Методы определения активности сахаразы в меде

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

Пчелиный мёд -- один из сложнейших естественных продуктов, в составе которого обнаружено более четырехсот различных компонентов.

Мёд представляет собой продукт переработки нектара или пади медоносными пчелами. Сущность процесса образования мёда сводится к тому, что нектар сначала в организме пчелы, а затем в сотах претерпевает существенные изменения. В нектар попадают из желез пчелы ферменты и муравьиная кислота; сахароза расщепляется на глюкозу и фруктозу, уменьшается количество влаги и увеличивается вязкость. Созревания мёда в сотах длится от 7 до 10 дней. Следует отметить, что химический состав мёда непостоянен и зависит от вида медоносных растений, с которых собран нектар; почвы, на которой они произрастают; погодных и климатических условий; времени, прошедшего от сбора нектара до извлечения меда из сотов; сроков хранения меда. Однако основные группы веществ в составе меда постоянны.

Средний химический состав мёда, полученный при анализе образца объёмом 500 куб. см и весом 725 г.

фермент мед пчелиный сахараза

Средние значения основных составляющих меда (% в пересчете на безводный остаток) приведены ниже.

· Редуцирующие сахара -- всего 89,3%. В том числе:

Ш глюкоза 44,3%

Ш фруктоза 41,2%

Ш сахароза 2,2%

· Зольные элементы 2,58%

· Вода 18,2.%

Углеводы - это основные вещества, входящие в состав меда (95--99 % сухого вещества). Содержание отдельных углеводов в меде колеблется в довольно широких пределах. Оно зависит от ботанического происхождения меда, условий сбора и переработки нектара (пади) пчелами. Углеводы меда представлены в основном моносахаридами -- глюкозой и фруктозой. На их долю приходится около 90 % всех сахаров меда.

Свойства этих моносахаридов определяют основные качества меда: его сладость, питательную ценность, способность к кристаллизации, гигроскопичность и т. д.

Глюкоза негигроскопична, легко кристаллизуется и малосладкая.

Фруктоза очень гигроскопична, почти не кристаллизуется, в 2 раза слаще глюкозы. В закристаллизованном меде фруктоза обволакивает кристаллы глюкозы, сахарозы и других, хорошо кристаллизующихся сахаров. Отношение фруктозы к глюкозе (Ф/Г) в большинстве случаев близко к 1. Чем выше этот показатель, тем меньше мед склонен к кристаллизации. Глюкоза и фруктоза усваиваются организмом человека без расщепления, при этом выделяется большое количество энергии, необходимой для жизненных процессов.

По качеству мёд на товарные сорта не подразделяют. Доброкачественным считается мёд, имеющий приятный, естественный аромат от слабого до сильного, без постороннего запаха. Вкус мёда обычно сладкий, приятный. Лучшими по вкусу и аромату считаются такие сорта мёда, как липовый, белоакациевый, эспарцетовый, донниковый, клеверный и др. Каждый вид мёда имеет свой специфический аромат. Цвет мёда в зависимости от вида медоноса бывает от бесцветного до окрашенного в желтые, коричневые и бурые тона.

По консистенции мёд может быть жидким или твердым (закристаллизованным). Кристаллизация мёда не является дефектом. Более точно качество мёда, его состав и свойства определяются физико-химическими показателями. По стандарту ГОСТ 19791-87 нормируется влажность, содержание сахарозы, диастазное число, содержание оксиметилфурфурола и т.д.

Глава I. Ферменты, входящие в состав меда

Ферментами называют определенную группу белковых веществ. Эти протеины служат биологическими катализаторами, т.е. делают возможным протекание определенных химических реакций внутри клеток. Процессы обмена веществ в организме основываются на действии этих катализаторов. Ферменты могут производить химические процессы, которые могли бы и сами произойти, но за более продолжительное время. В этих процессах ферменты не изменяются или же изменяются незначительно. Вещества, которые преобразуются под действием энзимов, называют субстратами.

Ферменты попадают в мёд с нектаром и пыльцой медоносных растений, секретом слюнных желёз пчёл, дрожжевой микрофлорой. В мёде различных видов установлено наличие свыше 15 ферментов: диастаза (бетта-амилаза), инвертаза, каталаза, альфа-глюкозидаза, глюкозооксидаза, пероксидаза, кислая фосфатаза, редуктаза, протеаза и др. Самые активные из них -- инвертаза, диастаза и каталаза, которые содержатся в мёде в наибольших количествах.

Главный фермент в меде - инвертаза. Под ее влиянием сахароза распадается на соответствующие ей моносахариды: глюкозу и фруктозу. Инвертаза в меде имеет двоякое происхождение: меньшее количество ее получается из нектара, выработанного в нектарниках, а большее - из слюны пчел. Независимо от концентрации сахарозы в нектаре и от количества инвертазы этот фермент не может достичь полного расщепления сахарозы. Молодые и сильные пчелы-работницы обладают слюнными железами с оптимальным производством слюны и оптимальным потенциалом действия, чего не наблюдается у старых и слабых пчел.

Амилаза (диастаза) - ценный фермент не только как катализатор при расщеплении крахмала, но имеет значение и для контроля над медом. И амилаза, и инвертаза имеют растительное и животное происхождение. Амилаза всегда находится в меде, который получен из нектара, достаточно обогащенного слюной пчел. О том, насколько мед чист, испорчен или фальсифицирован, можно судить по присутствию в нем диастазы. Количество диастазы в меде является одним из основных показателей для определения качества меда. При этом определение количества диастазы само по себе несложно. Кроме того, диастаза по отношению к неблагоприятным условиям является самым устойчивым фактором в сравнении с другими ферментами меда. Количество диастазы в меде обусловливается теми же факторами, что и наличие инвертазы. В меде, подверженном разложению и порче, количество диастазы повышено и прямо пропорционально степени его разложения. Увеличение диастазы, которое обыкновенно склонны считать указанием сохранности качества меда, в данном случае является показателем разложения и порчи меда. В этих случаях диастаза есть продукт дрожжей, вызывающих разложение.

Глюкозооксидаза - это энзим, который преобразует глюкозу через глюконолактон в глюконовую кислоту и перекись водорода . С перекисью водорода образуется вещество, обладающее бактерицидным действием. Ему приписывают «ингибиновое действие» меда. Глюконовая кислота и перекись водорода имеют большое значение для консервации меда в улье. Оптимальным для активности глюкозооксидазы является показатель рН 6. Этот энзим чувствителен к воздействию света, поэтому рекомендуется по возможности держать мед в темноте.

Другие обнаруженные в меде энзимы - это каталаза и различные фосфатазы. Каталаза относится к пероксидазам, т.е. этот энзим расщепляет перекись водорода на воду и кислород. В некоторых процессах обмена веществ за счет оксидаз образуется перекись водорода, которая сразу снова расщепляется каталазами. В мед каталаза попадает, вероятно, с пыльцой.Была обнаружена кислая фосфатаза типа моноэфира фосфорной кислоты.

Некоторые ферменты меда, хотя и находятся в нём в малых количествах, активно действуют на белки, жиры и промежуточные вещества, образуемые при их разложении в клетках живого организма. Комплекс ферментов меда создаёт условия, при которых все вещества мёда могут быть разложены и использованы в клетках живого организма пчелы. Например, все составные части мёда полностью усваиваются зимующей пчелой без какого-либо участия её собственных пищеварительных ферментов. По этой же причине мёд является продуктом, ценным в диетическом и лечебном отношении.

1.1 Характеристика ферментов мёда

Сахараза (инвертаза)

Инвертаза, или сахараза -- фермент, расщепляющий сахарозу на простые сахара -- глюкозу и фруктозу. Инвертаза - гликопротеин, с молекулярной массой 47-270 кДа. Углеводная часть молекулы составляет у инвертазы дрожжей 30-80%, мицелиальных грибов - 10-12%. Некоторые инвертазы имеют четвертичную структуру и состоят из двух или четырех субъединиц молекулярной массы около 50 кДа.

Инвертаза дрожжей сахаромицетов, грибов аспергиллов и пенициллов проявляет максимальную активность при рН 4,0-4,5 и температуре 45-55°С, стабильна при температуре до 60° С.

В созревающем меде происходит разложение сложных Сахаров нектара на простые сахара меда, образование некоторых новых веществ и удаление из нектара излишней влаги. Первые два процесса проходят при помощи ферментов, вырабатываемых в организме пчел. Удаление влаги из нектара начинается еще в организме пчел, когда избыток воды с помощью ректальных желез передается в прямую кишку пчелы и оттуда выводится наружу во время полета. Оно продолжается и в гнезде пчел, когда принесенный нектар распределяется по ячейкам сотов в виде напрыска.

Наиболее быстрая ферментативная реакция происходит с 10--15%-ными растворами инвертазы, при оптимальной температуре 40 °С.

Инвертаза отщепляет концевой невосстанавливающий в-1,2-связанный остаток фруктозы не только от сахарозы, но и от других олигосахаридов, частично гидролизует инулин. При гидролизе рафинозы из одной ее молекулы образуется по одной молекуле лактозы и фруктозы.

Инвертаза имеет трансгликозилазную способность и может переносить фруктозил с сахарозы на другие олигосахариды. Единичная реакция переноса приводит к образованию нового сахарида с фруктозильным остатком на конце и одной молекулы глюкозы, освобождающейся из сахарозы при отделении фруктозила. Из сахарозы по механизму трансгликозилирования могут синтезироваться полифруктозиды, например, леван.

Инвертазу выделяют из культур дрожжей и микроскопических грибов. У дрожжей инвертаза локализована в клеточной стенке, где связана с маннаном. Фермент освобождается из клетки в процессе автолиза.

Дрожжевая инвертаза требует для стабилизации присутствия сахарозы или глицерина. Необходимость в стабилизаторах объясняется тем, что внутриклеточные ферменты при переходе в свободное состояние утрачивают стабильность, которая внутри клетки обеспечивалась естественной иммобилизацией на соответствующих структурах.

Диастаза (б-амилаза)

Группа ферментов, гидролизующих крахмал (амилолитических), включает: б-амилазу, в-амилазу, глюкоамилазу, б-глюкозидазу, изоамилазу, пуллуланазу. б-Амилаза (б-1,4-глюкан-4-глюканогидролаза, К.Ф.3.2.1.1) является ферментом эндо-типа, гидролизующим б-1,4-гликозидные связи в крахмальных полисахаридах и гликогене.

б-Амилазы обнаружены у животных (в слюне и поджелудочной железе), в растениях (проросшее зерно пшеницы, ржи, ячменя), они вырабатываются плесневыми грибами и бактериями.

Действие б-амилазы на крахмал характеризуется быстрым снижением вязкости раствора и молекулярной массы олигосахаридов. Фермент имеет выраженное сродство к гликозидным связям, удаленным от конца молекулы.

Расщепление гликозидной связи происходит между атомом кислорода и С1-атомом глюкозного остатка. Атака субстрата носит случайный характер и может быть как единичной, так и множественной, когда от субстрата последовательно отщепляется нескольку фрагментов. Гидролизу подвергаются олигосахариды, содержащие менее 3 глюкозных единиц. При гидролизе амилопектина в продуктах гидролиза, наряду с олигосахаридами линейного строения, присутствуют б-декстрины, представляющие собой не затронутые реакцией разветвленные участки амилопектиновых молекул.

Различные б-амилазы при длительном воздействии на крахмал расщепляют его на смесь олигосахаридов с преобладанием характерных сахаров. Конечный продукт расщепления крахмала - глюкоза образуется в незначительном количестве.

б-Амилазы условно делят на две группы: разжижающие и осахаривающие. К первым относят ферменты, расщепляющие в растворимом крахмале или амилозе не более 40% гликозидных связей, ко вторым - расщепляющие до 60%. Так, осахаривающая амилаза термофильного актиномицета гидролизует амилозу с образованием 77% мальтозы, 17% мальтотриозы, 3,5% мальтопентаозы и 2,5% глюкозы, что соответствует степени расщепления около 47% гликозидных связей. При действии бактериальных амилаз разжижающего типа на растворимый крахмал предельная степень расщепления гликозидных связей составляет от 16 до 30%, при этом в качестве основного продукта гидролиза может обнаруживаться мальтогексаоза, мальтопентаоза или мальтоза. Бактериальные амилазы осахаривающего типа гидролизуют крахмал с образованием до 70% мальтозы и глюкозы. Амилаза микроскопических грибов относится к осахаривающему типу, при гидролизе крахмала образуется до 87% мальтозы и глюкозы.

Образование продуктов расщепления крахмала под действием б-амилазы идет как по механизму гидролитической реакции, так и по механизму трансгликозилирования. Способность к трансгликозилированию более выражена у амилаз осахаривающего типа. В процессе трансгликозилирования образуются олигосахариды, являющиеся хорошим субстратом для реакции гидролиза, что способствует более глубокому расщеплению крахмала, повышению концентрации глюкозы и мальтозы в продуктах реакции.

Большое практическое значение имеет влияние температуры и рН на стабильность амилаз. Быстрое разрушение зерновой б-амилазы при рН 3,3--4,0, например, дает возможность выпекать ржаной хлеб из муки, которая содержит избыток б-амилазы, при низких значениях рН, чтобы предотвратить излишнее декстринирование крахмала и образование клейких веществ в мякише хлеба.

Оптимальная температура для действия б-амилазы мезофильных штаммов микроорганизмов обычно не превышает 70° С. Амилазы грибов имеют оптимум при 45-60° С. Термофильные бактерии могут синтезировать фермент с оптимумом 85-91° С. Такие ферменты особенно ценятся в промышленном биокатализе.

Говоря о термостабильности б-амилаз различного происхождения, можно расположить их в следующем ряду по мере снижения устойчивости к нагреванию: бактериальные амилазы -- зерновые амилазы -- грибные амилазы.

Глюкозооксидаза

Глюкозооксидаза обладает чрезвычайно высокой субстратной специфичностью по отношению к p - D-глюкозе. При окислении глюкозы образуется эквимолекулярное количество перекиси водорода, которая в присутствии пероксидазы ( КФ 1.11.1.7) окисляет о-толидин. Интенсивность возникшей синей окраски измеряют на ФЭКе при длине световой волны 620 нм.

Глюкозооксидаза представляет собой фермент, содержащий в качестве простетической группы FAD. При окислении глюкозы под действием этого фермента как промежуточный продукт образуется p - D-глюконо - 5-лактон, который затем спонтанно или же с помощью другого фермента - глюконолактоназы - присоединяет воду и превращается в глюконовую кислоту.

Глюкозооксидаза представляет собой желтый кристаллический порошок. Хорошо растворим в воде.

Глюкозооксидаза может найти широкое применение в пищевой промышленности, так как небольшие добавки этого фермента способствуют сохранению качества овощных консервов, сухих дрожжей, стабилизации пива и других продуктов, удаляя следы кислорода и глюкозы.

Глюкозооксидаза - это флавопротеид. Фермент чрезвычайно специфичен, окисляет p - D-глюкозу и практически не окисляет другие сахара. Он применяется для количественного определения глюкозы, особенно в клинических условиях при определении сахара в моче и крови, а также в промышленности для удаления глюкозы из пищевых продуктов, которые должны храниться в высушенном состоянии.

Фермепг глюкозооксидаза катализирует окисление р - Д - глюкозы кислородом воздуха до глюконовой кислоты. Вторым продуктом реакции является пероксид водорода. Оба конечных продукта образуются в количествах, эквимолярных окисленной глюкозе. Пероксид водорода под влиянием фермента пероксидазы окисляет гексацианоферроат калия, который переходит в гексацианоферриат калия, окрашенный в лимонно-желтый цвет. Интенсивность окраски пропорциональна количеству глюкозы. Порядок определения активности и всех связанных с этим работ следующий.

При определении активности глюкозооксидазы в при-сутствии каталазы, последнюю инактивируют. Для этого к 4-5 мл испытуемого комплексного ферментного раствора, содержащего не более 50 ед / мл каталазы, прибавляют 0-5 мл 1 н раствора муравьиной кислоты ( в конечной концентрации 0 1 н) и определяют активность глюкозооксидазы описанным выше методом.

В меде установлены в минимальном количестве некоторые органические кислоты: яблочная, молочная, щавелевая, лимонная, винная и др. Они находятся преимущественно связанными в виде солей. Количество кислот в меде так мало, что не может быть определено весовыми единицами. Эти кислоты происходят из нектара, пади или организма пчелы. Кислотность меда, выраженная цифрами, равна 3,78, но она меняется в зависимости от сорта меда, качества и продолжительности его сохранения. Старый мед или мед, в который при центрифужном откачивании попало больше пыльцы, как и мед, начавший портиться, обладает повышенной кислотностью. Мед, фальсифицированный неинвертированным сахаром, обладает очень низким показателем кислотности, а мед, фальсифицированный искусственно инвертированным сахаром, обладает повышенной кислотностью. При грубом нагревании меда часть фруктозы распадается и при этом образуется муравьиная и левулиновая кислоты, которые увеличивают его кислотность. Обычно муравьиная кислота не находится в меде, как считали до сих пор, а встречается в нем тогда, когда он уже начал портиться.

Глава II. Методы определения активности сахаразы в меде

2.1 Метод определения ферментативной активности амилазы по Шомоди-Нельсону

Метод основан на количественном определении редуцирующих (восстанавливающих) сахаров, образующихся при действии амилазы на в-1,4-гликозидной связи сахарозы при определении в стандартных условиях .

Сущность метода Шомоди-Нельсона заключается во взаимодействии карбонильных групп редуцирующих сахаров с двухвалентными ионами меди и арсено-молибденовым реактивом (реактив Нельсона) с образованием голубого цвета, интенсивность которого определяют колориметрически при длине волны 660 нм. За единицу инвертазной активности принимают количество фермента, действующее на в-глюкозу с высвобождением 1 мкмоля восстанавливающих сахаров (в пересчете на глюкозу), образующихся за одну мин при стандартных условиях: температуре 50?С; значении рН= 4,7; продолжительности гидролиза 10 мин. Содержание редуцирующих сахаров, образующихся в результате ферментативной реакции, определяют колориметрическим методом по Шомоди-Нельсону и рассчитывают по градуировочному графику, построенному для глюкозы. Для расчета инвертазной активности необходимо построить градуировочную кривую зависимости оптической плотности (D595) от количества инвертного сахара в пробе.

2.2 Измерение сахаразы по методу Хадорна

Метод основан на фотоколориметрическом определении редуцирующих (восстанавливающих) сахаров, образующихся при действии амилазы на гликозидной связи сахарозы при определении в стандартных условиях .

Сущность метода Хардона заключается в измерении разности поляризации расщепленного сахарозы за определенное время, при определенных условиях фотоколориметрическом измерением при длине волны 546 нм.

За единицу инвертазной активности принимают разницу показателя поляризации расщепленного сахара, измеренный у четырех проб после нагревания при 40?С раствора меда с рН=4,7. Через определенные промежутки времени четыре раза берут одинаковые объемы и после остановки реакции раствором карбоната натрия фильтруют. Через 3 часа реакция закончена и растворы поляризуются с помощью поляриметра волнами длиной 546 нм. Из разницы поляризации рассчитывается активность сахаразы меда.

Другой метод определения активности сахаразы был предложен Гонтарским. В принципе его метод похож на метод Хадорна. После окончания реакции полученные продукты не поляризуются, а определяются редуцирующие сахара по методу Иссекутца. Метод требует больших временных затрат и очень неточен, поэтому в настоящее время почти не применяется.

Обычным методом определения активности сахаразы для Немецкого союза пчеловодов является метод Зигенталера . В этом случае с помощью фотометра измеряется снижение концентрации расщепляемого сахаразой химического раствора. Определение активности инвертазы по методу Зигенталера (1977), основанному на спетрофотометрическом измерении разложения п-нитрофенила-б-D-глюкопиринозида на п-нитро-фенол при 400 нм. Результаты выражены в единицах энзима/кг.

Цель данной работы состоит в определении сокращения активности инвертазы, в течение нагрева при различных температурах для изучения таким образом сочетания данных параметров как показателей подогревания.

Инвертазу определяли по методу Зигенталера, налаженному Европейской Комиссией для Меда. Активность энзима определяли фотометрически путем измерения распада субстрата п-нитрофенила Ь-D-глюкопиранозида в п-нитрофеноле (обладающем максимальной абсорбцией 400 нм). Результаты выражали числом инвертазы (NI) и в мг/кг. NI указывает на объем сахарозы на грамм, гидролизованный в течение часа энзимами, содержащимися в 100 граммах меда в условиях теста.

Пробы меда нагреваются на воде (t ?С = 70?С) в течение трех с половиной часов (t ?С = 65 ?С) в меде после обработки). Такие температуры часто применяются для разжижения кристализованного меда.

Свежесть проб проверяют путем определения ГМФ.

Все результаты статистически обрабатываются.

Заключение

Инвертаза в основном используется в пищевой (кондитерской) промышленности, где фруктоза предпочтительнее, чем сахароза, потому что она слаще и не кристаллизуется, так легко. Однако использование инвертазы весьма ограничена, так как другой фермент, глюкозо-изомеразы, могут быть использованы для превращения глюкозы во фруктозу более недорого. Для здоровья и вкуса причинам, его использование в пищевой промышленности требует, чтобы инвертазы был высокой степени очистки.

В отличие от большинства других ферментов, инвертаза демонстрирует относительно высокую активность в широком диапазоне рН (3,5 - 5,5), при оптимальном рН около 4,5. Активность фермента достигает максимума при приблизительно 55 ° С. Константа Михаэлиса-Ментена различных ферментов широко варьируют, но в большинстве ферментов Км составляет от 2 до 5 мМ. Константа Михаэлиса-Ментена для свободного фермента составляет обычно около. 30 мМ.

Список литературы

1. http://garik1960.flybb.ru/topic961.html

2. http://www.malihin.com/vse-o-mede/166-sostav-meda.-proteiny-v-mede..html

3. http://apilak.com/honey-fermenti.html

4. http://use-mead.ru/fermenty.htm

5. http://medoviy.ru/?razdel=glav&typeslovar&idn=1163

6. http://food-chem.ru/lektsii-po-fermentam/16-invertaza.html

7. http://www.ngpedia.ru/id644785p1.html

8. Младенов, Ст. Мёд и медолечение - Кишинев: София, 1969 г., 113 стр.

9. Шмелева, В.Г. Методы определения активности ферментов. Санкт-Петербург, 1997 г.

10. Национальный Стандарт Российской Федерации Препараты Ферментные Москва, Стандартинформ, 2011г., стр. 17

Размещено на Allbest.ru