя его стабильность к внешним воздействиям резко падает. Четвертый атом, вероятно, ковалентно связан с остатками аминокислот, и при его удалении нарушается четвертичная структура фермента. Магний является кофактором и помимо повышения стабильности сильно влияет на скорость реакции (Грачева И. М., 1987).

Рис. 4 Трехмерная структура белка. Зеленые сферы в центре рисунка - ионы Mg2+ (Mn2+), образующие каталитический центр фермента. Рисунок получен с помощью программ MolScript и Raster3D

В молекуле глюзоизомеразы присутствуют преимущественно остатки аргинина, глицина и группы, образующие б-спираль (аланин, лейцин, глутаминовая кислота и аспаргин). В тоже время наблюдается пониженное содержание остатков цистеина, серина и лизина. Также особенностью этого термостабильного внутриклеточного фермента является пониженное содержание или полное отсутствие цистеина. Объясняется это восстановительной способностью внутриклеточной среды, сводящей к минимуму окислительные процессы (Осетров С.Б., 1998-2010).

pH и температурный оптимум.

Глюкозоизомеразы являются термостабильными ферментами, оптимум действия которых лежит в интервале температур от 600С до 800С. Но есть и такие, которые имеют оптимум при 900С, а глюкозоизомераза выделенная из B. stearothermophilus, частично сохраняет свою активность даже в кипящей реакционной среде. Глюкозоизомеразы проявляют стабильность в широком диапазоне pH - от 4,5 до 11, оптимум действия находится либо в нейтральной зоне, либо в щелочной, обычно в интервале от 7 до 9. Для практических целей обычно стремятся к низкому pH, чтобы избежать щелочную изомеризацию (Грачева И. М., 1987)

7. Особенности выделения и определения активности фермента.

Производство препаратов глюкоизомеразы в промышленности осуществляется двумя способами: выделением фермента из биомассы продуцента путем полного разрушения клеток; фиксированием фермента внутри клетки и использованием этой биомассы для изомеризации D-глюкозы в D-фруктозу.

Первый способ сложнее, т. к. обычные методы разрушения клеток (растирание с кварцевым песком, обработка растворителями, автолиз и др.) не приводят  к полному выходу фермента из клетки.

Резкое увеличение глюкоизомеразной активности в бесклеточных экстрактах происходит только при добавлении к обрабатываемым клеткам лизоцима (N-ацетилмурамидглюканогидролазы, КФ 3.2.1.17). Первый способ применяется для выделения фермента с целью изучения его свойств и получения иммобилизованных препаратов, а большинство промышленных технологий базируются на втором способе получения глюкоизомеразных препаратов. Выделенный из клеток фермент можно очистить обычными методами.

Отличительной особенностью является термообработка ферментного раствора, при которой балластные белки денатурируют и выпадают в осадок. Выделение фермента в присутствии ионов кобальта и магния значительно повышает устойчивость глюкоизомеразы, что, очевидно, связано со стабилизацией четвертичной структуры. Молекулярная масса ферментов у разных микроорганизмов различна, но большинство из них имеет величину от 160 до 200 кДа.

Фермент применяют только в иммобилизованном виде. Используют два способа получения иммобилизованных препаратов: фиксирование фермента в клетке продуцента и прикрепление ее к носителю; выделение фермента из клетки в растворимом состоянии с последующей его иммобилизацией на носителе (рис. 15.7.9).

Рис. 15.7.9. Принципиальная схема получения катализаторов на основе глюкоизомеразы  (КМХ - карбоксиметилхитозан)

ксилоза моносахарид фермент

8. Функции и применение в промышленности.

Функции: превращает D-ксилозу в D-ксилулозу. Может также превращать D-глюкозу в D-фруктозу. Участвует в метаболизме фруктозы и маннозы, участвует в превращениях глюкуронатов и пентоз.

«Королевой» иммобилизованных ферментов в промышленности можно считать глюкозуизомеразу, которая катализирует превращение глюкозы во фруктозу. Коммерческие препараты ее известны под фирменным названием «Sweetzyme» или «Maxazyme». Их появление послужило толчком для развития крупного производства фруктозного сиропа. При высоких концентрациях субстрата и нейтральных pH нескладкая глюкоза с выходом 42-47% изомеризуется ферментом в более сладкую фруктозу. Такие фруктозные сиропы (Isomerose, Isosyrup, Cornsweet, Isosweet) сегодня широко потребляется пищевой промышленностью в качестве заменителей в производстве безалкогольных напитков и кондитерских изделий. Запатентовано множество способов иммобилизации и использования как самой изомеразы, так и содержащих ее клеток. Процесс идет при 60-650С при pH 4,0-8,5 в присутствии ионов магния. При производстве насыщенного фруктозного сиропа из кукурузы в качестве субстрата используется либо глюкоза, либо продукт комплексной ферментативной переработки, заключающейся в ожижении и осахаривании крахмала (Бич Г. И др., 1988).

Список литературы

1.Бич Г., Бест Д., Брайерли К., Кумбс Дж., Холл Д., Хамер Г., Харди К., Хиггинс И., Джонс Дж., Келли Д., Мелвин М., Одивер С., Пикап Дж., Сил К., Скиннер Ф., Стаффорд Д., Таггарт Дж. Биотехнология. Принципы и применение: пер. с англ./ Под ред. И. Хиггинса, Д. Беста и Дж. Джонса. М.: Мир, 1988. 480 с.

2.Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. М.: Мир, 2002. 589 с.

3.Осетров С.Б. Антология комплексной переработки зерна на спирт, глютеин, крахмальную патоку, кормовые дрожжи. Производство водки, www.sergey-osetrov.narod.ru, 1998-2010.

4.Грачева И. М. Технология ферментных препаратов. 2-е изд., перераб. и доп. М.: Агропромиздат, 1987. 335 с.

Размещено на Allbest.ru