В поисках идеального антиоксиданта: моделирование точечных мутаций в пероксиредоксине 6 человека

В наибольшей степени пероксиредоксин 6 представлен в эпителиальных тканях, где он играет важную роль в их антиоксидантной защите [11,12]. Защитная функции Prx6 проявляется и при различных патологиях лёгких, глаз, кожи и нервной системы [13-15]. Наиболее перспективным является использование пероксиредоксина в терапии заболеваний, патологические процессы которых связаны с оксидативным стрессом. Терапевтическое применение для лечения ран и химических ожогов дыхательный путей было показана на примере крыс В.И. Новосёловым [12,16]. В настоящее время рассматривается перспектива применения пероксиредоксина в качестве радиопротектора [17,18].

В данной работе целью было более подробное изучение взаимодействия Prx6 с лигандами-восстановителями, определение аминокислотных остатков, вносящих наибольший вклад в это взаимодействие и анализ влияния аминокислотных замен на стабильность белка.

Материалы и методы

Исследуемые молекулы

Показано, что наиболее активными восстановителями для данного белка могут являться тио - ловые соединения: капторил и короткий цистеинсодержащий пептид ЕСЕСЕ. Для них выявлены два сайта связывания - типичный, образованный АК остатками Arg41, Ile73, Asp74, Ser75, Arg106, Asn107, Arg108, Lys122, Asp123, Glu124, Lys125, и атипичный, расположенный ближе к N-концевому участку молекулы и образованный Ala16, Asn17, Arg22, Asp104, Asp105, Arg106, Asn107. Данное разделение сайтов было основано на частоте связывания лигандов в каждом из них - типичный выступал наиболее вероятным сайтом связывания для большинства лигандов, а для молекулы сук - цимера наибольшее сродство было показано к новому атипичному сайту [19].

Для гибкого молекулярного докинга использовались 7 молекул: 4 тиоловых соединения - ци - стамин, каптоприл, сукцимер, унитиол (рис. 2) и 3 цистеин-содержащих пептида - ECECE, KCKCK и CCCCC. Выбор таких лигандов обусловлен тем, что тиоловые соединения активно применяются в медицине - в качестве антиоксидантов (в том числе в спортивной медицине). Выбранные молекулы входят в регистр лекарственных средств России (https://www.rlsnet.ru/) и применяются как антидоты при отравлениях тяжёлыми металлами, ртутью, мышьяком, в качестве радиопротекторов, для коррекции артериального давления и кардио - протективного действия.

Пептиды с цистеином были выбраны как потенциальные биогенные доноры протонов - для проверки гипотезы о том, как влияют АК остатки цистеина эндогенного происхождения на связывание с исследуемым белком, а также влияние микроокружения на это связывание - положительно заряженных АК остатков (КСКСК), отрицательно (ЕСЕСЕ) и полностью нейтральной молекулы (ССССС).

Рис. 2. Структурные формулы тиоловых лигандов

ецептор - белок пероксиредоксин 6 человека и его мутантные формы (7 мутантов полного сайта связывания и 18 мутантов с точечными заменами). Мутанты полного сайта связывания были получены путём замены всех аминокислотных остаков, участвующих в связывании того или иного лиганда на аланин с целью подтвердить гипотезу о том, что при «выключении» сайта связывания соответствующий ему лиганд перестанет связываться в этом месте.

1. Мутант для сайта связывания унитиола (Arg41, Ile73, Asp74, Arg106, Arg108, Glu124, Lys125);

2. Цистамина (Ile73, Asp74, Arg106, Asn107, Arg108, Glu121, Asp123, Gly124, Lys125);

3. Каптоприла (Arg41, Ile73, Asp74, Arg106, Asn107, Arg108, Glu121, Glu124, Lys125);

4. Сукцимера в атипичном сайте (Ala16, Asn17, Arg22, Asp104, Asp105, Arg106, Asn107);

5. Сукцимера в типичном сайте (Arg41, Ile73, Asp74, Arg108, Asp123, Glu124, Lys125);

6. Пептида ЕСЕСЕ (Arg41, Ile73, Asp74, Ser75, Arg106, Asn107, Arg108, Glu121, Lys122, Asp123, Glu124, Lys125);

7. Пептида КСКСК (Arg41, Asp42, Phe43, Ile73,

Asp74, Asp78, Arg106, Asn107, Arg108, Glu121,

Lys122, Glu124, Lys125).

Для аланинового скрининга, т.е. последовательной замены каждого из 18 аминокислотных остатков, участвующих в связывании лигандов, на аланин нами были созданы мутанты по следующим остаткам - Arg22, Arg41, Arg106, Arg108, Asn17, Asn107, Asp42, Asp74, Asp105, Asp123, Glu121, Glu124, Ile73, Lys122, Lys125, Phe43 и Ser75.

Для дополнительной оценки влияния мутаций на расчётную стабильность белка нами был воспроизведён ещё один, наиболее термостабильный, мутант (V10E+N107D+I165D+D183K) созданный в нашей лаборатории на основе крысиного Prx6. Фермент из организма крысы Rattus rattus является самым термостабильным из известных пероксиредоксинов и отличается высокой степенью гомологии с человеческим белком - в них отличаются только 19 остатков из 204. Анализ пространственной локализации этих остатков, отличающих два белка, выявил всего четыре остатка, замена которых удовлетворяет критериям концепции альтернативного водородного связывания. Согласно этой концепции при увеличении количества водородных связей на поверхности глобулы повышается её жёсткость и, следовательно, термостабильность [20].

Программные пакеты

Модели тиоловых лигандов были построены в молекулярном конструкторе HyperChem 8.0.10 (http://www.hyper.com/), затем их геометрия была оптимизирована с помощью MM+ и для уточнения структуры и расстановки зарядов - с помощью PM3.

Пространственная структура Prx6 была взята нами из RCSB Protein Data Bank (https://www. rcsb.org/). Точечные мутации в модель исследуемый белок мы вносили с помощью программного пакета SwissPDB (https://spdbv.vital-it.ch/). Таким образом, был получен набор структур, каждая из которых была рассмотрена нами как мишень для молекулярного докинга.

Для задания углов свободного торсионного вращения лигандов нами был использован пакет Autodock tools (http://autodock.scripps.edu/ resources/adt), в котором также была определена «коробка докинга» для белка. Докинг осуществлялся в Autodock Vina (http://vina.scripps.edu) в пяти повторностях - с целью повышения точности и воспроизводимости результатов (для снижения влияния фактора «random seed» - случайного выбора программой первого положения лиганда на рецепторе и конформации самого лиганда).

Анализ связывания лиганд-рецептор был произведён первично в Autodock tools (выявление сайта связывания на поверхности белка - типичный / атипичный / ошибочный), затем в пакете LigPlot+ с построением развёрток, наглядно демонстрирующих межмолекулярные взаимодействия (гидрофобные и путём образования водородных связей), а также длины образовавшихся водородных связей.

Расчёт динамического поведения проводили в распараллеленном на GPU пакете GROMACS «OpenMM Zephyr» (https://simtk.org/projects/ zephyr), время симуляции составило 10000 пс (10 нс), шаг - 0.002 пс при температуре 300К с учётом растворителя в неявном виде (через диэлектрическую проницаемость), в силовом поле AMBER96. Анализ полученной траектории в формате GROMACS проводили с помощью VMD (http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/). В рамках обработки полученных траекторий молекулярной динамики нами были построены графики изменения величины среднеквадратичного отклонения (RMSD) координат атомов белка от первоначальной структуры с течением времени, которые дают наглядное представление об изменении структуры белка во время молекулярной динамики нативной и мутантных форм изучаемого белка - перок - сиредосина 6 человека.

Для более полного изучения свойств электронной структуры лигнадов мы провели квантово-химические расчёты с использованием параметризации PM7, реализованной в пакете MOPAC2016 (Molecular Orbital PACkage) (http://openmopac.net/) для определения локализации и энергий HOMO/ LUMO (высшая занятая молекулярная орбиталь, низшая свободная молекулярная орбиталь), также величины GAP - «щели» между HOMO и LUMO. Значение (величина) GAP предположительно влияет на способность лигандов верно узнавать типичный / атипичный сайт и связываться с ними. Стоит отметить, что расчёт в MOPAC2016 проводился с использованием ключей, которые запрещали использование молекулярно-механических приближений в расчете, устанавливали градиент сходимости в 0,01 ккал / моль / ангстрем, а значение критерия ССП заменяли на 1*10-12. Визуализация полученных результатов была выполнена в HyperChem 8.0.10.

Обсуждение результатов

После проведения докинга с мутантами для всех сайтов связывания выдвинутая нами гипотеза о том, что при «выключении» сайта связывания для каждого лигнада он перестанет там связываться, в целом подтвердилась - большинство мутантов перестали связывать свои лиганды в прежних сайтах связывания, характерных для нативного белка. Мутанты для каптоприла и унитиола полностью перестали связывать свои лиганды, а аф - финость по сравнению с нативным белком также упала с -5.56 до -4.56 ккал / моль для каптоприла и с -3.12 до -2.9 для унтиола. Созданные нами мутанты для сукцимера также подтвердили гипотезу - мутант с заменой всех аминокислотных остатков (АО) типичного сайта связывал сукцимер только в атипичном с энергией -4.42 ккал / моль, а с заменой всех АО атипичного сайта - только в типичном с энергией -4.40. Полученные значения аффиности для этих мутантов не так значительно отличаются от нативного белка (-4.48), что также подтверждает выдвинутое предположение.

Мутант для цистамина не перестал связывать свой лиганд в типичном сайте и в непосредственной его близости, однако энергия этого связывания уменьшилась с -3.12 до -2.9 ккал / моль. Для пептидов мы наблюдали сходную ситуацию. ЕСЕСЕ продолжал связываться в типичном сайте, но реже. Лизин-цистеиновый пептид КСКСК не только продолжил связываться в том же сайте, но и частота такого связывания увеличилась, а энергия почти не изменилась (-5.42 ккал / моль).

Для анализа результатов аланинового скрининга 18 мутантов были разделены на 4 группы по природе боковой группы аминокислот, по которым были произведены мутации - замены неполярных (F3A, I73A), полярных (N17A, N107A, S75A), отрицательно (D42A, D74A, D104A, D105A, D123A, E121A, E124A) и положительно (K122A, K125A, R22A, R41A, R106A, R108A) заряженных остатков (см. Табл. 2).

При внесении мутаций не было отмечено резкой смены сайта связывания лигандов, однако, мутации, затрагивающие полярные остатки, позитивно влияя на связывание, тем не менее оказывали доказанное дестабилизирующее влияние на трёхмерную укладку и термостабильность белка [21]. Замены неполярных АО не привели к изменению сайтов связывания и аффинности для всех лигандов. При замене полярных незаряженных АО были отмечены незначительные изменения в энергиях связывания.

Из всего набора лигандов для цистамина не были отмечены какие-либо изменения в связывании с белком. Сукцимер продемонстрировал нечувствительность к аланиновому скринингу - молекула лиганда все также связывалась в двух сайтах (типичном и атипичном), предпочтительнее был атипичный. С мутантом R22A сукцимер резко потерял сродство к атипичному сайту, предположительно, именно этот остаток отвечает за связывание сукцимера с атипичным сайтом.

Каптоприл менее активно связывали мутанты K125A и R41A. Для этих же мутантов было отмечено и снижение по модулю энергии связывания с каптоприлом: -5 и -4.9 ккал / моль по сравнению с -5.56 ккал\моль для нативного белка. Было выдвинуто предположение, что эти остатки и вносят наибольший вклад в лиганд-белковое взаимодействие, для его доказательства был проведен расчёт докинга для двойного мутанта. Полученные результаты подтвердили гипотезу: аффинность понизилась до -4.8 ккал / моль.

Подобная картина наблюдалась и для унити - ола: данный лиганд слабее связывался с мутантами R41A и E121A. Пептиды, помимо изменений в предпочтительных местах связывания, демонстрировали весьма сильное взаимодействие с мутантами D104A и R106A (аффиность для этих мутантов не значительно отличалась от нативного белка, а в некоторых случаях даже была выше, см. Табл. 2). Эти модифицированные формы пе - роксиредоксина связывали тиоловые соединения в виде «перекидывания» их молекулярного остова через обе бороздки связывания (типичный и атипичный сайты). На рис. 3 приведён пример такого «необычного» связывания (мутант R106A, лиганд - ЕСЕСЕ). Полицистеиновый пептид в расчётах показал более эффективное связывание с мутантами, чем с нативным белком.

Таким образом, можно отметить, что наибольшее влияние на связывание лиганда с белком оказывают замены заряженных АО (аргинина, лизина, аспартата и глутамата). Модифицированные таким образом мишени для докинга демонстрируют как понижение, так и повышение сродства лигандов к белку.

Поскольку вносимые мутации расположены в периферическом слое глобулы, с высокой вероятностью они окажут влияние на динамическое поведение макромолекулы. Кроме того, данные мутации затрагивают заряженные аминокислотные остатки, что влияет на картину водородного связывания на поверхности глобулы, определяющего

термостабильность белка [20,22]. В работе было рассчитано динамическое поведение для мутантов всех участков связывания (где все АО, участвующие во взаимодействии с лиганлами были заменены на аланин) и нескольких (R106A, R108A, R106A+R108A, V10E+N107D+I165D+D183K) мутантов с точечными заменами.

Рис. 3. Пример «необычного» связывания пептидов, мутант R106A, лиганд ЕСЕСЕ - связывание лиганда путём «перекидывания» их молекулярного остова через обе бороздки связывания

В первом случае было отмечено как существенное, так и малое влияние замен на динамическое поведение структуры белка по причине разного набора остатков, по которым пероксиредоксин связывается с каждым из тиоловых и пептидных лигандов (Рис.4). Мутанты сайта связывания унитиола и типичного сайта связывания сукцимера отличались лишь на один остаток - Arg106. Его сохранение привело к снижению общей подвижности молекулы (по RMSD), и в итоге расчётная ожидаемая термостабильность белка не отличалась от нативного пероксиредоксина. Остальные мутации значительно усиливали подвижность структуры.

Влияние аргинина на динамическое поведение белка потребовало дополнительного изучения. Были проведены расчёты теоретической термостабильности для мутантов с заменами (Рис.5) - R106A, R108A, R106A+R108A и V10E+N107D+I165D+D183K. Остаток Arg108 является первым в четвертой а-спирали и важен для её формирования, что может значительно повлиять на макроструктуру белка, однако он находится рядом с Arg106 и также участвует в связывании лигандов. Подобную замену было интересно внести с целью рассмотреть влияние близко расположенных остатков на стабильность глобулы. Четверной мутант, созданный на основе крысиного Prx6, был использован в расчётах для сравнительного анализа полученных данных по динамическому поведению молекул. Полученные результаты показали, что замена ARG106 делает молекулу стабильнее и почти выводит расчетную термостабильность на один уровень с мутантом V10E+N107D+I165D+D183K.

Рис. 4. Среднеквадратичное отклонение координат атомов белка от первоначальной структуры с течением времени для мутантов всех участков связывания. Расчеты проведены для температуре (300К). Траектория: 1 - нативного белка Prx6; 2-8 для мутантов полного сайта связывания для каждого лиганда: 2 - унитиола, 3 - цистамина, 4 каптоприла, 5 - петида есесе, 6 - сукцимера в атипичном сайте, 7 - петида кскск и 8 - сукцимера в типичном сайте.

Время симуляции, ПС

Рис. 5. Среднеквадратичное отклонение координат атомов белка от первоначальной структуры с течением времени для мутантов. Расчеты проведены для постоянной температуры (300К). Траектории: 1 - нативный Prx6; 2 - R106A; 3 - V10E+N107D+I165D+D183K; 4 - R108A; 5 - R106A+R108A.

Проводя сравнительный анализ результатов проведённых расчётов докинга, нами была отмечена как низкая чувствительность к вносимым заменам, так и её отсутствие для некоторых лигандов (например, для цистамина). Мы предположили, что между эффективностью связывания и разницей HOMO-LUMO возможна корреляция: чем меньше GAP, тем лучше (с большей энергией, в типичном / атипичном сайте) такой лиганд связывается на поверхности белка-мишени. Это основано на том, что при уменьшении GAP облегчается способность электронов с орбитали HOMO переходить на LUMO и образовывать межмолекулярные связи. Для всех лигандов и HOMO, и LUMO локализованы на атомах серы, что подтверждает их нуклеофильность. Однако, наименьшее значение GAP было показано для ССССС и цистамина (-7.505 и -7.927), что по-видимому объясняет их низкое связывание в типичном или атипичном сайтах, а также изменяет смысл предложенной нами корреляции - чем меньше GAP, тем с большей вероятностью такой лиганд будет связываться хаотично на поверхности белка-мишени.