Применение полиэтиленгликоля и Pluronic F-68 в качестве компонента бессывороточной среды для культивирования клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)

Применение полиэтиленгликоля и Pluronic F-68 в качестве компонента бессывороточной среды для культивирования клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH

Гусева Марина Николаевна,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Доронин Максим Игоревич,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

Михалишин Дмитрий Валерьевич,

кандидат ветеринарных наук, заведующий лабораторией профилактики ящура

Шевченко Максим Александрович,

ведущий ветеринарный врач

Манин Борис Леонидович,

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник отдела инноваций

Аннотация

В статье приводятся результаты исследований различных концентраций полимеров (ПЭГ 6000, ПЭГ 8000, Pluronic F-68) для определения возможности их использования в качестве добавок к бессывороточным питательным средам, которые бы не оказывали токсического влияния на клетки линии ВНК-21 и обеспечивали бы достаточную вязкость для снижения влияния механического стресса. Присутствие ПЭГ 6000 и ПЭГ 8000 влияло на жизнедеятельность живой клетки ВНК-21. Данные вещества приводили к изменению морфологии: появлялись дегидратационные выросты, в цитоплазме некоторых клеток наблюдали небольшие включения, это явление приводило к уменьшению кратности прироста клеточной популяции. При наличии Pluronic F-68 дегидрационные выросты не наблюдались, форма клетки была сферической, а цитоплазма прозрачной и гомогенной. Прирост клеточной популяции в присутствии Pluronic F-68 в концентрации 0,063 и 0,130% был выше в 1,2-1,4 раза, чем при других концентрациях полимеров, и выше в 1,4 раза, чем в контроле с фетальной сывороткой КРС. При исследовании кинематической вязкости питательных сред с различными полимерами в качестве добавок определили, что вязкость в присутствии ПЭГ 6000 и Pluronic F-68 увеличивалась с повышением содержания вещества в растворе. В растворах с наличием Pluronic F-68 кинематическая вязкость варьировала от 2,65 до 2,80 мм²/с в зависимости от концентрации полимера. Кинематическая вязкость в растворах с ПЭГ 8000 находилась в пределах 2,74-2,77 мм²/с. Для создания необходимых условий для жизнедеятельности клеток наиболее приемлемым в качестве добавки в бессывороточных средах являлся Pluronic F-68 с концентрациями 0,063-0,130%.

Ключевые слова: суспензия клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, бессывороточные среды, кратность прироста клеток, ПЭГ 6000, ПЭГ 8000, Pluronic F-68

Abstract

Use of polyethylene glycol and Pluronic f-68 as a component of serum-free media for ВНК-21/SUSP/ARRIAH cell culture

FGBI «Federal Centre for Animal Health» (FGBI «ARRIAH»)

Guseva Marina Nikolaevna, PhD of Biological Sciences, Senior Researcher.

Doronin Maksim Igorevich, PhD of Biological Sciences, Senior Researcher.

Mikhalishin Dmitry Valerjevich, PhD of Veterinary Sciences, Head of Laboratory for FMD Prevention.

Shevchenko Maksim Aleksandrovich, Leading Veterinarian.

Manin Boris Leonidovich, PhD of Biological Sciences, Leading Researcher of Department for Innovations.

The paper describes the results of different polymer (PEG 6000, PEG 8000, Pluronic F-68) concentration tests, performed to establish the potential of their use as additives to serum-free nutrient media, their non-toxicity for BHK-21 cells and ability to provide sufficient viscosity, thus decreasing mechanical stress effect. PEG 6000 and PEG 8000 influenced the vital activity of ВНК-21 live cells. These substances changed the morphology: dehydration-evoked protuberances appeared, small inclusions were observed in the cytoplasm of some cells and these events lead to decrease in cell growth ratio. If Pluronic F-68 was present, no dehydration-evoked protuberances were observed, cell shape was spherical and the cytoplasm remained transparent and homogenous. Cell growth in the presence of Pluronic F-68 at the concentrations of 0.063 and 0.130% was 1.2-1.4 times higher, if compared to other polymer concentrations and 1.4 higher if compared to control, containing bovine fetal serum. When testing kinematic viscosity of different nutrient media, supplemented with various polymers, it was established that viscosity in the presence of PEG 6000 and Pluronic F-68 increased as the concentration of the substances in the solution became higher. Solutions containing Pluronic F-68 showed kinematic viscosity, varying from 2.65 to 2.80 mm²/s, depending on the polymer concentration. Kinematic viscosity of solutions, supplemented with PEG 8000 was within 2.74-2.77 mm²/s. To create conditions, necessary for cell vital activity, the most reasonable substance to be added to serum-free media was Pluronic F-68 at the concentrations of 0,063-0.130%.

Key words: ВНК-21/SUSP/ARRIAH cell suspension, serum-free media, cell growth ratio, PEG 6000, PEG 8000, Pluronic F-68

Введение

Клеточная среда - самый важный компонент, в котором находятся клетки. Среда предоставляет питательные вещества, факторы роста и гормоны, регулирует водородный показатель рН и осмотическое давление в клетке. Одним из важных компонентов питательной среды является сыворотка крови. К главным функциям сыворотки относятся: обеспечение гормональными факторами, стимулирующими рост клеток и их функции; обеспечение факторами адгезии и седиментации клеток; обеспечение транспортными белками, переносящими ферменты, минеральные вещества, липиды и т.д. [3]. Сыворотка крови обладает защитным действием, которое связано с изменением прочности мембраны, что связано с облегчением переноса через мембрану хлорестирола или аналогичных веществ клеточной стенки, и таким образом, понижает влияние гидродинамического напряжения сдвига. С другой стороны, возможно, что при образовании устойчивой пены, которая не контактирует с клетками, также происходит защита от гидродинамического воздействия. Третьим возможным механизмом защитного действия является то, что величина гидродинамической силы изменяется при действии сыворотки крови посредством увеличения вязкости. Так как влияние сыворотки на вязкость питательной среды незначительно, увеличение вязкости может быть одним из механизмов защиты. Физиологический механизм может включать собственно изменения в клеточном скелете, плазматической мембране или других клеточных частях и органеллах [2]. По данным И.С. Трухана (2018), сыворотка крови, повышая вязкость среды, защищает культуру от механических повреждений при перемещении или пипетировании, увеличивает буферную емкость среды, а протеазы обеспечивают защиту клеток от лизиса [7].

В последние годы внимание привлекают среды без содержания сыворотки. Они имеют определенные преимущества: улучшение воспроизводимости результатов опыта вследствие большей стабильности состава среды; снижение риска заражения культуры вирусами, грибами, микоплазмами; облегчение очистки продуктов клеточного метаболизма; снижение влияния дополнительных белков на результаты биологических исследований; отсутствие цитотоксического влияния, которое может оказывать сыворотка [3, 8]. Однако вопрос защиты клетки от гидродинамического воздействия при перемешивании зачастую остается открытым.

Любые повреждения клеток, которые происходят в условиях перемешивания клеточной суспензии или при диссоциировании клеток после трипсинизации, могут быть снижены при повышении вязкости среды с помощью различных полимеров [4]. За счет повышения вязкости уменьшается влияние механического стресса на клетки. Это становится особенно важным при низкой концентрации сыворотки, при ее отсутствии и для клеток, культивируемых в биореакторах с перемешиванием. В этих случаях часто используется Pluronic F-68, хотя его эффект, по-видимому, является многофакторным [6].

Соединения группы Pluronic представляют собой блок-сополимеры полиоксиэтилена и полиоксипропилена. Различное сродство к воде полиоксипропиленовой (гидрофобной) и полиоксиэтиленовых (более гидрофильных) частей молекулы придает Pluronic в водном растворе свойства поверхностно-активных веществ (ПАВ) [9].

Полимеры Pluronic находят широкое применение в медицине и фармакологии. Обладая очень низкой токсичностью по сравнению с другими ПАВ, Pluronic входят в состав композиций искусственных заменителей крови и выполняют роль стабилизаторов перфторуглеродных эмульсий.

Pluronic F-68 представляет собой вещество с молекулярной массой приблизительно 8000, содержащее гидрофильную и гидрофобную группы [9].

К полимерным соединения, которые часто применяют в фармацевтической продукции относится полиэтиленгликоль (ПЭГ). В предыдущих исследованиях анализировали его влияние на клетки ВНК-21 в присутствии сыворотки КРС [5], но среди опубликованных научных данных практически не встречаются сведения о влиянии данного полимера непосредственно на клетки ВНК-21 без сыворотки в качестве защитного компонента. С увеличением молекулярной массы взаимодействие ПЭГ с молекулами растворителястановится более интенсивным, но ослабевает с ростом температуры. Для ПЭГ с большим числом оксиэтильных групп увеличение температуры влияет в основном на подвижность молекул и в меньшей степени на интенсивность взаимодействия ПЭГ с водой (с увеличением молекулярной массы вязкость увеличивается) [10].

Цель исследования заключалась в изучении возможности применения полимерных соединений Pluronic F-68, ПЭГ 6000 и ПЭГ 8000 в составе бессывороточных сред для выращивания клеток линии ВНК-21/SUSP/ ARRIAH без цитотоксического влияния и с обеспечением достаточной вязкости для снижения влияния механического стресса на клетки.

Материалы и методы

Клеточная линия. В работе применяли перевиваемую суспензионную клеточную линию из почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH.

Добавки. В качестве добавок использовали ПЭГ 6000, ПЭГ 8000, Pluronic F-68 в конечных концентрациях 0,13; 0,25; 0,50, 1,00%.

Питательная среда для выращивания клеток, изготовленная согласно «Промышленному регламенту на производство вакцины против ящура различных типов» без сыворотки и с добавлением 0,25% гидролизата белков крови (ГБК).

Кратность прироста (КП) оценивали путем определения прироста клеток за 48 ч (отношение конечной концентрации клеток и исходной в пределах одного пассажа).

Контроль. В качестве контроля использовали образцы:

- c добавлением к питательной среде только фетальной сыворотки КРС фирмы SERANA в концентрации 5%;

- с добавлением к среде только 0,25% ГБК;

- с добавлением к питательной среде и фетальной сыворотки КРС фирмы SERANA в концентрации 5% и 0,25% ГБК.

Определение вязкости. Кинематическую вязкость определяли с помощью вискозиметра по ГФ РФ, ОФС.1.2.1.0015.15 [1].

Статистическая обработка данных. Все исследования проводили на протяжении 5 пассажей в трех повторностях. Цифровой материал статистически обрабатывали на персональном компьютере общепринятыми методами вариационной статистики с использованием программы Microsoft Excel.

Результаты исследований и обсуждение

При исследовании в качестве добавки ПЭГ 6000 (рис. 1) определили, что после 1 пассажа кратность прироста составляла 2,37-2,03-2,20-1,73 при разных концентрациях ПЭГ 6000 (0,13; 0,25; 0,50; 1,00%). На втором пассаже КП увеличивалась в 1,40; 2,00; 1,50; 1,73 раза в зависимости от концентрации полимера, соответственно. В 3 пассаже кратность прироста или оставалась прежней, или начинала уменьшаться. На 4 пассаже КП уменьшалась в 1,1-1,6 раз, а к 5 пассажу она была в 2,13; 1,97; 2,07; 1,50 раз ниже в зависимости от концентрации ПЭГ 6000 по сравнению с данными для 1 пассажа. Кратность прироста в контрольном образце с фетальной сывороткой КРС на протяжении 4 пассажей была ниже в 1,1-2,0 раз в зависимости от пассажа, однако в 5 пассаже кратность прироста была практически идентичной опытным образцам. Вероятно, это было связано с агрегирующим и нейтрализующим свойством ПЭГ [9].

При использовании в качестве добавки ПЭГ 8000 (рис. 2) выявили, что на 1 пассаже кратность прироста клеток ВНК-21/SUSP/ ARRIAH находилась в пределах 2,2-1,931,83-1,87 при разных концентрациях ПЭГ 8000, что тождественно КП линии клеток, выросших в присутствии ПЭГ 6000. На втором пассаже кратность прироста увеличивалась в 1,5-1,9-1,7-1,9 раз в зависимости от концентрации добавки. На 3 пассаже при концентрации полимера 0,50%, КП выросла в 1,2 раза, в других концентрациях прирост клеток стал уменьшаться. В следующих пассажах кратность прироста оставалась прежней, к 5 пассажу она составляла 2,06-2,272,0-2,37 в зависимости от концентрации ПЭГ 8000. Кратность прироста в контрольном образце с фетальной сывороткой КРС на протяжении 4 пассажей была ниже в 1,2-2,1 раз в зависимости от пассажа, однако в 5 пассаже кратность прироста была практически идентичной опытным образцам, как и в предыдущем опыте с ПЭГ 6000.

На следующем этапе работы проводили исследование влияния Pluronic F-68 на кратность прироста клеточной линии ВНК-21/ SUSP/ARRIAH. При концентрации вещества 1% клетки погибали на втором пассаже, поэтому было принято решение уменьшить концентрацию Pluronic F-68 (до 0,015 и 0,063%). Результаты исследований представлены на рисунке 3. Из данных, представленных на этом рисунке, видно, что после 1 пассажа КП клеток BHK-21SUSP/ARRIAH была в пределах 3,03-3,2-2,8-2,2 при разных концентрациях Pluronic F-68, что было выше в 1,2-1,4 раз КП клеток, выросших в присутствии ПЭГ 6000 (1,73-2,37) и ПЭГ 8000 (1,87-2,2). На втором пассаже кратность прироста увеличивалась в 1,01-1,20-1,30-1,30 раза в зависимости от концентрации добавки. На 3 пассаже наблюдали снижение кратности прироста при всех концентрациях Pluronic F-68 в 1,3-2,0 раз. В последующих пассажах КП при концентрациях Pluronic F-68 0,063 и 0,130% была выше, чем при других концентрациях, в 1,30 и 1,85 в 4 пассаже и в 1,50 и 1,89 раз в 5 пассаже, соответственно.

Кратность прироста в контрольном образце с фетальной сывороткой КРС была ниже КП в суспензии в присутствии Pluronic F-68 в концентрации 0,063 и 0,130% в 1,1-2,0 раз в зависимости от пассажа.

При анализе кратности прироста в пяти пассажах было установлено, что при концентрации Pluronic F-68 0,063 и 0,130% клетки росли интенсивнее в 1,2-1,4 раза, чем при других концентрациях полимеров, и выше в

1,4 раза, чем в контроле с фетальной сывороткой КРС (рис. 4).

В присутствии ПЭГ 6000 и ПЭГ 8000 происходила седиментация клеток без адгезии (рис. 5 А, Б), у многих клеток наблюдались дегидратационные выросты, что говорило о возможном дефиците водного баланса в самой клетке. В цитоплазме некоторых клеток наблюдали небольшие включения. С повышением концентрации ПЭГ до 1% количество дегидрационных выростов увеличивалось. В присутствии Pluronic F-68 (рис. 5 В) деги - драционные выросты не наблюдались, форма клетки была сферическоИ, а цитоплазма - прозрачной и гомогенноИ. В суспензии отмечали одиночные округлые клетки с небольшим количеством конгламератов, содержащих от 3 до 5 клеток. В монослое клетки проявляли адгезированные свойства.

В контрольных образцах все клетки (рис. 5 Г) имели фибробластоподобную форму, морфология была стандартной для культуры ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Клетки седи - ментировались, часть адгезировалась перед активным ростом и делением в монослойной культуре.

Рис. 1. Динамика изменения концентрации клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в зависимости от пассажа при использовании добавки ПЭГ 6000

Рис. 2. Динамика изменений концентрации клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в зависимости от пассажа при использовании добавки ПЭГ 8000

Рис. 3. Динамика изменении концентрации клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в зависимости от пассажа при использовании добавки Pluronic F-68

Рис. 4. Динамика изменения концентрации клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в пяти пассажах в зависимости от концентрации различных полимеров

Рис. 5. Клетки ВНК-21/SUSP/ARRIAH, выросшие в присутствии ПЭГ 6000 (А), ПЭГ 8000 (Б), Pluronic F-68 (В); в присутствии 5% сыворотки КРС (контроль) (Г)

Рис. 6. Кинематическая вязкость питательных сред с различными добавками

полимер бессывороточный полиэтиленгликоль

Известно, что на вязкость культуральной среды влияет главным образом содержание сыворотки и, в большинстве случаев, влияние вязкости на клеточный рост невелико. Вязкость становится важна при перемешивании клеточной суспензии, или когда клетки диссоциируют после трипсинизации. Любые повреждения клеток, которые происходят в этих условиях, могут быть снижены при повышении вязкости среды [6]. Это становится особенно важным при низкойконцентрации сыворотки, в отсутствие сыворотки и для клеток, культивируемых в биореакторах с перемешиванием.

Исходя из этого, проводили сравнение кинематической вязкости питательных сред с различными добавками. Результаты анализа продемонстрированы на рисунке 6. Определили, что вязкость среды в присутствии ПЭГ 6000 и Pluronic F-68 возрастала с повышением процентного содержания полимера в растворе. Так, при 0,13% ПЭГ 6000 вязкость была 2,56 мм²/с, а при 1,00% - 2,69 мм²/с. В растворах с наличием Pluronic F-68 кинематическая вязкость варьировала от 2,65 до 2,80 мм²/с в прямой зависимости от концентрации. Кинематическая вязкость в растворах с ПЭГ 8000 находилась в пределах 2,742,77 мм²/с. Вязкость в контрольном растворе с содержанием сыворотки и гидролизата белков крови составляла 2,75 мм²/с.

Заключение

Установили, что присутствие ПЭГ 6000 и ПЭГ 8000 влияло на жизнедеятельность живой клетки ВНК-21. Данные вещества приводили к изменению морфологии: появлялись деги - дратационные выросты, в цитоплазме некоторых клеток наблюдали небольшие включения. С повышением концентрации ПЭГ до 1% количество дегидрационных выростов увеличивалось, что говорило о возможном дефиците водного баланса в самой клетке. Все это приводило к уменьшению кратности прироста клеточной популяции.

Выявили, что в присутствии Pluronic F-68 дегидрационные выросты не наблюдались, форма клетки была сферической, а цитоплазма - прозрачной и гомогенной. В суспензии отмечали одиночные округлые клетки с небольшим количеством конгламератов, содержащих от 3 до 5 клеток. В монослое клетки проявляли адгезированные свойства. Прирост клеточной популяции в присутствии Pluronic F-68 в концентрации 0,063% и 0,13% был выше в 1,2-1,4 раза, чем при других концентрациях полимеров, и выше в 1,4 раза, чем в контроле с фетальной сывороткой КРС.

Определено, что вязкость питательной среды в присутствии ПЭГ 6000 и Pluronic F-68 увеличивалась с повышением процентного содержания полимера в растворе.

Доказано, что для создания необходимых условий для жизнедеятельности клеток наиболее приемлемым в качестве добавки в бес - сывороточных средах был Pluronic F-68 с концентрациями 0,063-0,130%.

Список литературы

1. Государственная фармакопея Российской Федерации. Вязкость. /URL: https://pharmacopoeia.ru/ofs-1 - 2-1-0015-15-vyazkost/ (Дата обращения: 10.04.2020).

2. Гунин М.А. Исследование жизнеспособности клеток животных при культивировании в биореакторах в суспензии и на микроносителях. / М.А. Гунин. Автореф. дисс…. к. биол. н. Щелково, 2000. 39 с.

3. Дьяконов Л.П. Животная клетка в культуре (Методы и применение биотехнологии). / Л.П. Дьяконов. М.: Компания Спутник+, 2009. 656 с.

4. Микроклетки. Химический состав и добавки сред. Вязкость. / URL: http://microcells.ru/ (Дата обращения: 10.04.2020).

5. Михалишин Д.В. Влияние полиэтиленгликоля на пролиферативную активность клеток ВНК-21/2 - 17 / Д.В. Михалишин, М.Н. Гусева, Е.В. Белик, В.В. Михалишин // Ветеринария и кормление. 2010. №6. С. 28-29.

6. Патент RU 2008 131 840 А Российская Федерация, МПК C12N 5/00 (2006.01) Способ суспензионного культивирования клеток человека и животных в бессывороточных средах и среда для его осуществления / В.В. Честков, Ю.В. Щепкина, В.Ю. Табаков; Общество с ограниченной ответственностью Научно-производственное предприятие «ПанЭко», №2008131840/13: заявл. 08.05.2008; опубл. 02.10.2010.

7. Трухан И.С. Питательная среда как ключевой фактор культивирования клеток млекопитающих / И.С. Тру - хан // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2018. №12-1. С. 165-172.

8. Фрешни Р Я. Культура животных клеток. Практическое руководство. / Р Я. Фрешни. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2011. 691 с.

9. Химическая энциклопедия. Т. 4. М: Большая Российская энцикл. 1995. 639 с.

10. Шуляк И.В. Реологические свойства водных растворов полиэтиленгликолей различной молекулярной массы / И.В. Шуляк, Е.И. Грушова, А.М. Семенченко // Журнал физической химии. 2011. Т. 85. №3. С. 485-488.

Размещено на Allbest.ru