Определение микотоксинов в меде и продуктах пчеловодства в российской федерации

Размещено на http://www.allbest.ru/

Определение микотоксинов в меде и продуктах пчеловодства в российской федерации

Аннотация

Микотосины являются продуктами жизнедеятельности плесневых грибов и составляют одну из наиболее опасных групп токсических соединений, обладающих мутагенными и канцерогенными свойствами. Предотвратить загрязнение продуктов питания микотоксинами практически невозможно, поэтому необходим строгий контроль данных веществ в пищевых продуктах растительного и животного происхождения. В настоящее время в большинстве стран установлены максимально допустимые уровни для ряда микотоксинов в продуктах питания и кормах, превышение которых ведет к серьезным заболеваниям человека и животных. Однако требования, регулирующие микотоксикологическую безопасность в продуктах пчеловодства, отсутствуют.

В своей работе мы представили результаты хроматографического исследования микотоксинов в меде и продуктах пчеловодства. В пчелином меде определяли афлатоксины (В1, В2, G1 и G2), зеараленон, охраток- син А, патулин, дезоксинилваленол и Т-2 токсин. Согласно результатам исследования, были обнаружены афлатоксины B2 и охратоксин А, патулин и дезоксинилваленол в значениях от 0,5 до 177,5 мкг/кг. Предельно допустимые значения для нормирования микотоксинов в меде и пчеловодческой продукции не разработаны, однако в пищевых продуктах значение не должно превышать диапазон от 0,00015 до 1,0 мкг/кг, который зависит от вида пищевого продукта и исследуемого микотоксина.

В статье рассмотрены два метода первочной подготовки: метод жидкостного экстрагирования ацетони- триллом и метод QuEChERS. В своей работе использовали жидкостной хромато-масс-спектрометр LCMS-8060 производства SHIMADZU. Разделение проводили на колонке 5 мкм 2,1 х 150 мм Acclaim™ 120 C18 (Thermo scientific) в режиме градиентного элюирования подвижной фазы.

Результаты микробиологических и микотоксикологических исследований частично коррелируют с полученными данными из Пакистана и Словацкой Республики.

Ключевые слова: мед, микотоксины, ветеринарно-санитарная экспертиза, плесневые грибы, афлатоксины, охратоксин, зеараленон, патулин, ВЭЖХ-МС/МС.

Abstract

DETERMINATION OF MYCOTOXINS IN HONEY AND BEE PRODUCTS

Mycotosins are the waste products of mold fungi and constitute one of the most dangerous groups of toxic compounds with mutagenic and carcinogenic properties. It is almost impossible to prevent contamination of food with mycotoxins, therefore, strict control of these substances in foods of plant and animal origin is necessary. Currently, most countries have set maximum levels for a number of mycotoxins in food and feed, exceeding which leads to serious diseases in humans and animals. However, there are no requirements established for mycotoxin contamination of beekeeping products, as well as honey.

In our work, we presented the results of a chromatographic study of mycotoxins in honey and bee products. Aflatoxins (B1, B2, G1 and G2), zearalenone, ochratoxin A, patulin, deoxynylvalenol and T-2 toxin were determined in bee honey. According to the results of the study, aflatoxins B2 and ochratoxin A, patulin and deoxynylvalenol were found in values from 0.5 to 177.5 pg/kg. Limit values for normalization of mycotoxins in honey and bee products have not been developed, however, in foodstuffs, the value should not exceed the range from 0.00015 to 1.0 pg/kg, depending on the food product and mycotoxin.

The article discusses two methods of primary preparation: the method of liquid extraction with acetonitrile and the QuEChERS method. In our work, we used an LCMS-8060 liquid chromatography-mass spectrometer manufactured by SHIMADZU. Separation was carried out on a 5 pm 2.1 x 150 mm Acclaim™ 120 C18 column (Thermo scientific) in the mobile phase gradient elution mode.

The results of microbiological and mycotoxicological studies partially correlate with data received from Pakistan and the Slovak Republic.

Keywords: honey, mycotoxins, veterinary and sanitary examination, molds, aflatoxins, ochratoxin, zeara- lenone, patulin, HELC-MS/MS.

Введение

Вопросы безопасности продуктов питания и продовольственной безопасности непрерывно связаны. Небезопасные продукты питания, содержащие болезнетворные бактерии, вирусы, паразиты или химические вещества, являются причиной более двухсот заболеваний - от диареи до онкологических заболеваний. Наибольшую угрозу для здоровья представляют токсины природного происхождения и вещества, загрязняющие окружающую среду. К токсинам природного происхождения относят морские биотоксины, цианогенные гликозиды и токсины, содержащиеся в ядовитых грибах [5, 10].

Микотоксины - это вторичные метаболиты различных видов плесневых грибов, которые составляют одну из наиболее опасных групп токсичных соединений, представляющих угрозу здоровью животных и человека, так как обладают мутагенными, канцерогенными, тератогенными, нефротоксическими, гепатотоксическими свойствами, оказывают иммуноде- прессивный эффект, поражают почки, печень, нервную и кровеносную системы, желудочнокишечный тракт, вызывают заболевания крови, септическую ангину, дерматиты, судороги, острые боли, состояние, аналогичное тяжелому опьянению, нарушают гормональное равновесие и функции воспроизводства. Микотоксины обладают токсическим эффектом даже в чрезвычайно малых дозах [4, 6, 12].

Термин «микотоксины» охватывает широкую группу соединений, весьма отличающихся по своему химическому строению и, следовательно, по оказываемому токсическому действию. К числу наиболее распространенных микроорганизмов относятся плесневые грибы, объединяющие несколько тысяч видов. Известно, более 250 видов микроскопических грибов, способных продуцировать несколько сотен микотоксинов. Микотоксины продуцируются, в основном, грибами родов Aspergillus, Fusarium, Penicillium, однако при определенных условиях роста могут выделяться другими видами грибов [4].

Среди микотоксинов, представляющих опасность для здоровья человека и животных, выделяют зеараленон, зеараленол, афлатоксины (Bl, В2, G1 и G2), трихотеценовые микотоксины (трихотецены), патулин, охратоксины [13].

Для контроля загрязненности микотоксинами продуктов питания, кормов для животных и посевных культур осуществляется пищевой мониторинг, который нацелен на выявление зараженных продуктов и недопущение их в употребление человеком и животными. Пищевой мониторинг является системой наблюдения, анализа, оценки качества и безопасности пищевых продуктов, материалов и изделий, контактирующих с продуктами питания. Для определения безопасности продукта необходимо не только проводить тесты и лабораторные испытания, но также сравнивать результаты исследований с установленными предельно допустимыми значениями (ПДК).

Так, в 2006 году Европейская комиссия (Регламент Комиссии ЕС № 1881/2006) устанавливает максимально допустимые уровни для нескольких типов микотоксинов (афлаток- синов B, G и M, охратоксина A (OTA), патулина, фумонизинов B1 и B2, дезоксиниваленола и зеараленона) в различных продуктах питания (орехах, хлопьях, сухофруктах, соках, молоке и т. д.), однако информации о продуктах пчеловодства, включая мед, отсутствует [4].

В Соединенных Штатах Америки контролируется общий уровень микотоксинов в пищевых продуктах, кормах и зерне, который не должен превышать 20 мкг/кг [20].

В Российской Федерации также разработаны нормативные документы, в которых установлены предельно допустимые уровни микотоксинов в пищевых продуктах, кормах и зерне:

- Технический Регламент Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011);

- Технический регламент Таможенного союза «О безопасности мяса и мясной продукции» (ТР ТС 034/2013);

- Технический регламент Евразийского экономического союза «О безопасности рыбы и рыбной продукции» (ТР ЕАЭС 040/2016);

- Технический регламент Таможенного союза «О безопасности молока и молочной продукции» (ТР ТС 033/2013);

- Технический регламент Таможенного союза «О безопасности зерна» (ТР ТС 015/201);

- СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».

Однако требования к микотоксикологической и микробиологической безопасности продуктов пчеловодства отсутствуют в ТР ТС 021/2011 и СанПиН 2.3.2.1078-01.

Пчелиный мед - это продукт жизнедеятельности различных растений и насекомых, получаемый в результате сбора и соответствующей обработки нектара, пади, медвяной росы и пыльцы медоносной пчелой (Apis mellifera Apinae), а затем откладываемый для созревания и хранения в восковые соты. В состав меда входят сахара, органические кислоты, белки, ферменты, гидроксамины, витамины и минералы [2]. На качество пчелиного меда влияет множество факторов, один из них - это сами пчелы.

Пчелы подвергаются воздействию химических веществ из нектара, который они всасывают из цветов, или пыльцы. Пыльца является первоначальным источником контаминации патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, а также плесневыми грибами [5].

Согласно исследованиям, проведенным в Словацкой Республике, в пчелином меде были обнаружены Aspergillus flavus, и особое внимание уделялось плесневым грибам рода Penicillium. В Португалии при исследовании меда обнаружили: Mucor spp., Penicillium spp. и несколько видов типа Aspergillus, особенно A. flavus, A. Candidus, A. fumigatus и A. niger. Другой группе ученых из Португалии при исследовании пчелиного меда из 80 проб удалось обнаружить и идентифицировать только три типа грибов: Aspergillus, Penicillium и Mucor [7, 8].

Исследования, проводимые в Словацкой Республике и Пакистане, подтверждают наличие афлатоксинов в пчелином меде. Согласно результатам исследования, все исследуемые образцы были заражены афлатоксинами в диапазоне 0,5-22 мкг/кг (в среднем 12,5 мкг/кг). Также в исследуемых образцах обнаружен кофеин (в диапазоне от 94 до 3583 мкг/кг, в среднем 1567 мкг/кг), никотин (от 178 до 9389 мкг/кг, в среднем 1567 мкг/кг) и тяжелые металлы (соответствовали предельно допустимым значениям) [3, 4].

Для определения микотоксинов в пищевых продуктах и кормах для животных применяют иммуноферментный анализ (ИФА), а также хроматографические методы исследования. Для определения микотоксинов хроматографическими методами применяют: тонкослойную хроматографию (ТСХ), жидкостную (ЖХ), газовую (ГХ), высокоэффективную жидкостную (ВЭЖХ) и их сочетания с масс-спектрометрическим (МС) и флуоресцентным детектированием [1, 11, 15].

В настоящее время в России широко используются методы определения микотоксинов с помощью ТСХ и ВЭЖХ. Тонкослойная хроматография - достаточно простой и быстрый способ в определении микотоксинов и других химических веществ, однако данный метод обладает достаточно высоким уровнем погрешности и в точности уступает жидкостным и газовым хроматографам.

Газовую хроматографию с различными детекторами применяют для исследования трихотеценовых микотоксинов. Трихотеценовые микотоксины - это вторичные метоболиты микроскопических грибов рода Fusarium, Stahybotrys, Trichoderma, Cephalosporium, Trichothecium и Mizothecium. К ним относят Т-2 токсин, диацетоксискирпенол, ниваленол и дезоксиниваленол (вомитоксин) [1, 6].

Высокоэффективная жидкостная хроматография также применяется для определения микотоксинов, так как позволяет проводить исследование более 100 образцов одновременно, и прибор обладает высокой чувствительностью. При помощи ВЭЖХ исследуют трихотеце- новые микотоксины, афлатоксины (В1, В2, G1, G2). К минусам метода можно отнести долгое время проведения одного испытания и отсутствие чувствительности метода ко всем микотоксинам.

Для определения афлатоксинов применяют обращенно-фазовую ВЭЖХ с флуоресцентным детектированием и колонки, заполненные силикагелевым сорбентом с привитыми алкильными группами С18 и С8.

Целью и задачей работы является определение загрязненности микотоксинами продуктов пчеловодства и меда в образцах, отобранных в субъектах Российской Федерации в период с 2020 по 2022 год.

Материалы и методы. Исследования проводились на кафедре «Ветеринарносанитарной экспертизы и биологической безопасности» ФГБОУ ВО «Московский государственный университет пищевых производств» (ФГБОУ ВО МГУПП) и в отделе химикотоксикологических исследований ФГБУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория (ФГБУ ЦНМВЛ) в период с 2020 по 2022 гг.

Исследования проводились в соответствии с ГОСТ 34140.

Хроматографическому исследованию подверглись 28 образцов меда и продуктов пчеловодства из Московской и Иркутской областей, а также из Республики Бурятия.

Так как в настоящее время отсутствует методика по определению микотоксинов в меде и продуктах пчеловодства, в нашем исследовании применяли два метода первичной подготовки проб: QuEChERS и метод жидкостного экстрагирования ацетонитрилом.

Для определения микотоксинов использовали жидкостной хромато-масс-спектрометр LCMS-8060 производства SHIMADZU.

Результаты исследований

Для определения микотоксинов в меде и пчеловодческой продукции были применены два метода первичной подготовки проб: метод жидкостного экстрагирования ацетонитриллом и метод QuEChERS.

Методом жидкостного экстрагирования ацетонитриллом не удалось выделить искомые микотоксины (афлатоксин В1, афлатоксин В2, афлатоксин G1, афлатоксин G2, охраток- син А, Т-2 токсин, дезоксиниваленол, зеараленон, патулин).

В таблицах 1 и 2 представлены результаты исследований образцов меда и продуктов пчеловодства на микотоксины методом QuEChERS.

Таблица 1 - Результаты хроматографического исследования микотоксинов в продуктах пчеловодства с пасеки Чеховского района Московской области