Фотоиндуцированный разрыв связи Fe(II)-O2 в оксигемоглобине

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Фотоиндуцированный разрыв связи Fe(II)-O2 в оксигемоглобине

Чайковский Артур Фёдорович



Введение

Многие физиологические процессы обусловлены взаимодействием лигандов с макромолекулами, особенно с белками. К этим процессам в первую очередь относятся взаимодействия ферментов с их субстратами, а также с другими молекулами, в том числе с малыми, в результате которых изменяются функциональные свойства белков. Таким образом, нет сомнений в том, что фактически все биологические явления связаны с взаимодействиями макромолекул с лигандами, и не удивительно, что множество биохимических и биофизических исследований направлено на всестороннее изучение этих взаимодействий.

Гемоглобин Hb в этом отношении не является исключением. Свойства кислород-транспортного белка давно интригуют исследователей. Необходимо точно установить, в каком электронно-возбуждённом состоянии происходит отсоединение молекулярного кислорода, чтобы можно было выяснить динамику его ассоциации и диссоциация. Это нужно для нахождения констант скорости этих процессов и сродства кислорода к гемоглобину. Также здесь немалую роль играет ещё одна до конца не разрешённая проблема природы связи кислорода с железом и детального механизма её разрыва. Решение всех этих вопросов представляет собой не только интересную фундаментальную задачу взаимосвязи точного функционирования гем-белков и их структуры и процессов в них, но и прикладную задачу регулирования процессов связывания кислорода гемоглобином.

Для решения этих задач предлагается использовать фотоиндуцированный разрыв связи Fe(II)-O2. Если после возбуждения в определённую длину волны связь рвётся, можно говорить о том, что это происходит в соответствующем или более низкоэнергетическом состоянии. В работе [1] 1983 г. показано, что в возбуждении в 1064 нм низколежащие CT- состояния не являются диссоциирующими (квантовый выход диссоциации менее 0.001). Целью моей работы является проверка этого результата, а также повышение его точности и достоверности на современной установке, позволяющей на порядок снизить ошибку измерения. Также необходимо получить эталонные кинетики для случая, когда разрыв связи всё-таки происходит и вычислить время повторного связывания гемоглобина с O2.



1. Строение и функции гемоглобина

Гемоглобин - это гемсодержащий белок, способный обратимо связывать молекулярный кислород. Гемоглобин является главным компонентом эритроцитов и выполняет две важнейшие биологические функции: транспорт во все органы и части тела молекулярного кислорода (О2), поглощающегося в легких, и перенос углекислого газа (СО2) от периферических тканей к дыхательным органам для последующего выведения из организма [2]. В мышечных тканях гемоглобин передаёт кислород миоглобину, который, в свою очередь, накапливает его и облегчает диффузию от периферийных областей клетки к митохондриям. В нервных клетках схожую с миоглобином роль выполняет другой белок того же семейства нейроглобин, а во всех остальных цитоглобин.

Также нужно отметить, что гемоглобин способен связывать другие малые молекулы: CO, NO, CN и др. При связывании с NO белки семейства глобиновых исполняют роль утилизатора активной формы азота. Свойство связывания с угарным газом и алкилизоцианидов не играет никакой биологически важной роли, однако является причиной отравления различными веществами.

1.1 Третичная структура

Трехмерная структура гемоглобина (рис. 1.1) была определена рентгеноструктурным методом. Она представляет собой тетрамер, состоящий из двух б и двух в субъединиц, каждая из которых содержит гем b (Fe-протопорфирин IX) (рис. 1.2), которых как раз и является активным центром связывания малых лигандов [3]. Все четыре полипептидные субъединицы контактируют с тремя другими и таким образом формируют четвертичную структуру белка, похожую на сферу. Методом рентгеноструктурного анализа также было установлено, что гемоглобин может существовать в двух различных конформациях T и R, соответствующих нелигандированной и лигандированной формам белка.

Миоглобин, за исключением некоторых особенностей строения, таких как длина полипептидной цепи и наличие дополнительных полостей,в целом подобен отдельным субъединицам гемоглобина, хоть эти особенности и определяют отличие кинетических параметров от б и в субъединиц.Тем не менее, всё же аминокислотные последовательности в субъединицах гемоглобина существенно отличаются от аналогичных последовательностей в миоглобине.

Рис. 1.1 - Структура гемоглобина. Субъединицы б1, б2, в1 и в2 обозначены на рисунке. Черным цветом выделены четыре молекулы гема, показанные скелетными моделями с ионом железа внутри [3]



Рис. 1.2 -Структурная формула гемовой группы гемоглобина (Fe-протопорфирина IX) [2].

Миоглобин, б и в субъединицы гемоглобина состоят соответственно из 153, 141 и 146 аминокислотных остатков [2]. Миоглобин и в субъединицаимеют восемь спиральных областей различной длины, б субъединица - семь. Спиральные области обозначаются латинскими буквами, от А (ближайшая к аминоконцу спиральная область полипептидной цепи) до Н (ближайшая к карбоксильному концу), а аминокислоты нумеруются от N-конца по их положению во всей цепи и в каждой спирали в отдельности.

1.2 Положение и строение гема

Железо гема в субъединицах гемоглобина координировано с четырьмя атомами азота пиррольных колец протопорфирина IX (рис. 1.2) и с атомом азота имидазольного кольца остатка аминокислоты - His(F8), входящего в состав полипептидной части белков [2]. Гистидин, с которым происходит координацияFe(II), называется проксимальным. Гистидиновый остаток His(E7) с противоположной стороны вследствие удаленности от железа называется дистальным стороной и не координируется с ним. В шестом координационном положении происходит связывание О2 и других нейтральных лигандов.

Гем локализован в расщелине между спиралями E и F. Край гема, содержащий полярные пропионовые остатки, расположен вблизи поверхности, а остальная часть гема погружена внутрь белковой части глобина,который является гидрофобной и называется гемовым карманом [3]. Остатками, ограничивающими гемовый карман и контактирующими с порфирином, являются His(E7), Leu(B10), Val(E11), Phe(CD1) и Leu(G8). Глобиновая часть регулирует обратимое, без окисления железа, связывание и высвобождение лиганда.

Лиганд-связывающая форма гемоглобина содержит двухвалентное железо гема и в отсутствии кислорода или другого лиганда называется и обозначается дезоксигемоглобином (Hb). В связанном с кислородом состоянии она называются оксигемоглобином (HbO2). С миоглобином ситуация аналогична. Железо гема может окисляться до трехвалентного состояния. Находящийся в такой форме белок называют ферригемоглобин или метгемоглобин [2]. С окисленными белками необратимо связываются такие лиганды, как H2O, CN и другие.

Оксигенирование гемоглобина сопровождается структурными изменениями в окружении гемовой группы. При оксигенировании атом железа, который в Hb выступал на 0.06 нм из плоскости гемового кольца, втягивается в эту плоскость. Вслед за атомом железа ближе к гему перемещается и проксимальный His(F8), а также связанные с ним соседние аминокислотные остатки, что вызывает конформационную перестройку всего белка [2].



2. Спектральные свойства гемоглобина

Спектры поглощения гемоглобина в оптическом диапазонеобусловлены поглощением гема (рис. 2.1). Спектр поглощения имеет несколько характерных полос: B-полоса (полоса Соре)в области 400 - 450 нм, Q-полоса в области 530 - 570 нм и слабоинтенсивная полосаIII около 760 нмдля дезоксигемоглобина. Поглощение дезоксиформы отличается от спектра оксигемоглобина, что является следствием различного строения электронных уровней двух форм.

Рис. 2.1 - Спектры поглощения окси- (---) и дезоксигемоглобина (- -) в видимой, ближних ультрафиолетовой и инфракрасной областях спектра [4]

2.1 Электронные уровни энергии гема

Наибольшее влияние на положение возбужденных электронных состояний оказывает входящий в состав гема атом Fe(II), который содержит незаполненную d-оболочку (электронная конфигурация 3d6), существенно усложняя её. В этой системе в спектре поглощения наблюдаются полосы, относящиеся к электронным переходам различной природы (рис. 2.2): (1) (р,р*)-переходы; (2) (d,d)-переходы между d-орбиталями металла; (3) переходы с переносом заряда (СТ). В результате вблизи нижних возбужденных синглетных 1(р,р*) и триплетных 3(р,р*)-уровней могут располагаться (d,d)-уровни металла, а также уровни состояний с переносом заряда СТ (рис. 2.3) [4]. Наличие у гема низколежащих уровней отличной от (р,р*)-природы, приводит к тому, что из возбужденного электронного состояния (р,р*)-природы гем релаксирует в основное состояние за время не более единиц пикосекунд, а значение суммарного квантового выхода люминесценции (флуоресценции и фосфоресценции) не превышает 10-6.

Рис. 2.2 - Схематическое изображение орбиталей и возможных переходов между ними в комплексе порфирина с ионом переходного металла (электронная конфигурация d6) [4]



Рис. 2.3 - Упрощенная диаграмма энергетических уровней и возможных переходов между ними для оксигенированного гема в составе гемоглобина [3]

2.2 Фотоиндуцированный разрыв связи кислорода с железом

В гемоглобине ион железа находится в парамагнитном состоянии S = 2. Присоединение кислорода переводит гемовое железо в диамагнитное состояние S = 0. Существует две точки зрения о том, как связаны Fe(II) иO2. Первая говорит, что электронная конфигурация и степень окисления не меняется. Согласно второй в HbO2железо находится в феррисостоянии Fe(III), а шестой d-электрон переносится на О2. При этом неспаренный d-электрон спаривается с неспаренным электроном анион-радикала О2*? , что и приводит к диамагнетизму оксигенированных гембелков [5].

Тщательные исследования различных типов спектральных данных, таких как поляризованные спектры поглощения монокристаллов окси- и дезоксигемоглобина, спектры кругового дихроизма и магнитного кругового дихроизма, позволили отнести наблюдаемые полосы поглощения к определенным орбитальным переходам. В частности, слабоинтенсивная полоса поглощения перенос-зарядовой природы (полоса III), расположенная в ближней инфракрасной области спектра вблизи 760 нм (?13000 см-1) приписана переходу a2u(р)>dyz, реализующемуся только для пятикоординированного гема. Положение этой полосы чувствительно к относительной ориентации железа и проксимального гистидина His(F8).

Рис. 2.4 - Развернутое сравнение двух диаграмм энергетических уровней и возможных переходов между ними для оксигенированного гема и неоксигенированного гемма [6]

Для изучения реакции связывания молекулы лиганда (например, О2) с белком используется явление фотоиндуцированной диссоциации, когда с помощью ультракоротких лазерных импульсов в фиксированный момент времени разрывается связь железа гема с лигандом и далее исследуется реакция повторного связывания.

Установлено, что процесс фотодиссоциации оксигемоглобина происходит за время <50 фс, в то время как продукты со спектром, подобным спектру поглощения дезоксигемоглобина появляются только к ~350 фс [4]. В связи с этим, последовательность внутримолекулярных процессов при фотодиссоциации оксигемоглобина выглядит следующим образом. После фотовозбуждения оксигемоглобина в синглетное 1(р,р*)-состояние 1S, в результате интеркомбинационной конверсии молекула гема переходит в триплетное 3(р,р*)-состояние 3T (рис. 2.3; процессы 1 и 2)[4]. Предполагается, что в этом состоянии происходит фотодиссоциация. В работе [1] экспериментально было показано, что 1,3CT-состояния (рис. 2.3) не являются диссоциирующими, что, впрочем, лишь даёт ограничение на квантовый выход в этом состоянии. Для повышения достоверности этих данных, необходимо повторить этот эксперимент с большей точностью, и современная техника даёт возможность это сделать.

Использование методов пико- и субпикосекундной спектроскопии позволило измерить первичный квантовый выход диссоциации г0, определенный как отношение числа фотодиссоциированных молекул О2 к числу поглощенных квантов света [3]. Для оксигемоглобина и его изолированных б и в цепей онсоставляет значение 0.23 ± 0.03. Квантово-механические расчеты показали, что наличие конкурирующего канала безызлучательной дезактивации в недиссоциирующие низкоэнергетические состояния перенос-зарядовой природы (рис. 2.3; процессы 3 и 4)обуславливает сравнительно низкое значение первичного квантового выхода фотодиссоциации для HbO2 (г0 = 0.23) по сравнению с первичным квантовым выходом фотодиссоциации для HbCO (г0? 1.0), который не имеет низколежащих СТ-состояний [2].

После завершения процессов электронной релаксации происходит образование основного состояния с избытком колебательной энергии. Даже в случае фотодиссоциации, когда значительная часть энергии уходит на разрыв связи Fe-лиганд, остается достаточное количество “избыточной энергии” (не менее 50 кДж/моль), которая распределяется между колебательными модами молекулы гема[2]. Этот избыток тепловой энергии затем передается окружающей среде: белку и растворителю. Процесс тепловой релаксации гема (“heme cooling”) (рис. 2.4; процесс 6) носит биэкспоненциальный характер и включает в себя быструю (1-4 пс) и медленную (~20 пс) компоненты с преобладанием быстрой составляющей [3].

Таким образом, при фотовозбуждении оксигемоглобина фотофизические процессы протекают в субпикосекундном и пикосекундном (?20 пс) временном диапазоне[4]. В свою очередь, спектральные изменения, наблюдаемые от ~20 пс вплоть до 1000 с, обусловлены связыванием лиганда и конформационными релаксациями в белке [3].



3. Связывание лигандов гемоглобином

Изучение взаимодействия лигандов с макромолекулами с равновесной точки зрения дает представление о термодинамических характеристиках и общем механизме этих процессов. Однако для понимания детального механизма взаимодействий недостаточно только одних равновесных измерений. Поэтому существует множество реакционных схем, которые могут объяснить данный набор термодинамических данных. Эти схемы позволяют не только установить пути протекания реакций, но они также дают количественное представление о масштабе времени элементарных стадий; на основе полученных данных можно сделать вывод о молекулярном механизме реакций [7].

Все биохимические системы проявляют динамические свойства. Во многих случаях само физиологическое свойство является по существу динамическим свойством [7]. Поэтому изучение динамических свойств биохимических систем уже в течение многих лет привлекает к себе большое внимание.

3.1 Аллостерические белки

Так называют обычно белки, которые имеют места связывания (регуляторные места), специфические для физиологических молекул, регулирующих активность белка [7]. Для ферментовэти места отличаются от мест связывания субстрата в активном центре. Для гемоглобина, который по природе своей не является ферментом, это означает просто изменение функциональных свойств.

Замечательной особенностью аллостерических белков является то, что кинетика реакций с их участием обычно описывается негиперболической кривой. Для аллостерического белка наблюдается сигмоидная кривая, т.е. при низких концентрациях лиганда скорость мало чувствительна к увеличению его концентрации, однако по мере роста концентрации лиганда достигается такое значение этой концентрации, при котором скорость начинает резко возрастать в ответ на небольшое увеличение концентрации лиганда [7]. Другими словами, обнаруживается кооперативиый характер процесса. Этот тип кинетики резко отличается от гиперболической зависимости Михаэлиса-Ментен для обычного неаллостерического белка. Благодаря сигмоидной зависимости скорости от концетрации белок способен резко изменять скорость образования продукта в ответ на небольшие изменения концентрации лиганда.

3.2 Кооперативность связывания гемоглобином

Процесс связывания одного лиганда (Х) макромолекулой гембелка (Р), можно представить реакцией вида

(1)

где k' и k - константы прямой и обратной реакции; K = k'/k является константой равновесия или сродством [2]. Кинетики равновесного связывания лигандов гемоглобином описываются простой гиперболической зависимостью (рис. 3.1, кривая a), полученной для реакции вида (1).



Рис. 3.1 - Кривые насыщения кислородом мономерного миоглобина (a) и тетрамерного гемоглобина при рН 8.5 (b) и рН 6.8 (c). Отмечено артериальное давление кислорода, при котором он поглощается гемоглобином крови в легких, и венозное давление, при котором он отдается гемоглобином мышечному миоглобину [3]

В отличие от миоглобина, гемоглобин обладает механизмом изменения сродства к лиганду. Хорошо известно, что связывание молекулы лиганда (О2, СО или NO) с какой-либо из субъединиц гемоглобина приводит к изменению конформации других соприкасающихся субъединиц. В результате сродство каждой субъединицы к молекуле лиганда увеличивается, по мере того как насыщаются лигандами другие гемы того же тетрамера [2]. Иными словами, тетрамерный гемоглобин связывает лиганды кооперативно, вследствие чего кривая насыщения гемоглобина лигандами имеет ярко выраженный сигмоидальный характер (рис. 3.1, кривые b и c).

Кооперативные взаимодействия объясняется переходом Hb от структуры с низким сродством к лиганду (T-конформация) к структуре полностью насыщенной лигандами и характеризующейся высоким сродством (R-конформация). Дело в том, что при присоединении кислорода железо смещается в плоскость порфирина, тянет за собой гистидиновый остаток и всю цепь полипетидную цепь, вызывая конформационную перестройку.

3.3 Эффект Бора

Недавно была предложена новая интерпретация молекулярного механизма кооперативности и аллостерии Hb [3]. Было показано, что в отсутствии гетеротропных аллостерических эффекторов Hb обладает относительно умеренной кооперативностью, которая существенно увеличивается только лишь в присутствии эффекторов, таких как протоны, фосфаты и хлорид ионы [3]. В этом случае разнообразие функциональных свойств белка обусловлено, главным образом, изменением третичной структуры белка взаимодействующего с эффекторами, а не T/R переходом, как считалось ранее. Причем, наибольшее разнообразие свойств наблюдается при изменении третичной структуры оксигенированного гемоглобина (HbO2).

Аллостерические эффекторы, присоединяющиеся в местах отличных от лиганд-связывающих сайтов, позволяют тетрамеру гемоглобина принимать и отдавать лиганды в зависимости от меняющихся физиологических условий [3]. Так, увеличение рН выше значения 6.5 приводит к увеличению сродства гемоглобина к О2 (рис. 3.1, кривые c и b). Этот рН-эффект, названный щелочным эффектом Бора, объясняется высвобождением протонов при конформационном переходе от нелигандированной к полностью насыщенной лигандами молекулярной структуре белка [7]. Такой механизм регуляции сродства является одним из основных механизмов осуществляющих физиологическую функцию транспорта кислорода гемоглобином. Щелочной эффект Бора ускоряет обмен кислорода и углекислого газа. По мере того как кровь циркулирует по капиллярам, СО2 попадает в клетки крови, где карбонангидраза катализирует реакцию

. (2)

Освободившиеся протоны захватываются гемоглобином, что, в соответствии со щелочным эффектом Бора, способствует высвобождению кислорода из гемоглобина. В то время как бикарбонат ионы диффундируют сквозь мембрану эритроцита в окружающую плазму, зарядовая нейтральность поддерживается диффузией в клетку ионов хлора, где последние связываются с дезоксигенированным гемоглобином [7]. Обратно, при оксигенации происходит высвобождение хлорид ионов и протонов. Таким образом, щелочной эффект Бора связан с взаимодействием ионов хлора с тетрамером гемоглобина.

3.4 Модель Эдера

Лигандирование гемоглобина может быть описано с помощью различных аллостерических моделей. Так, в рамках модели Эдера взаимодействие лигандов с гемоглобином, содержащим четыре гема, описывается четырьмя константами равновесия:

(3)

где Х обозначает лиганд; Hb, HbX, HbX2, HbX3 и HbX4 - молекулы гемоглобина без лиганда, с одним, двумя, тремя и четырьмя лигандами соответственно; Ki (i=1..4) - константа равновесия[3]. В модели Эдера при рассмотрении свойств связывания лигандов, константы для б и в субъединиц в составе тетрамера гемоглобина принимаются идентичными. Однако, такое приближение может быть ошибочным вследствие возможного влияния на константы различного окружения гемов в б и в полипептидных цепях белка[3]. Наиболее полно реакция лигандирования тетрамера гемоглобина может быть представлена в рамках расширенной модели Эдера, учитывающей возможные отличия лиганд-связывающих свойств б и в субъединиц белка [2]. Модель оперирует 10 различными состояниями HbA и 16 константами равновесия. Наиболее наглядно реакция оксигенации HbA в рамках расширенной модели Эдера может быть представлена следующей схемой:

где (бв)(бв) и (бO2вO2)(бO2вO2) ? дезокси- и оксигемоглобин, (бв) и (бO2вO2) ? дезокси- и оксигенированный димер HbA. При этом каждой i-ой стадии реакции (i=1..16) соответствует равновесная константа (сродство) Ki, которая определяется как отношение бимолекулярной константы скорости ассоциации k'i к мономолекулярной константе скорости диссоциации ki[2]. Таким образом, для полного описания сигмоидального характера оксигенации гемоглобина необходимо знать 16 констант скоростей прямой реакции и такое же количество констант скоростей обратной реакции.



4. Экспериментальная часть

Для того чтобы исследовать энергетическую структуру уровней гемоглобина необходимо перевести гем в более высокоэнергетическое состояние и посмотреть, как изменится спектр. Если происходит фотодиссоциация кислорода и появляется дезоксиформа гемоглобина, т.е. если хотя бы одна из четырёх молекул кислорода отщепляется, то на определённых длинах волн наблюдается изменение оптической плотности.

4.1 Метод лазерного флеш-фотолиза

Для проведения такого диссоциации используется метод флеш-фотолиза. Он основан на освещении образца коротким лазерным импульсом, благодаря действию которого в возбужденное состояние переходит одновременно значительная доля молекул исследуемого вещества[8]. Поглощение кванта света происходит очень быстро (за 10-14 с), тогда как процессы последующего распада возбужденных состояний могут происходить с различными скоростями, перекрывая широкий временной диапазон от пикосекунд до секунд. При поглощении веществом высокоинтенсивной вспышки света фотопродукты образуются в достаточно высоких концентрациях, позволяющих проводить их спектральное определение.

Промежуточные короткоживущие продукты фотохимических реакций можно исследовать, пропустив через образец зондирующее излучение от дополнительного источника и регистрируя переходный процесс (кинетику изменения переходного спектра на одной длине волны) после действия возбуждающей вспышки [8].

Если в образце после облучения импульсом света происходят изменения оптических свойств, то это может быть зарегистрировано в некотором спектральном и временном диапазоне. Будем считать, что изменяется оптическая плотность (4):

D(л, t) = D0(л) + ДD(л, t), (4)

где D(л, t) -полная оптическая плотность, D0(л)-исходная оптичеcкая плотность (спектр), ДD(л, t) -изменение оптической плотности, обусловленное исследуемым процессом. Это изменение регистрируется по изменению интенсивности I зондирующего света (5):

I(л, t) = I0(л) ехр(-ДD(л, t) ln(10)), (5)

где ln(10) указывает, что оптическая плотность D десятичная.

В свою очередь, изменение интенсивности прошедшего через образец и подающего на фотоприёмник света вызывает изменение напряжения на ФЭУ. И в случае, когда характерные времена исследуемых процессов намного превышают время отклика спектрометра на импульс возбуждающего света, изменение оптической плотности выражается формулой:

(6)

где - исходное напряжение на ФЭУ. Данная формула позволяет перевести данные на ФЭУ в изменение оптической плотности. Далее будут использованы значения в эксперимент с возбуждением в 532 нм и в эксперимент с возбуждением в 1064 нм.

4.2 Экспериментальная установка

Кинетические измерения параметров в наносекундном - миллисекундном временном интервале были проведены на созданной автором [3] установке лазерной кинетической спектроскопии. Общая схема установки представлена на рис. 4.1.

Рис. 4.1 - Схема установки лазерного фотолиза.Ф1 - Ф4 - фильтры; Л1 и Л2 - линзы; М-р - монохроматор; Лм - источник зондирующего света; З1 и З2 - диэлектрические зеркала; К - исследуемый образец; ФС, ФЭ и ФП -фотоприемники синхронизации (запуска), измерения энергии лазерного импульса ифотоприемник регистрации исследуемого сигнала; БПФП - блок питания фотоприемника регистрации исследуемого сигнала; БПЛм - блок питания источника зондирующего света; СБК - системный блок компьютера; МК - монитор компьютера [3]

Для измерения процессов длительностью 0.9 мкс и более в качестве источника светового импульса возбуждения использовалось излучение лазера на АИГ: Nd3+, работающего в режиме модуляции добротности, с частотой повторения импульсов 15 Гц. Длительность импульса составляла 12-15 нс. Излучение лазера с помощью системы зеркал З1 и З2 направляется в кюветное отделение К на исследуемый образец практически антипараллельно. Возбуждение объектов исследования производилось излучением второй гармоники (532 нм) с энергией в импульсе 200 мДж и первой гармоники (1064 нм) с энергией в импульсе 330 мДж.

4.3 Результаты и их интерпретация

В работе использовались раствор гемоглобина в буфере 40 мМ Tris-HClpH 8.13 двух различных концентраций: 2.25 мМ + 20% глицерол и такой же, разбавленный в 100 раз. Это проводилось для того, чтобы зарегистрировать слабоинтенсивную полосу оксигемоглобина в районе 900 нм, и чтобы при этом оптическая плотность на этом участке принимала значения, пригодные для анализа. Разбавленный раствор был необходим для получения адекватного спектра в видимом диапазоне.

Рис. 4.2 - Спектры поглощения оксигемоглобина с концентрациями 2 мМ и 20 мкМ в соответствующих спектральных диапазонах

Эти спектры нужны также для того, чтобы знать оптические плотности гемоглобина на длинах волн возбуждения: D532=0.2016 на длине волны 532 нм, D1064=0.2714на длине волны 1064 нм, что понадобиться в дальнейшем.

Для выбора частот регистрации обратимся к рис. 4.3 и 4.4.



Рис. 4.3 - Спектры поглощения окси- и дезоксигемоглобина с одинаковыми концентрациями в коэффициентах экстинции [9]

Рис. 4.4 - Разностный спектр поглощения окси- и дезоксигемоглобина с концентрациями в коэффициентах экстинции [9]

Как видно из рис. 4.4 наилучшими длинами волн для регистрации являются 436 нм для длины волны возбуждения 532 нм и 592 нм для 1064 нм с учётом, разумеется, поглощения на данных длинах волн образцов с разными концентрациями.

Итак, образец с концентрацией 2 мМ возбуждаем на 1064 нм, регистрируем кинетику на 592 нм, образец с концентрацией 20 мкМ возбуждаем на 532 нм, регистрируем кинетику на 436 нм.

Усреднённые результаты этих экспериментов приведены на рис. 4.5 и 4.6.

Рис. 4.5 - Кинетика изменения оптической плотности при возбуждении в 532 нм, длина волны регистрации 436 нм.

Рис. 4.6 - Кинетика изменения оптической плотности при возбуждении в 1064 нм, длина волны регистрации 592 нм.

Как видно по рис. 4.6 изменения оптической плотности не происходит, значит, в низколежащих CT-состояния диссоциация кислорода невозможна. Однако изменения оптической плотности может «прятаться» под уровнем шумов. Можно оценить максимальное изменение оптической плотности в этом случае как стандартное отклонение:

(7)

В этом случае можно определить квантовый выход диссоциации определяется по формуле:

(8)

где - разность коэффициентов экстинции на длине волны регистрации, - доля поглощенного образцом возбуждающего света, D на длине волны возбуждения,

V ? рабочий объем раствора,

N ? число квантов света, попадающих в объем V, l ? оптический путь.

Число квантов света вычисляется из формулы

(9)

где - мощность попадающего на образец излучения, - длительность импульса, ? постоянная Планка, -частота света.

Однако гораздо более удобно использовать относительную формулу из [10], в которой считается , а для значений остальных параметров st для эталона используются данные, полученные в эксперименте с возбуждением в 532 нм.

(10)

Из [10] также известно . С учётом разностей коэффициентов экстинции, приведенных на рис. 4.4, получается оценка: г?0.0006.

Время затухания кинетики на рис. 4.5 можно оценить по формуле

(11)

Этот процесс характеризует бимолекулярную реакцию повторного связывания при отщеплении от гемоглобина одной молекулы O2 и является аппроксимацией кинетики на рис. 4.5. После нахождения по графикам, подобным на рис. 4.7, среднего значения и стандартной погрешности получается

.

Это характеризует скорость бимолекулярной реакции связывания кислорода гемоглобином.



Рис. 4.7 - Кинетика изменения оптической плотности при возбуждении в 532 нм (длина волны регистрации 436 нм) и её аппроксимация



Заключение

В работе был оценен квантовый выход при возбуждении в 1064 нм. Он оказался г?0.0006. Это позволяет утверждать, что при таком возбуждении диссоциация кислорода скорее всего не происходит. Значит, скорее всего, низколежащие CT состояния не являются диссоциирующими. В работе [1] величина г оказалась меньше 0.001. Точность моего эксперимента не позволила на порядок повысить точность оценки, однако её достоверность больше из-за практически полного устранения случайных артефактов из эксперимента

Также в работе была вычислена скорость повторного связывания кислорода при возбуждении в 532 нм: .

Дальнейшие исследования предполагают изучение других электронных состояний на предмет диссоциации и сущность связи Fe(II)-O2.



Литература

гемоглобин молекулярный порфирин химический

1. Джагаров Б. М., Дылько П. Н., Гуринович Г. П. // Доклады АН СССР. 1984. Т. 275.

2. Лепешкевич С. В., Джагаров Б. М. / Успехи химии порфиринов. Т. 5 / Под ред. О.А. Голубчикова. СПб: Изд-во НИИ Химии СПбГУ, 2007. С. 215 - 335.

3. Лепешкевич С. В. Кинетика оксигенации б и в субъединиц в составе гемоглобина человека. Дис. … канд. физ.-мат. наук. Минск,2006.119 с.

4. Джагаров Б. М., Чирвоный В. С., Гуринович Г. П. / В: Лазерная пикосекундная спектроскопия и фотохимия биомолекул /Под ред. В.С. Летохова. Москва: Наука, 1987. С. 181 - 212.

5. Kasper P. Jensen, Ulf Ryde // Biochemistry. 2004. V. 279. No. 15. P. 14561 - 14569.

6. Sergei V. Lepeshkevich, Alexander S. Stasheuski, Marina V. Parkhats, Victor A. Galievsky, Boris M. Dzhagarov// J. Photochem. Photobiol. B: Biol. V. 87 (2007). P. 130 - 141.

7. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия: В 3-х т. Т. 3. Пер. с англ. - М.: Мир, 1985. - 536 с.

8. Летохов В. С. / В: Лазерная пикосекундная спектроскопия и фотохимия биомолекул /Под ред. В. С. Летохова. Москва: Наука, 1987. С. 5 - 46.

9. Prahl S. Optical Absorption of Hemoglobin. Oregon, 1999. P. 13.

10. Sergei V. Lepeshkevich, Syargey N. Gilevich, Marina V. Parkhats, Boris M. Dzhagarov// BBA. 2016. V. 1864. P. 1110 - 1121.

Размещено на Allbest.ru

...