2,2-Ди(4-трет-октилфенил)-1-пикрилгидразил как новый модификатор электрода для вольтамперометрической оценки антиоксидантной активности

Размещено на http://www.allbest.ru/

2,2-ДИ(4-ГРЕГ-ОКТИЛФЕНИЛ)-1-ПИКРИЛГИДРАЗИЛ КАК НОВЫЙ МОДИФИКАТОР ЭЛЕКТРОДА ДЛЯ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ

Г.К. Зиятдинова, Ю.В. Снегурева, Г.К. Будников

2,2-Ди(4-трет-октилфенил)-1-пикрилгидразил (ДТОФПЛ), иммобилизованный на электродной поверхности, предложен как реагент для оценки антиоксидантной активности (АОА). Изучены параметры электровосстановления ДТОФПЛ, иммобилизованного на стеклоуглеродном электроде (СУЭ), модифицированном углеродными нанотрубками и наночастицами диоксидов церия и олова, диспергированными в поверхностно-активных веществах. Установлено, что наилучшие характеристики (степень обратимости системы и максимальные токи восстановления) регистрируются на электроде, модифицированном наночастицами диоксида церия и цетилпиридиний бромидом (ЦПБ). Токи восстановления иммобилизованного ДТОФПГ уменьшаются в присутствии фенольных антиоксидантов, что позволяет использовать созданный электрод для оценки их АОА. Показано, что для протекания реакции с иммобилизованными Д ТОФПГ достаточно 5 мин. Оценку АОА проводили в условиях дифференциально - импульсной вольтамперометрии. Найдены значения ЕС₅₀ для танина, кверцетина, катехина и феруловой кислоты и сопоставлены с ЕС₅₀ по реакции с 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом (ДФПТ) в идентичных условиях. Разработанный способ применен для оценки АОА соков и нектаров.

Ключевые слова: вольтамперометрия, химически модифицированные электроды, наночастицы Се0₂, стабильные радикалы, антиоксидантная активность, анализ пищевых продуктов

Введение

Исследование антиоксидантных свойств индивидуальных соединений и различных объектов, являющихся источниками антиоксидантов для живых организмов, представляет практический интерес. Это связано с важной биологической ролью антиоксидантов, заключающейся в предотвращении развития окислительного стресса путем поддержания равновесия между активными формами кислорода и азота, генерирующимися в клетках в ходе метаболизма, и антиоксидантами эндогенного и экзогенного происхождения [1, 2].

Для оценки антиоксидантных свойств используются различные способы, среди которых следует выделить те, которые основаны на взаимодействии антиоксидантов с радикальными частицами различной природы [3]. Для количественной оценки таких взаимодействий введен параметр антиоксидантная активность (АОА). Поскольку время жизни активных форм кислорода и азота достаточно мало, то чаще всего применяют радикалы, имеющие в своей структуре объемные заместители. Наибольшее распространение среди них получил относительно стабильный радикал 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (ДФПГ").

Поскольку реакции ДФПГ" с антиоксидантами протекают с переносом электрона, для их исследования можно использовать электрохимические методы, характеризующиеся простотой, экспрессностью, экономичностью, надежностью получаемых результатов и возможностью миниатюризации.

Для оценки АОА использовано восстановление ДФПГ" на платиновом электроде в среде метанола в условиях циклической вольтамперометрии. Время реакции антиоксидантов с радикалом составляет 10 мин. АОА выражали через соотношение токов восстановления ДФПГ" до и после реакции с антиоксидантами [4, 5]. Этот же принцип применен для оценки АОА флавоноидов в среде диметилсульфоксида [6].

Предложен новый амперометрический метод определения АОА, основанный на восстановлении 100 мкМ ДФПГ" на стеклоуглеродном электроде (СУЭ) в среде 0.033 М фосфатного буферного раствора рН 7.4, содержащего 0.033 М KCl и 40% этанола. В качестве стандарта использовали тролокс. Амперометрический отклик системы линеен до 30 мкМ тролокса с пределом обнаружения 0.05 мкМ. Разработанный способ был применен для оценки АОА некоторых индивидуальных антиоксидантов, а также чая, вина и других напитков [7].

Разработан новый биамперометрический метод селективного определения АОА, основанный на аналитических сигналах редокс-пары ДФПГ"/восстанов- ленный ДФПГ" на стеклоуглеродных [8] и платиновых [9] электродах. Измерения проводили в двухэлектродной ячейке, катодное и анодное отделения которой были разделены полупроницаемой мембраной. Разность потенциалов, накладываемая на электроды, составляла 200 мВ. Показана электрохимическая обратимость редокс-пары ДФПГ '"/восстановленный ДФПГ\ Селективность определения АОА была проверена на различных антиоксидантах в фосфатно-этанольном буферном растворе рН 7.40. В качестве стандарта использован тролокс, предел обнаружения которого составил 0.05 мкМ в случае стеклоуглеродных и 0.0768 мкМ для платиновых электродов. Ток линейно зависит от концентрации до 25 и 30 мкМ тролокса соответственно.

Другой подход к оценке АОА основан на восстановлении ДФПГ^" на платиновом печатном электроде в условиях дифференциально -импульсной вольтамперометрии на фоне KCl в метаноле [10]. АОА выражали как разность токов пиков электровосстановления ДФПГ^" до и после реакции с антиоксидантами. В качестве стандарта использовали а-токоферол. Метод применен для оценки АОА оливковых масел.

Интересен автоматизированный амперометрический способ определения антиоксидантов в продуктах питания, основанный на их взаимодействии с ДФПГ" в качестве редокс-индикатора. Электроды (рабочий - свинцовый стержень, вспомогательный - платиновый и насыщенный хлоридсеребряный в качестве электрода сравнения) последовательно перемещаются в планшете для микротитрования на 24 ячейки. Подход характеризуется простотой и в отличие от обычных электрохимических способов не требует промывания ячейки между измерениями.

Кроме того, за счет автоматизации снижается вероятность ошибочных измерений [11]. Способ апробирован на образцах чая, а также на фруктовых соках и экстрактах растительного сырья.

Другой подход к автоматизации способов оценки АОА заключается в использовании проточных методов, обладающих рядом преимуществ по сравнению с регистрацией сигнала в стационарных условиях. Проточный режим обеспечивает строгий контроль условий протекания реакции в пространстве и времени и высокую производительность [12].

Проточно-инжекционные способы с амперометрическим детектированием в среде фосфатно-этанольного буферного раствора на золотом печатном электроде и СУЭ, модифицированном многостеночными углеродными нанотрубками (МУНТ), предложены для оценки АОА вин [13] и экстрактов тайских овощей [14] соответственно. Проточно-порционный анализ с амперометрическим детектированием на СУЭ в среде этанольно-ацетатного буферного раствора позволяет определять АОА чая и экстрактов моринги и бразильской вишни. Производительность системы составляет 180 проб в час [15].

Вышеописанные способы электрохимической оценки АОА основаны на взаимодействии антиоксидантов с ДФПГ в растворе. Однако ДФПГ растворим лишь в органических растворителях [16], он чувствителен к воздействию света, кислорода воздуха и pH среды [17]. При увеличении доли воды до 60% реагент коагулируется [18] и не вступает в реакцию с антиоксидантами [19].

Для нивелирования этих недостатков можно применить иммобилизацию радикала на поверхности электрода. Изучено вольтамперометрическое поведение микрочастиц ДФПГ\ иммобилизованных на поверхности графитового электрода в водной среде рН 7.0. На циклических вольтамперограммах наблюдается обратимая редокс-пара при 0.340 В относительно насыщенного хлоридсеребряного электрода. Показано, что процесс восстановления протекает по ЕС-механизму [20]. Однако в электропревращении участвует лишь часть иммобилизованных микрокристаллов ДФПГ\ что приводит к неполному протеканию реакции, а, следовательно, и к неприменимости подхода к анализу реальных образцов.

Этот недостаток успешно преодолевается при использовании СУЭ, модифицированного наночастицами диоксида церия, диспергированными в среде катионного поверхностно-активного вещества цетилпиридиний бромида (ЦПБ), в качестве подложки для иммобилизации ДФПГ [21]. АОА оценивали по относительному уменьшению тока восстановления ДФПГ в дифференциально-импульсном варианте вольтамперометрии. Подход применен для оценки АОА индивидуальных антиоксидантов, а также спиртовых и водных извлечений из лекарственного растительного сырья. Результаты хорошо согласуются с данными стандартного спектрофотометрического метода.

Для дальнейшего развития этого направления исследований в качестве модификатора поверхности электрода для вольтамперометрической оценки АОА представляет интерес новое производное ДФИГ" - 2,2-ди(4-трет-октилфенил)-1- пикрилгидразил (ДТОФПГД)

1. Экспериментальная часть

1.1 Реактивы. В работе использовали танин фармакопейной чистоты (Fluka, Германия), 98%-ный кверцетина дигидрат, 98%-ный катехина гидрат (Sigma, Германия) и 99%-ную феруловую кислоту (Aldrich, Германия). Остальные реактивы были квалификации х.ч. Их стандартные 10 мМ растворы готовили растворением точной навески в 5.0 мл этанола (ректификата).

Стандартные 0.65 мМ растворы ДТОФПГ и ДФПГ (Aldrich, Германия) готовили растворением точной навески в метаноле (х.ч.).

Для модифицирования поверхности электрода использовали наночастицы диоксида церия (размер частиц 25 нм) и диоксида олова диаметром < 100 нм от Aldrich (Германия), функционализированные карбоксильными группами многостеночные углеродные нанотрубки (МУНТ-СООН) (Aldrich, Германия) диаметром 9.5 нм и длиной 1.5 мкм, а также многостеночные углеродные нанотрубки (МУНТ) с внешним диаметром 40-60 нм, внутренним диаметром 5-10 нм и длиной 0.5-500 мкм от Aldrich (Германия).

Наночастицы диоксидов церия и олова и МУНТ-СООН диспергировали в среде 0.45 мМ ЦПБ (Aldrich, Германия), а МУНТ - в 1%-ном додецилсульфате натрия под действием ультразвука. Стандартные растворы (0.5 мМ ЦПБ и 1% - ный додецилсульфат натрия) готовили по точной навеске, которую растворяли в дистиллированной воде.

1.2 Приборы. Вольтамперометрические определения проводили на потенциостате/гальваностате pAutolab Type III (Eco Chemie B.V., Нидерланды) с программным обеспечением GPES, v. 4.9.005 (Eco Chemie B.V., Нидерланды). В работе использовали рабочий СУЭ («S' = 7.07 мм²), свернутую спиралью платиновую проволоку (l = 6.0 см) в качестве вспомогательного электрода и электрод сравнения - насыщенный хлоридсеребряный электрод. Перед началом работы поверхность платиновых электродов очищали в HNO₃ (1:1) в течение 3 мин и промывали дистиллированной водой.

Измерение рН проводили на иономере «Эксперт-001» (ООО «Эконикс- Эксперт», Россия).

1.3 Модифицирование электродов. СУЭ модифицировали методом капельного испарения 5 мкл гомогенных дисперсий CeO₂ и SnO₂ в 0.45 мМ ЦПБ с концентрацией 0.5 и 1.0 мг/мл соответственно или 0.5 мг/мл суспензий углеродных нанотрубок в поверхностно-активных веществах с концентрацией. Затем на поверхность наносили 5 мкл раствора ДТОФПГ или ДФПГ\ Рабочую поверхность СУЭ очищали механически на оксиде алюминия, после чего ополаскивали электрод последовательно ацетоном и дистиллированной водой.

1.4 Вольтамперометрические измерения проводили следующим образом: в электрохимическую ячейку объемом 10.0 мл вносили 3.6 мл фонового электролита и аликвоту исследуемого раствора (2-400 мкл), доводя долю этанола до 10%. Опускали рабочий (ДТОФПР- или ДФПТ-модифицированные электроды), вспомогательный и хлоридсеребряный электроды и регистрировали циклические вольтамперограммы от 0.7 до 0 В. Скорость развертки потенциала варьировали в диапазоне 100-500 мВ/с. Количественную оценку АОА проводили в условиях дифференциально-импульсной вольтамперометрии в диапазоне потенциалов от 0.65 до 0 В при амплитуде импульса 50 мВ, времени импульса 50 мс и скорости развертки потенциала 10 мВ/с. Для лучшей идентификации пиков в дифференциально-импульсном режиме использовали коррекцию базовой линии.

1.5. Расчет АОА. Для индивидуальных соединений АОА выражали как ЕС₅₀ - эффективную концентрацию антиоксиданта, при которой восстанавливается 50% свободных радикалов, и рассчитывали по следующему уравнению, исходя из графиков зависимости степени ингибирования радикалов от концентрации антиоксиданта:

АОА соков выражали как соотношение токов восстановления ДТОФПГ до и после реакции с антиоксидантами образца согласно формуле:

где 1₀ и I - токи восстановления ДТОФПГ до и после реакции с антиоксидантами образца соответственно, мкА.

Статистическую обработку данных проводили для трех измерений при доверительной вероятности 0.95. Результаты представляли в виде X ± XX, где X - среднее значение и XX - доверительный интервал. Случайную погрешность оценивали по величине относительного стандартного отклонения ( у). Регрессионный анализ проводили в программе Origin 8 (OriginLab, USA).

Результаты и их обсуждение

G.K. Ziyatdinova, Yu.V. Snegureva, H.C. Budnikov

Kazan Federal University, Kazan, 420008 Russia

Abstract

2.2- di(4-terf-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl (DTOPPH*) immobilized on the electrode surface has been proposed as a reagent for the evaluation of antioxidant activity (AOA). The electroreduction parameters of DTOPPH^- immobilized on glassy carbon electrode (GCE) modified with carbon nanotubes, cerium and tin dioxide nanoparticles dispersed in surfactants have been studied. The best characteristics (system reversibility and maximal reduction currents) have been obtained on the electrode modified with cerium dioxide nanoparticles and cetylpyridium bromide (CPB). The reduction currents of the immobilized DTOPPH^- are decreased in the presence of the phenolic antioxidants allowing application of the electrode created for their AOA evaluation. Five minutes have been shown to be enough for the reaction of antioxidants with the immobilized DTOPPH^-. AOA evaluation has been performed under conditions of differential pulse voltammetry. EC₅₀ parameter for tannin, quercetin, catechin and ferulic acid has been found and compared with that one based on the reaction with 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl under the same conditions. The approach developed has been applied for the evaluation of AOA in juices and nectars.

Keywords: voltammetry, chemically modified electrodes, CeO₂ nanoparticles, stable radicals, antioxidant activity, food analysis

Figure Captions

Fig. 1. The cyclic voltammogram of 0.65 mM DTOPPH immobilized on GCE in phosphate buffer solution, pH 7.4. The potential scan rate is 100 mV/s.

Fig. 2. Structures of the phenolic antioxidants under investigation.

Fig. 3. The cyclic voltammograms of DTOPPH7Ce0₂-CPB/GCE in phosphate buffer solution, pH 7.4 (curve 1) and in the presence of 10 pM quercetin (curve 2). The potential scan rate is 500 mV/s. The exposure time is 10 min.

Fig. 4. a) The differential pulse voltammograms of DTOPPH7Ce0₂ - CPB/GCE in phosphate buffer solution, pH 7.4 (curve 1) and in the presence of ferulic acid at different concentrations: 2 -10; 3 - 50; 4 - 100; 5 - 500; 6 - 1000 and 7 - 5000 pM. The pulse amplitude is 50 mV; the pulse time is 50 ms; the potential scan rate is 10 mV/s. The exposure time is 5 min. b) The dependence of DTOPPH inhibition on the concentration of ferulic acid.

Fig. 5. The differential pulse voltammograms of DTOPPH7Ce0₂ - CPB/GCE in phosphate buffer solution, pH 7.4 (curve 1) and in the presence of 200 pL of pomegranate juice (a) and mango-orange nectar (b) (curve 2). The pulse amplitude is 50 mV; the pulse time is 50 ms; the potential scan rate is 10 mV/s. The exposure time is 5 min.

Fig. 6. The effect of the sample aliquot volume on the AOA value.

Размещено на Allbest.ru