Особливості транспорту цинку і кадмію через мембрани еритроцитів за дії підвищених концентрацій їх іонів у воді

Размещено на http://www.allbest.ru/

Тернопільський національний педагогічний університет імені Володимира Гнатюка

ОСОБЛИВОСТІ ТРАНСПОРТУ ЦИНКУ І КАДМІЮ ЧЕРЕЗ МЕМБРАНИ ЕРИТРОЦИТІВ ЗА ДІЇ ПІДВИЩЕНИХ КОНЦЕНТРАЦІЙ ЇХ ІОНІВ У ВОДІ

В.О. Хоменчук, Ю.І. Сеник, В.З. Курант

Тернопіль

Анотація

Досліджено особливості транспорту Цинку та Кадмію через мембрани еритроцитів коропа in vitro після 14 аклімації риб до підвищених концентрацій іонів Zn²+та Cd²+ у воді. Встановлено, що поглинання цих металів еритроцитами коропа є до певної межі регульованим та концентраційнозалежним процесом. Зростання значення константи Міхаеліса сорбції іонів металів еритроцитами риб аклімованих до дії підвищених концентрацій іонів Zn²⁺ та Cd²⁺ вказує на зменшення їх спорідненості до металів, що є адаптивною відповіддю клітин на дію підвищених концентрацій токсикантів. Характер проникнення Цинку та Кадмію через біомембрану червоних кров'яних тілець риб, аклімованих до дії 2 ГДК іонів досліджених металів є очевидно результатом значних порушень цілісності мембрани клітин, і, як наслідок, зменшення здатності регулювати та обмежувати надходження досліджених металів до еритроцитів риб.

Ключові слова: транспорт, цинк, кадмій, еритроцити, короп.

Annotation

V. O. Khomnechuk, Yu. I. Senyk, V. Z. Kurant

Ternopil Volodymyr Hnatiuk National Pedagogical University, Ukraine

PECULIARITIES OF ZINC AND CADMIUM TRANSPORT THROUGH ERYPROCYTIC MEMBRANES UNDER THE ACTION OF INCREASED CONCENTRATIONS OF THEIR IONS IN WATER

The peculiarities of Zinc and Cadmium transport through carp erythrocyte membranes in vitro after 14 acclimatization of fish to elevated concentrations of Zn²+ and Cd²+ ions were studied. It has been established, that the uptake of Zinc and Cadmium by carp erythrocytes is to a certain extent a regulated and concentration-dependent process. The uptake of Zinc and Cadmium has been shown to involve two stages: rapid sorption of metals by the membrane surface of fish erythrocytes and slower penetration through the apical membrane of red blood cells. The increase in the value of the Michaelis constant of sorption of metal ions by erythrocytes of fish acclimatized to elevated concentrations of Zn²⁺ and Cd²⁺ ions indicates a decrease in their affinity for metals, which is the adaptive response of cells to elevated concentrations of toxicants. The nature of the penetration of Zinc and Cadmium through the biological membrane of red blood cells of fish acclimatized to the action of 2 MPC of Zn²⁺ and Cd²⁺ ions is obviously the result of significant violations of cell membrane integrity, and, consequently, reduced ability to regulate and limit the flow of studied metals.

Keywords: transport, zinc, cadmium, erythrocytes, carp.

Виклад основних матеріалів

Низка металів, входячи до складу живих організмів, є регуляторами багатьох фізіологічних та біохімічних процесів у них, у тому числі і водних тварин. Разом з тим, деякі метали, що потрапляють у гідроекосистеми з природних та антропогенних джерел, є вкрай токсичними для риб [9, 12].

Основною мішенню токсичної дії важких металів є біологічні мембрани [2, 3]. Еритроцити - універсальна модель для вивчення процесів, що відбуваються в клітинній мембрані під дією найрізноманітніших чинників, у тому числі металів [1]. Мембранам еритроцитів, окрім того, притаманні загальні принципи молекулярної організації плазматичних мембран [6]. Тому закономірності змін структури і функції мембрани еритроцитів за впливу іонів металів можуть бути екстрапольовані на інші мембранні системи.

Відомо, що організм риб має здатність адаптуватись до дії іонів металів та регулювати кількість їх надходження. Одним із важливих механізмів лімітування надходження металів є структурна перебудова мембран [10]. Тому нами було досліджено особливості транспорту Цинку та Кадмію через мембрани еритроцитів коропів, адаптованих до підвищених концентрацій іонів Zn²+ та Њ²+. Дослідження функціональних змін показників мембран еритроцитів риб за дії металів також дозволить повніше дослідити механізми адаптації організму риб до несприятливих еколого-хімічних чинників навколишнього середовища.

Матеріал і методи досліджень

Дослідження проведено на дворічках коропа (Cyprinus caprio L.) з середньою масою 300-350 г. Вивчали особливості транспорту Цинку та Кадмію через мембрани еритроцитів риб in vitro після 14 денної аклімації риб до підвищених концентрацій іонів Zn²"+ra Cd²⁺ у воді. Період аклімації у риб у токсичних умовах є достатнім для формування адаптивної відповіді на дію стрес-чиннику [8].

Риб утримували в акваріумах об'ємом 200 л з відстояною водопровідною водою (вміст О₂ складав 7,5±0,5 мг/дм³; СО₂ - 2,5±0,3 мг/ дм³; рН - 7,8±0,1). Іони металів вносили в концентраціях, що відповідали 0,5 та 2,0 рибогосподарським ГДК (0,5 і 2мг/дм³ для Zn²+ та 0,005 мг/дм³ і 0,02 мг/дм³ для Cd²+) [7]. Необхідні концентрації іонів металів у воді створювали внесенням солей ZnSO₄-5H₂O та CdCl₂-2,5H₂O кваліфікації “х.ч.”.

Після акламації риб до токсичних умов in vitro вивчали концентраційну залежність проникнення Цинку та Кадмію в еритроцити адаптованих та неадаптованих риб. Кров для дослідження відбирали із серця риб. Голку для взяття крові з метою запобігання коагуляції попередньо обробляли розчином гепарину. Еритроцити крові отримували центрифугуванням охолодженої гепаринізованої крові риб протягом 10 хв при 3000 об./хв [4].

Іони металів (0,1, 0,5, 1, 2, 3 та 5 мг/ дм³) в інкубаційне середовище вносили у вигляді розчину солей ZnSO₄-5H₂O та CdCl₂-2,5H₂O кваліфікації “х.ч.”. Як інкубаційне середовище використано розчин Рінгера для холоднокровних (NaCl - 129,6 мМ, CaCl₂ - 1,8 мМ, NaHCO₃ - 2,5 мМ, KCl - 2,7 мМ). Співвідношення об'єму крові до об'єму середовища інкубації становило 1:10. Час інкубації тривав 30 хв за температури 18⁰С розчину, що був насичений атмосферним киснем. Реакцію зупиняли додаванням 0,5 мл 0,01 М розчину ЕДТА, після чого еритроцити промивали тричі чистим фізіологічним розчином. Рівень накопичення Цинку та Кадмію визначали як різницю між вмістом металів в контрольній (без додавання іонів металів) та дослідних групах та виражали в мкг/г вологої маси. Кінетичні параметри накопичення металів у тканинах розраховували графічно за інтенсивністю накопичення та в координатах Лайнуівера-Берка.

Для визначення вмісту кадмію та цинку в еритроцитах останні спалювали в перегнаній нітратній кислоті у співвідношенні 1:5 (маса: об'єм). Вміст металів визначали на атомно-абсорбційному спектрофотометрі С-115. Усі одержані дані оброблено статистично з використанням t-критерію Cтьюдента [5].

Результати досліджень та їх обговорення

Аналіз отриманих результатів показав, що поглинання іонів Цинку в риб контрольної групи в діапазоні 0,1-2 мг/дм³ іонів металу в середовищі інкубації має місце значне зростання кількості сорбованого металу (від 1,98 до 4,57 мкг/г), після чого транспорт іонів Zn²+ сповільнюється (рис. 1).

Рис. 1 Вплив адаптації до дії 0,5 ГДК іонів Цинку на його поглинання еритроцитами коропа

Подібний профіль поглинання іонів Цинку було відмічено в риб, аклімованих до 0,5 ГДК іонів Zn²⁺. Проте максимум акумульованого металу відмічено за 1 мг/ дм³ іонів металу в середовищі інкубації еритроцитів риб.

Таку закономірність кінетики поглинання іонів Цинку, імовірно, можна пояснити насиченням поверхні еритроцитів металом, після чого процес накопичення лімітується проникненням металу через мембранні структури. Слід відзначити більші кількості сорбованого Цинку еритроцитами риб, що були аклімовані до 0,5 ГДК іонів Zn²+. Очевидно, це пояснюється більшою кількістю сайтів зв'язування на поверхні еритроцитарної мембрани.

Було встановлено, що максимальна швидкість надходження Zn²+ через мембрану еритроцитів у неаклімованих коропів становить 8,93-10^-3 мкмоль/г-хв, а значення константи Міхаеліса поглинання для Zn²+ становить 0,258 мкмоль^-1 (рис. 2).

Рис. 2 Поглинання іонів Zn²+ еритроцитами коропа в координатах Лайнуівера-Берка

Константа Міхаеліса сорбції Цинку еритроцитами риб, аклімованих до дії допорогових концентрацій іонів цинку, становила 0,262 мкмоль^-1, а максимальна швидкість надходження - 1,05-10^-2 мкмоль/г *хв.

Подібність кінетичних кривих накопичення токсиканту, а також незначні зміни в значеннях максимальної швидкості надходження іонів Цинку та константи Міхаеліса в контрольних та аклімованих до дії допорогових концентрацій іонів Цинку груп риб вказує на незначні структурно-функціональні зміни мембрани еритроцитів.

У риб, аклімованих до дії 2 ГДК іонів цинку, характер залежності поглинання Zn²+ еритроцитами відмінний від групи риб, адптованих до впливу 0,5 ГДК токсиканту. Дослідження показують, що кількість поглинутого металу еритроцитами у цій групі коропів є нижчою порівняно з рибами, адаптованими до дії допорогових концентрацій, хоча кількість поглинутих іонів Zn²+, у цілому, також була вищою в червоних кров'яних тільцях порівняно з контрольною групою (рис. 3).

Рис. 3 Вплив адаптації до дії 2 ГДК іонів Цинку на його поглинання еритроцитами коропа

Із одержаних даних видно, що проникнення іонів Zn²+ через мембрану еритроцитів аклімованих риб до дії сублетальної кількості Цинку в інтервалі концентрацій іонів металу 0,1 - 1 мг/дм³ має лінійний характер. За концентрації Zn²+ близько 1 мг/л відмічається насичення мембрани еритроцитів з подальшим зменшенням кількості поглинутого металу при концентрації 2 мг/дм³. В інтервалі концентрацій 2-5 мг/дм³ іонів Цинку в середовищі інкубації спостерігається лінійне зростання кількості сорбованого металу еритроцитами, що, очевидно, свідчить про нерегульоване надходження металу за градієнтом концентрації.

Зменшення кількості накопиченого металу в еритроцитах аклімованих риб до дії 2 ГДК токсиканту порівняно з показниками еритроцитів аклімованих риб до дії допорогової концентрації, очевидно, є наслідком адаптивних змін мембрани еритроцитів з метою обмеження надходження цинку до клітин крові коропа. Було встановлено, що константа Міхаеліса поглинання Цинку еритроцитами риб, аклімованих до дії 2 ГДК іонів Цинку, становить 0,775 мкмоль^-1, а максимальна швидкість транспорту іонів металу - 1,68-10^-2 мкмоль/г-хв (рис. 4).

Рис. 4 Поглинання іонів Zn²⁺ еритроцитами коропа в координатах Лайнуівера-Берка

Отримані дані щодо накопичення іонів Кадмію в еритроцитах дослідних коропів показують, що адаптовані до дії допорогових концентрацій токсиканта риби сорбують більшу його кількість порівняно з контрольною групою (рис. 5).

Рис. 5 Вплив адаптації до дії 0,5 ГДК Кадмію на його поглинання еритроцитами коропа

При зростанні кількості іонів Cd²+ у середовищі інкубації > 2 мг/л спостерігається сповільнення процесу поглинання металу еритроцитами риб дослідної групи. Це можна пояснити, з одного боку, інгібуванням мембранних переносників, можливо, за рахунок зв'язування металу з їх -SH групами, адже відомо, що Кадмій відноситься до групи так званих «тіолових отрут» [11], а з іншого - зростанням резистентності мембранних структур та ізолюючої здатності мембрани щодо іонів Cd²⁺.

Було встановлено, що константа Міхаеліса для процесів сорбції та проникнення через мембрану еритроцитів риб, аклімованих до дії допорогових концентрацій іонів Кадмію, розрахована графічно за методом подвійних зворотних величин, становлять 2,46-10^-2 мкмоль^-1, а максимальна швидкість процесу -- 0,00258 мкмоль/г-хв (рис. 6).

Рис. 6 Поглинання іонів Cd²⁺ еритроцитами коропа в координатах Лайнуівера-Берка

Максимальна швидкість надходження Cd²+ через мембрану еритроцитів у неадаптованих риб становила 1,62-10^-3 мкмоль/г хв, а константа Міхаеліса - 1,2 * 10^-2 мкмоль^-1.

Порівнюючи дані поглинання Кадмію еритроцитами адаптованих риб з контрольною групою, можна відзначити збільшення значення константи Міхаеліса, що вказує на зниження спорідненості мембранних переносників до іонів Кадмію, а також зростання швидкості їх транспорту через мембрану еритроцитів. Одержані результати можуть свідчити про синтез специфічних ізоформ мембранних переносників, що є адаптивною відповіддю на дію підвищених концентрацій токсиканта у воді. Очевидно, такі функціональні зміни транспортних білків мембрани сприяють інтенсифікації процесів перерозподілу та виведення Кадмію з організму риб.

У риб, адаптованих до дії 2 ГДК іонів Cd²+, характер залежності поглинання Cd²+ еритроцитами відмінний від групи риб, аклімованих до 0,5 ГДК металу (рис. 7).

Рис. 7 Вплив адаптації до дії 2 ГДК Кадмію на його поглинання еритроцитами коропа

Відмічено послаблення поглинання іонів металу при концентрації його 2 мг/дм³ в середовищі інкубації з подальшим лінійним зростанням без ефекту насичення.

Було встановлено, що константа Міхаеліса сорбції Кадмію мембраною еритроцитів риб, аклімованих до дії 2 ГДК іонів Кадмію, становила 4,7-10^-2 мкмоль^-1, а максимальна швидкість транспорту іонів металу - 3,17-10^-3 мкмоль/г хв (рис. 8).

Рис. 8 Поглинання іонів Сй²⁺ еритроцитами коропа в координатах Лайнуівера- Берка

Очевидно, при зростанні концентрації токсиканту вище 2 мг/л мембранні структури неефективно обмежують надходження іонів Cd²+ та має місце пряма залежність між концентрацією токсиканту у воді та його кількістю в еритроцитах.

Висновки

Поглинання іонів Цинку та Кадмію еритроцитами коропа є до певної межі регульованим та концентраційнозалежним процесом. 14-денна адаптація риб до підвищених концентрацій іонів Zn²+ та Cd²+ призводить до суттєвих змін у проникності біологічної мембрани еритроцитів. Зростання значення константи Міхаеліса сорбції іонів металів еритроцитами риб, аклімованих до дії підвищених концентрацій іонів Zn²⁺ та Cd²⁺, указує на зменшення їх спорідненості до металів, що є адаптивною відповіддю клітин на дію підвищених концентрацій токсикантів. Характер проникнення Цинку та Кадмію через біомембрану червоних кров'яних тілець риб, аклімованих до дії 2 ГДК іонів Zn²⁺ та Cd²⁺, є, очевидно, результатом значних порушень цілісності мембрани клітин, і, як наслідок, зменшення здатності регулювати та обмежувати надходження досліджених металів до еритроцитів риб.

Список літератури

1. Абдуллаева Н. М., Г абибов М. М. Состояние мембран эритроцитов периферической крови рыб при воздействии тяжелых металлов и сырой нефти. Известия вузов. Северо-Кавказский регион. Естественные науки. 2011. № 5. C. 50-54.

2. Апихтіна О. Л. Дослідження мембранотоксичної дії важких металів на моделі еритроцитів крові in vitro. Сучасні проблеми токсикології. 2011. № 1-2. C. 65-69.

3. Геннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функция. М.: Мир, 1997. 624 с.

4. Житенёва Л. Д., Рудницкая О. А., Калюжная Т. И. Эколого-гематологические характеристики некоторых видов рыб. Справочник. Ростов на Дону: АзНИИРХ, 1997. 149 с.

5. Лакин Г. Ф. Биометрия: учебное пособие для биол. спец. вузов. 4-е. изд., перераб. и доп. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.

6. Новицкий В. В., Рязанцева Н. В., Степовая Е. А., Федорова Т. С., Кравец Е. Б., Иванов В. В., Жаворонок Т. В., Часовских Н. Ю., Чудакова О. М., Бутусова В. Н., Яковлева Н. М. Молекулярные нарушения мембраны эритроцитов при патологии разного генеза являются типовой реакцией организма: контуры проблемы. Бюллетень сибирской медицины, 2006. № 2. С. 62-69.

7. Обобщенный перечень предельно-допустимых концентраций (ПДК) и ориентировочно-безопасных уровней воздействия вредных веществ (ОБУВ) для воды рыбохозяйственных водоемов / Минрыбхоз СССР. М., 1990. 44 с.

8. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. М.: Мир, 1988. 568 с.

9. Hemmadi V. A critical review on integrating multiple fish biomarkers as indicator of heavy metals contamination in aquatic ecosystem. International Journal of Bioassays. 2017. Vol. 6 (9). P. 5494-5506.

10. Henderson R. J., Tocher D. R. The lipid composition and biochemistry of dreshwater fish. Prog. Lipid Res., 1987. Vol. 26 (4). Р. 281-347.

11. Remelli M., Nurchi V. M., Lachowicz J. I., Medici S., Zoroddu M. A., Peana M. Competition between Cd (II) and other divalent transition metal ions during complex formation with amino acids, peptides, and chelating agents. Coord. Chem. Rev. 2016. Vol. 327-328. Р. 55-69.

12. Wood Chris M., Farrell Anthony P., Brauner Colin J. Homeostasis and toxicology of essential metals edited. Fish Physiology. London: Academic Press. 2011. Vol. 31. Part A. P. 1-497.

References

1. Abdullaeva N. M., Gabibov M. M. Sostoyanie membran eritrocitov perifericheskoj krovi ryb pri vozdejstvii tyazhelyh metallov i syroj nefti. Izvestiya vuzov. Severo-Kavkazskij region. Estestvennye nauki. 2011. № 5. C. 50-54. [in Russian]

2. Apykhtina O. L. Doslidzhennia membranotoksychnoi dii vazhkykh metaliv na modeli erytrotsytiv krovi in vitro. Suchasni problemy toksykolohii. 2011. № 1-2. C. 65-69. [in Ukrainian]

3. Gennis R. Biomembrany: Molekulyarnaya struktura i funkciya. M.: Mir, 1997. 624 s. [in Russian]

4. Zhitenyova L. D., Rudnickaya O. A., Kalyuzhnaya T. I. Ekologo-gematologicheskie harakteristiki nekotoryh vidov ryb. Spravochnik. Rostov na Donu: AzNIIRH, 1997. 149 s. [in Russian]

5. Lakin G. F. Biometriya: Uchebnoe posobie dlya biol. spec. vuzov. 4-e. izd., pererab. i dop. M.: Vyssh. shk., 1990. 352 s. [in Russian]

6. Novickij V. V., Ryazanceva N. V., Stepovaya E. A., Fedorova T. S., Kravec E. B., Ivanov V. V., Zhavoronok T.V., Chasovskih N.Yu., Chudakova O. M., Butusova V. N., Yakovleva N. M. Molekulyarnye narusheniya membrany eritrocitov pri patologii raznogo geneza yavlyayutsya tipovoj reakciej organizma: kontury problemy. Byulleten sibirskoj mediciny, 2006. № 2. S. 62-69. [in Russian]

7. Obobshchennyj perechen predelno-dopustimyh koncentracij (PDK) i orientirovochno-bezopasnyh urovnej vozdejstviya vrednyh veshchestv (OBUV) dlya vody rybohozyajstvennyh vodoemov / Minrybhoz SSSR. M., 1990. 44 s. [in Russian]

8. Hochachka P., Somero Dzh. Biohimicheskaya adaptaciya. M.: Mir, 1988. 568 s. [in Russian]

9. Hemmadi V. A critical review on integrating multiple fish biomarkers as indicator of heavy metals contamination in aquatic ecosystem. International Journal of Bioassays. 2017. Vol. 6 (9). P. 5494-5506.

10. Henderson R. J., Tocher D. R. The lipid composition and biochemistry of dreshwater fish. Prog. Lipid Res., 1987. Vol. 26 (4). Р. 281-347.

11. Remelli M., Nurchi V.M., Lachowicz J.I., Medici S., Zoroddu M.A., Peana M. Competition between Cd (II) and other divalent transition metal ions during complex formation with amino acids, peptides, and chelating agents. Coord. Chem. Rev. 2016. Vol. 327-328. Р. 55-69.

12. Wood Chris M., Farrell Anthony P., Brauner Colin J. Homeostasis and toxicology of essential metals edited. Fish Physiology. London: Academic Press. 2011. Vol. 31. Part A. P. 1-497.

Размещено на Allbest.ru