Фракционный состав лейкоцитарного лизата и его биологические свойства

Размещено на http://www.allbest.ru/

Фракционный состав лейкоцитарного лизата и его биологические свойства

ФГБОУ ВО Пермский национальный исследовательский политехнический университет, Пермь

Представлены результаты цитолиза лейкоцитов крови человека под воздействием ультразвуковых волн. Определен состав лейкоцитарного лизата - низкомолекулярные соединения до 6,5 кДа составляют 16,8%, молекулы с весом от 29 до 75 кДа составляют большую часть - 69,7% и высокомолекулярные соединения с весом более 158 кДа - 13,5%. Проведена оценка биологических свойств полученного соединения. Доказано антимикробное действие лейкоцитарного лизата на грамположительные и грамотрицательные микроорганизмы. Противомикробная активность в отношении грамположительных бактерий в 9 раз выше, нежели в отношении грамотрицательных. В статье продемонстрированы результаты изучения противовирусной активности полученной субстанции. Доказано, что лейкоцитарный лизат обладает умеренным противовирусным действием от 85 до 165 МЕ. Литературные данные указывают, что продемонстрированной специфической активности достаточно для достижения терапевтического эффекта. Таким образом, разработанная нами технология цитолиза лейкоцитов крови человека позволяет получить субстанцию, обладающую антибактериальным и противовирусным действием, что крайне необходимо при создании новых комплексных терапевтических препаратов. Однако экспериментальные данные свидетельствуют о необходимости доработки технологии получения белкового лизата лейкоцитов с целью снижения количества высокомолекулярных соединений в его составе.

Ключевые слова: лейкоцитарныйлизат, антибактериальноедействие, противовируснаяактивность, ультразвуковыеволны, антбиотико резистентность, высокоэффективная жидкостная хроматография, низкомолекулярные пептиды.

FRACTIONAL COMPOSITION OF LEUKOCITARNY LIZATE AND ITS BIOLOGICAL PROPERTIES

The article presents the results of cytolysis of human blood leukocytes under the influence of ultrasonic waves. The composition of leukocyte lysate was determined: low molecular weight compounds up to 6.5 kDa make up 16.8%, molecules weighing from 29 to 75 kDa make up the majority of 69.7% and high molecular weight compounds weighing more than 158 kDa - 13.5%. The evaluation of the biological properties of the compounds obtained. The antimicrobial effect of leukocyte lysate on gram-positive and gram-negative microorganisms has been proven. Antimicrobial activity against gram-positive bacteria is 9 times higher than against gram-negative bacteria. The article shows the results of studying the antiviral activity of the obtained substance. It is proved that the leukocyte lysate has a moderate antiviral effect from 85 to 165 IU. Literature data indicate that the demonstrated specific activity is sufficient to achieve a therapeutic effect. Thus, the technology of human blood leukocyte cytolysis developed by us makes it possible to obtain a substance with antibacterial and antiviral effects, which is extremely necessary when creating new complex therapeutic drugs. However, experimental data indicate the need for refinement of the technology for obtaining the protein lysate of leukocytes, in order to reduce the amount of high-molecular compounds in its composition.

Keywords: leukocyte lysate, antibacterial action, antiviral activity, ultrasound waves, antibiotic resistance, high performance liquid chromatography, low molecular weight peptides.

Антибактериальныепрепараты с моментаихвнедрения в широкуюмедицинскую практику существенноповлияли на структуру заболеваемости и достоверноснизилилетальность от инфекционныхболезней. В 1960-1970-х гг. существовалопредположение, чтоприменениеантибактериальныхсредств в концеконцовприведет к значительномусокращениюслучаевосложнений и снижениюсмертности, связанных с инфекционнымизаболеваниями. Однако по мере появленияновыхклассовантибиотиковпостоянноразвиваются и новыемеханизмырезистентностимикроорганизмов [1]. По даннымэкспертов, в настоящеевремя на различныхстадияхисследований и разработок(Research &Development, R&D) находитсяоколо 200 антибактериальныхсредств. При этомбольшинствоизучаемыхантимикробныхпрепаратовдействуюттолько на грамположительныебактерии [2].

За последние 20 лет многиебольшиефармацевтическиекомпании, напримерPfizer, EliLillyandCompanyи Bristol-MyersSquibb, сократили число разработокилизакрылипроекты по созданиюновыхантибиотиков. Этообъясняется тем, что все большееколичествомикроорганизмовадаптируется к антимикробным препаратам [3]. В настоящеевремяимеетсяостраянеобходимость в новыхантибактериальных препаратах. Однако, несмотря на это, ситуация с введением в практику препаратовэтойгруппы год от годаухудшается - количествовводимых в практику антибиотиковпадает [4]. Возможнымрешениемэтойпроблемыможет стать поиск таких препаратов, к которым у бактерий не развиваетсямеханизмрезистентности.

Антимикробныепептиды (АМП), содержащиеся в нейтрофилахчеловека и животных, являютсяважными факторами системыврожденногоиммунитета, обеспечивающимипротивоинфекционнуюзащиту [5]. Изучениеантимикробныхпептидовразныхвидовживотных важно для развитияфундаментальных знаний о молекулярныхмеханизмахиммунныхреакций, а также для полученияинформации о новых структурах пептидов, которые в дальнейшеммогутбытьиспользованы в качестве моделей для созданияантибиотическихпрепаратов нового поколения. Этиновыелекарственныесредстваперспективны для решения проблем, связанных с устойчивостьюпатогенныхмикроорганизмов к применяемым в клиникеантибиотикам [6].

Клетки крови в разбавленныхсуспензияхвесьмачувствительны к ультразвуковому воздействию и начинаютразрушаться при интенсивности 0,3 Вт/см², совпадающей с порогом кавитации в воде. Для разрушенияклетокэффективеннизкочастотный ультразвук. Регулируяусловия ультразвукового воздействия - меняя частоту, мощность и время, можно получить конечный продукт с заданнымисвойствами [7].

Известно, чточеловеческиелейкоцитыобеспечиваютзащитунашегоорганизма от различныхинфекционныхагентов. Цельюданногоисследованияявляетсяполучениесубстанции, обладающейантимикробным и противовируснымдействиемпутемразрушениялейкоцитарныхклетокчеловека. Полученнаясубстанцияможет стать основой для созданияновыхлекарственныхпрепаратов широкого спектра действия.

Материалы и методыисследования

В качествеобъектаисследованиябылииспользованыдонорскиелейкоцитычеловека, проверенные на отсутствиегемотрансмиссивныхинфекций: HBsДgк вирусугепатита В, антитела к вирусугепатита С и ВИЧ, сифилиса. Для полученияпептидовизчеловеческихлейкоцитовосуществлялиультразвуковоевоздействие на клетки. Цитолизлейкоцитовосуществляли с использованием ультразвукового процессораUP50H (HelischerUltrasonics, Германия). Подвоздействиемультразвука на лейкоцитарнуюсуспензиюпроисходилоразрушениеклеток. Полученнуюгомогеннуюнепрозрачнуюсуспензиюосвобождали от клеточныхостатковцентрифугированием в течение 3 мин при скорости 1300 об/мин и температуре 6°С.

Для определения молекулярного состава лейкоцитарныхполипептидов, полученныхпослеобработки ультразвуком, проведенанализвысокоэффективнойжидкостнойхроматографии (ВЭЖХ). Содержаниепептидныхсоединенийконтролировали в растворекомплекса с концентрацией 1 мг/мл по сухому веществу. Идентификациюмолекулярныхмасспептидов проводили на хроматографе фирмыKnauer c использованием колонки Superdex10.

В качествемаркеров молекулярного весаиспользованымолекулы, указанные в таблице 1.

Молекулярнаямасса молекул, использованных для калибровки хроматографической колонки

Таблица 1

Определениебиологическойактивности лейкоцитарного лизата проводили методом серийныхразведений в бульонесогласноМетодическимуказаниям (МУК) 4.2.1890-04 Определениечувствительностимикроорганизмов к антибактериальным препаратам. Для изученияантибактериальныхсвойствполученногополипептидногокомплексаиспользовалиштаммыStaphylococcuscohnii3165 и EscherichiacoliATCC 25922. Оценка антибактериальнойактивностиисследуемыхлизатов проведена подруководствомк.м.н., зав. лабораториейбиохимииразвитиямикроорганизмов, доцента Институтаэкологии и генетики микроорганизмовУральскогоотделенияРоссийскойакадемии наук В.П. Коробова. Для оценкиантибактериальнойактивности в подготовленные 96-луночные планшеты для иммунологическихисследований проводили инокуляциюприготовленнойсуспензииисследуемогомикроорганизма. Далеепланшетыинкубировали при температуре 37°С. Учетрезультатов проводили визуально, сравниваяростмикроорганизма в присутствии лейкоцитарного лизата с ростом культуры без него. За минимальнуюподавляющуюконцентрациюпринималиминимальнуюконцентрацию, обеспечивающуюполноеподавление видимого роста исследуемогоштамма. Определениепротивовируснойактивности проводили согласноОбщейфармакопейнойстатье (ОФС) Биологическиеметодыиспытанияпрепаратовинтерферона с использованием культур клетокпутемсравненияпротективногодействияполученного пептидного комплекса с аналогичнымдействиеммеждународного стандартного образца (МСО) илисоответствующего стандартного образца, откалиброванного в Международныхединицах (МЕ) по соответствующемумеждународному стандарту.

Полученныецифровыеэкспериментальныеданныеобработаны методом вариационной статистики с использованиемt-критерия Стьюдента. Вычисления и построениедиаграмм, отражающихдинамикуизученныхпоказателей, совершали с поддержкойпрограммыMicrosoft Excel XP. ПрименентекстовыйпроцессорMicrosoft Word XP.

Результатыисследования и ихобсуждение

Лейкоцитарныелизаты, полученные с помощьюультразвуковой (УЗ) деструкции, былиподвергнутыочистке, позволяющейосвободиться от балластов и основноймассывысокомолекулярныхбелков. Очищенный таким способом супернатантразделяли на фракции с помощью ВЭЖХ (рис. 1, табл. 2).

Таблица 2

Молекулярный состав лейкоцитарныхпептидов

Анализсигналовпредставленныхизображенийпозволилпредположитьналичие во фракцияхпептидныхсоставляющих и высокомолекулярных молекул. Следуетотметить, чтооколополовины от всего состава (43,583%) составилибелковыемолекулысосреднеймолекулярноймассой 75 кДа и 42,967% с молекулярноймассой от 43 до 6,5 кДа. Содержание в смеси молекул с массой 75 кДа и вышесвидетельствует о необходимостипроведенияболеетонкой очистки с сопутствующимподборомсорбционногоматериала. Только16,8% составилифракциипептидныхсоставляющих с молекулярноймассойменее 6,5 кДа. лейкоцитарный пептид лизат противовирусный

Было получено и проанализировано на наличиеантибактериальнойактивности 5 образцов УЗ лизаталейкоцитов (табл. 3).

Таблица 3

Определениеантибактериальнойактивности лейкоцитарного лизата

Примечание. * - необходимаяконцентрация пептидного комплекса, при которойпрекращаетсяросттестовыхштаммов.

** - Число степенейсвободы(f) равно 4. Парныйt-критерий Стьюдента равен 4,098. Критическоезначениеt-критерия Стьюдента при данномчислестепенейсвободысоставляет 2,776. ^абл>Орит, изменения признака статистическизначимы.

При использовании в качестветестовыхмикроорганизмовSt. cohnii(грамположительные) и E. coli(грамотрицательные) наблюдалидостовернуюоценкуантибактериальнойактивности лейкоцитарного лизата методом микротитрования на 96- луночных планшетах. Таким образом, УЗ-лизатлейкоцитовболееэффективнотормозитростграмм (+) бактерий, подобныхSt. Cohnii,в сравнении с грамм (-) бактериями, такими какE. coli(0,060 мг/мл и 0,656 мг/мл соответственно).

Результатыизученияпротивовируснойактивности УЗ-лизаталейкоцитовпредставлены на рисунке 2.

Рис. 2. Уровеньпротивовируснойактивностиисследуемого лейкоцитарного лизата

Изданных, представленных на рисунке 2, можносделатьвывод, чтополученныйлейкоцитарныйлизатобладалпротивовируснойактивностью, котораяварьировала в пределах от 85 до 165 МЕ. Согласнолитературнымданнымдаженезначительныедозыпрепаратовчеловеческого лейкоцитарного интерферона с противовируснойактивностью 128 МЕ при неоднократномвведении людям разныхвозрастныхгруппбылиэффективны до 69% в зависимости от возрастаучастников. Известно, чтоприменение лейкоцитарного интерферона с низкойактивностью (32 МЕ) в лечебно-профилактическихцелях позволило снизитьзаболеваемостьдетей в 3,9 раза по сравнению с контрольнойгруппой, получавшей плацебо. А использованиепрепаратаперорально с суточнойдозой от 75 до 200 МЕ в течение от 120 до 300 днейдаетположительныйэффект при лечениибольныххроническимвирусным гепатитом типа В [8].

Таким образом, полученный нами лейкоцитарныйлизатобладалантибактериальнойактивностью в отношенииграмположительных и грамотрицательныхмикроорганизмов и противовируснойактивностью до 165 МЕ и может служить основойлекарственныхсредств для профилактикибактериальных и вирусныхинфекций.

Заключение

Данноеисследование показало, что одним изспособовполучениябелковыхфракцийлейкоцитовможет являться ультразвуковаядеструкцияклеток. Полученныйлейкоцитарныйлизатсодержал в своем составе каквысоко-, так и низкомолекулярныесоединения. Этот факт говорит о необходимостидоработкитехнологииполучениянизкомолекулярныхпептидовизлейкоцитовчеловека. Присутствие в составе лейкоцитарного лизатавысокомолекулярныхсоединенийсвидетельствует о целесообразностипроведенияболеетонкой очистки полученнойсубстанции от балластныхбелков. Полученныеэкспериментальныеданные показали, чтолейкоцитарныйлизат, полученный с помощьюфизическогоразрушенияклеток, обладалантибактериальной и противовируснойактивностью, чтоможет служить основой для создания комплексного препарата, направленного на профилактику и лечениебактериальных и вирусныхинфекцийразличнойэтиологии.

Список литературы

1. Решетько О.В., Якимова Ю.Н. Инновационныеантибиотики для системного применения // Клиническаямикробиология и антимикробнаяхимиотерапия. 2015. № 4. C. 272-285.

2. Norrby R., Powell M., Aronsson B. The bacterial challenge: time to react. European Centre for Disease Prevention and Control (Stockholm, September 2009). Stockholm, 2009. Р. 1-3.

3. Butler M.S., Blaskovich M.A., Cooper M.A. Antibiotics in the clinical pipeline in 2013. The Journal of Antibiotics. 2013. Р. 571-591.

4. Зубов П.В., Новикова В.В. Разработкановыхантибактериальныхпрепаратов - проблемы и перспективы // Современныепроблемы науки и образования. 2015. [Электронный ресурс]. URL: https://science-education.rU/pdf/2015/5/649.pdf(дата обращения: 01.12.2018).

5. Волкова Л.В., Гришина Т.А., Волков А.Г. Низкомолекулярныекатионныепептидылейкоцитовиндуцированныеразличными антигенами // Вестник ПНИПУ. Химическаятехнология и биотехнология. 2015. № 4. С. 35-48.

6. Юхнев В. А., Шартукова М. А., Луговкина Н. В., Кокряков В. Н., Шамова О. В. Поискновыхантимикробныхпептидовизсемействакателицидинов и дефенсинов в лейкоцитах лося ^lcesАlces) // ВестникСПбГУ. 2014. № 1. С. 115-131.

7. Щукин С.И., Акопян Б., Ершов Ю.А. Ультразвук в медицине, ветеринарии и биологии. М.: ИздательствоЮрайт, 2016. 223 с.

8. Caban J., Mossor-Ostrowska J., Zurkowska-Bieda T. Treatment of chronic viral hepatitis type B with opal mucosal administration of natural human interferon alpha lozenges. ArchivumImmunologiaeetTherapiaeExperimentalis 1993. vol. 41. no. 3-4. P. 229-235.

Размещено на Allbest.ru