Цитоморфометрия и ее значение в изучении клеток. Цитохимические методы исследования внутриклеточных структур. Методы выявления органоидов

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Реферат

На тему: Цитоморфометрия и ее значение в изучении клеток. Цитохимические методы исследования внутриклеточных структур. Методы выявления органоидов

Выполнила: Асекова Жанайым

Бишкек 2020

Введение

Цитологические методы исследования позволяют неинвазивно, а значит, безболезненно и за короткое время определить характер патологических изменений, происходящих в тканях, проследить динамику процессов в очаге поражения, оценить эффективность лечения и прогнозировать отдаленные результаты.

Цель: изучить цитологические методы исследования. Узнать что такое цитофотометрия и ее значение, а также цитохимические методы исследования.

Цитоморфометрия

Современным разделом цитологии является цитоморфометрия, которая основывается на математической обработке результатов цитограмм и количественной оценке содержания различных клеточных элементов. Морфометрическая характеристика цитологической картины в норме и патологии дает возможность применить весь комплекс современного математического анализа объектов и явлений с помощью электронно-вычислительной техники, поднять изучение морфологии человека на качественно новый уровень. При этом устанавливаются корреляционные отношения выявленных цитологических показателей, с одной стороны, и характера патологических процессов в исследуемых клеточных субстратах -- с другой. С целью объективации воспалительных и деструктивных процессов в тканях пародонта был разработан цитоморфометрический метод, в основе которого лежит изучение клеточных элементов цитограмм отпечатков с десны. Методика получения материала для цитологического исследования. Забор материала для цитологического исследования проводят с помощью заготовленных резиновых клиньев. Эти клинья-мишени хранят в чашках Петри, залитыми 70 % раствором этилового спирта. Перед забором отпечатков с десны мишень извлекают пинцетом из чашки Петри, высушивают струей сухого воздуха из воздушного пистолета. При введении мишени в десневую борозду одна поверхность мишени должна касаться зуба, а вторая -- внутренней поверхности ПК (десневой бороздки). Цитологический материал переносят в виде отпечатков на предметное стекло. С каждого зуба получают два типа отпечатков: один -- с десны, другой -- с зуба. При направлении отпечатков в лабораторию на цитологическое исследование забранный на предметное стекло материал сопровождают кратким описанием клинических данных. Методика микроскопирования. Отпечатки окрашивают и исследуют под микроскопом с использованием иммерсионной системы при различных увеличениях с помощью окуляров х10 (или х20) и объектива х40. Увеличения варьируют в зависимости от режима исследования. В режиме обзора на больших полях цитограмм используют средние увеличения, при необходимости изучения деталей клеточных структур и при подсчете клеток применяют максимальные увеличения (включая иммерсию). При исследовании цитологического материала анализируют не только качественные признаки, но и количественные показатели цитограмм.

Цитофотометрия была разработана шведским гистологом Т. Касперсоном в 1936 году. Чувствительность метода составляет порядка 10-12 г. Точность цитофотометрии снижается из-за ошибок измерения, возникающих из-за неравномерного распределения вещества в клетке; этой ошибки можно избежать с помощью цитофотометрии на двух разных длинах волн излучения. Ультрафиолетовая цитофотометрия позволяет определять количество нуклеотидов, нуклеиновых кислот и белков в неокрашенных препаратах по их естественному поглощению ультрафиолетовых лучей.

Цитофотометрия обычно используется в видимой области спектра; также используется естественный цвет отдельных веществ или, чаще, искусственное окрашивание препаратов специальными гистохимическими красителями, которые в определенных количествах сочетаются с химическими компонентами клетки. Большинство красителей помогают в определении нуклеиновых кислот и белков и их индивидуальных реактивных групп в клетке, а также в определении активности многих ферментов.

цитоморфометрия жирный клеточный

Цитохимические методы исследования

Цитохимические методы исследования -- микроскопические методы исследования, позволяющие проводить анализ химического состава клетки и локализации в ней исследуемых веществ при сохранении структуры клетки. Цитохимические методы исследования широко используют в цитологии, эмбриологии, патологической анатомии, физиологии, фармакологии. Эти методы помогают определять характер, интенсивность обмена веществ в клетке, а также изучать различные специализированные функции клетки.

В отличие от гистохимических методов цитохимические методы исследования применяют для анализа только отдельных клеток или их групп, причем цитохимические методы исследования обладают большей чувствительностью. От биохимических методов исследования цитохимические методы исследования отличает возможность точно определить локализацию исследуемых веществ в клетке. Цитохимический анализ, выявляя специфичность тканевых клеток, дополняет биохимические исследования.

Появление цитохимических методов исследования связано с развитием цитологии, биохимии , физиологии, аналитической и органической химии.

Методы исследования хим. состава клетки подразделяют на физические (интерференционная, флюоресцентная и УФ-микроскопия и собственно химические. Последние должны обеспечивать специфичность связывания красителя исследуемым веществом, сохранение неизменной локализации вещества в клетке в процессе подготовки и проведения исследования, окраску конечного продукта хим. реакции, сохранность структур клетки в условиях ее осуществления. Белки, нуклеиновые кислоты, полисахариды и липиды в клеточных структурах выявляют с помощью красителей (хромогенные агенты), избирательно связывающихся со специфическими группами этих веществ. Для повышения специфичности реакций применяют экстрагирование, блокаду или ферментативное расщепление неспецифических компонентов. Сохранение неизменной локализации анализируемого вещества достигается его фиксацией. Для обеспечения сохранности структур клетки в условиях хим. реакций используют методы (в том числе методы аналитической химии), не требующие применения концентрированных кислот, щелочей, нагревания до высокой температуры и т. п.

Оценка анализируемых с помощью цитохимических методов исследования веществ может быть качественной и количественной. При качественных методах цитохимического анализа интенсивность реакции и локализация ее продукта определяются визуально, с помощью микроскопа. Качественные цитохимические реакции выявляют белки и аминокислоты клетки, различные ферменты, нуклеиновые кислоты, углеводы, липиды, пигменты, биогенные амины и неорганические вещества.

Для гистохимического и цитохимического выявления белков используют их физико-химические и биологические свойства или проводят реакции на содержащиеся в них специфические группы и аминокислоты. К методам, использующим физико-химические и биологические свойства белков, относятся иммунохимические, авторадиографические методы, методы окрашивания, основанные на различии кислотно-щелочных свойств, методы, основанные на различиях в растворимости, методы ферментативного расщепления. К методам, использующим реакции на специфические группы белков, относятся методы определения белков по наличию реакционно-способных групп в аминокислотах. В основе цитохимических методов исследования ферментов лежит выявление продукта ферментативной реакции. Выявление самого ферментативного белка возможно лишь с помощью сложных иммуногистохимических методов. Цитохимическими методами в настоящее время определяют около 90 из 900 известных ферментов.

Для выявления углеводов используют методы их окисления, метахроматического окрашивания, связывания ионов металла, блокирования или превращения реакционно-способных групп, ферментативный гидролиз; применяют также методы авторадиографии и иммуногистохимии. Среди методов выявления полисахаридов центральное место занимает ШИК-реакция.

Выявление липидов основано либо на восстановлении некоторых хим. соединений жирными кислотами, либо на использовании свойства ряда красителей лучше растворяться в жировых веществах. Для выявления отдельных видов липидов часто используют комплексы различных методов.

Цитохимическое определение пигментов связано с выявлением присутствующих в их составе различных химических групп (см. Пигменты, гистохимические методы определения в тканях).

Биогенные амины (катехоламины и индоламины) выявляют цитохимически, используя хромаффинную и аргентаффинную реакции, реакцию окрашивания и реакцию конденсации.

Определение внутриклеточной локализации неорганических веществ связано с большими трудностями из-за их низкой концентрации, хорошей растворимости и большой подвижности. Цитохимическое определение неорганических веществ основано на реакциях, продуктами которых являются лаки, хелаты, окрашенные соли, а также на реакциях замещения одного иона на другой. Применяют и методы микросжигания (см.), рентгеновского микроанализа.

Количественные методы цитохимического исследования используют для определения содержания веществ в клетке и ее структурах. Наиболее распространенным методом количественного цитохимического исследования является цитофотометрия . Важную роль играет также авторадиография (см.), используемая для анализа скорости синтеза и обмена веществ в клетке, определения локализации отдельных веществ, перемещения их внутри клетки, для выявления клеток, маркированных радиоактивными изотопами и др. Для выявления локализации определенных генов в хромосомах применяют метод гибридизации нуклеиновых кислот на цитологических препаратах. На предварительно денатурированную ДНК помещают радиоактивную РНК или же одноцепочечную ДНК, соответствующую структуре гена; места гибридизации обнаруживают авторадиографически.

Методы выявления органоидов

Методы выявления капсулы. Метод окраски по Бурри-Гинсу

Смешать каплю взвеси бактерий с каплей туши, сделать мазок, высушить и зафиксировать. На мазок нанести водный раствор фуксина (на 1-2 минуты) промыть водой, высушить и микроскопировать. Бактерии окрашиваются в розовый цвет, а неокрашенные капсулы контрастно выделяются на черно- розовом фоне.

Метод окраски по Цилю-Ни(е)льсену

Нанести на мазок карболовый раствор фуксина и подогреть до появления паров в течение 3 - 5 минут, промыть водой нанести 5% раствор H2SO4 на 1-2 минуты промыть водой докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 минут промыть водой, высушить и микроскопировать.

Раствор карболовой кислоты разрыхляет поверхностные структуры бактерий и тем самым повышает их тинкториальные свойства, при этом вегетативные формы окрашиваются в красный цвет.

Циль Франц (FranzZiehl) (1857-1926) немецкий бактериолог, профессор в Любеке. Продолжая работы Пауля Эрлиха, Франц Циль создал в 1882 году карболфуксиновый - краситель для окрашивания возбудителя туберкулёза. В 1883 году совместно с патологом Фридрихом Нельсеном разработал метод окраски, который используется для идентификации кислотоустойчивых микобактерий.

Метод окраски по Ожешко (и)

На нефиксированный мазок нанести 0,5% раствор HCl и подогреть на пламени 2-3 минуты кислоту слить, препарат промыть водой, просушить, зафиксировать, затем окрасить по Цилю-Нильсену

Раствор карболовой кислоты разрыхляет оболочку спор и тем самым повышает её тинкториальные свойства, при этом споры и вегетативные формы окрашиваются в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой вегетативные формы обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а споры остаются красными.

Окраска жгутиков по методу Лёффлера.

Для окраски жгутиков используют клетки 12--16-часовой культуры.

Клетки легко теряют жгутики в момент приготовления мазка, поэтому необходимо обращать внимание на чистоту стекла и способ нанесения на него суспензии. Высушенный мазок заливают протравой (смесь равных объемов гипертонического раствора хлорида натрия и танина) на 15 мин, промыть дистиллированной водой Препарат окрасить в течение 5 мин разбавленным фуксином Циля, промыть водой, высушить на воздухе.

Обращают внимание на расположение жгутиков, их количество и длину.

Фридрих Август Иоганн Лёффлер (Friedrich August Johannes Loeffler, 1852--1915) -- немецкий бактериолог и гигиенист.

Один из основоположников медицинской микробиологии. В 1882 году открыл возбудителя сапа. В 1884 году выделил в чистой культуре возбудителя дифтерии, открытого Эдвином Клебсом (дифтерийная палочка Клебса-Леффлера). В 1891 году открыл бактерии мышиного тифа и использовал их для борьбы с полевыми мышами.

Размещено на Allbest.ru