Ферментативные методы анализа пищевых продуктов

Размещено на http://www.allbest.ru/

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РБ

УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ «ГРОДНЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Специальность Технология хранения и переработки животного сырья

РЕФЕРАТ

на тему: «Ферментативные методы анализа пищевых продуктов»

Выполнила: Кузьмицкая Дарья

ГРОДНО 2014

Содержание

• Введение
• Использование ферментативных методов анализа
• Список используемой литературы

Введение

Ферментативные методы анализа, основаны на использовании химических реакций с участием ферментов. О содержании определяемого компонента судят либо по кол-ву конечного продукта ферментативной реакции, либо, чаще, по начальной скорости процесса, положенного в основу методики определения (см. Кинетические методы анализа). Для наблюдения за скоростью ферментативной реакции применяют обычно инструментальные методы, чаще других - люминесцентные, спектрофотометрические, электрохимические. Достоинства ферментативных методов анализа: высокая чувствительность, обусловленная активностью ферментов, природой индикаторных реакций (с помощью которых определяют в-во) и способами детекции аналитического сигнала; высокая селективность и мягкие условия проведения анализа.

Определяемым компонентом в ферментативных методах анализа могут быть субстраты (вещества, превращение которых катализирует фермент), сами ферменты, коферменты (вещества, необходимые для осуществления каталитического действия фермента) и эффекторы (изменяющие каталитическую активность фермента - активаторы, ингибиторы). Среди коферментов - НАД и НАДН (соотв. никотинамидадениндинуклеотид и его восстановленная форма), НАДФ и НАДФН (соотв. никотинамидаденинди-нуклеотидфосфат и его восстановленная форма), АТФ (аде-нозинтрифосфат).

ферментативный пищевой продукт биотехнологический

Использование ферментативных методов анализа

Основными преимуществами применения ферментативных методов в научных исследованиях, при разработке новых пищевых технологий и биотехнологических процессов, а также при анализе качества, идентификации и установления фальсификации продуктов питания и пищевого сырья являются:

1. Высокая специфичность и достоверность результатов. Высокоспецифичные ферментативные методы анализа дают, как правило, более достоверные результаты, чем неспецифические химические методы. Специфичность действия ферментов, основанная на комплементарное™ пространственной конфигурации активного центра и субстрата является гарантом достоверности и надежности ферментативного метода при исследовании отдельных соединений в многокомпонентных смесях, имеющих сложный состав и строение, таких, какими и являются пищевые продукты. При разработке ферментативных методов и подборе реагентов, в первую очередь, выбирают ферменты с наибольшей специфичностью действия, для которых подбираются оптимальные условия проведения анализа. Кроме того, при разработке методов ферментативного анализа отдельных компонентов продуктов питания обычно используют несколько ферментов, которые последовательно функционируют в данной системе.

2. Простые способы подготовки проб, которые исключают потерю исследуемых компонентов. Основная задача, которую необходимо выполнить при подготовке пробы, -- по возможности наиболее полно сохранить для анализа исследуемый компонент без его количественной потери или изменения структуры. В некоторых случаях возможен прямой анализ пробы без ее предварительной подготовки (например, при абсолютной специфичности фермента к исследуемому веществу и отсутствии в пробе каких-либо мешающих факторов). Обычно же для ферментативного анализа используются простые и хорошо известные способы подготовки проб, такие как: разбавление, фильтрация (центрифугирование), нейтрализация (подкисление), экстракция, обезжиривание, осветление, обесцвечивание. Только в определенных случаях применяют специальные способы подготовки проб, например, при определении водонерастворимых соединений (холестерин, лецитин, крахмал), нестабильной L-аскорбиновой кислоты в твердых материалах и др.

3. Простая и быстрая процедура измерений, которая исключает использование дорогостоящего оборудования. В большинстве ферментативных определений используют фотометрические способы измерения результатов. Для этого все компоненты искусственной тестовой системы, например, буфер, коферменты, активаторы, вспомогательные ферменты и пробу смешивают в фотометрической кювете. После измерения начальной оптической плотности добавляют стартовый фермент, который инициирует реакцию. В конце реакции (через определенный промежуток времени) повторно измеряют оптическую плотность тестовой системы. Из разницы оптических плотностей в начале и в конце реакции по уравнению закона Ламберта -- Бера рассчитывают концентрацию С (г/л) искомого соединения.

C = [(E 2 - E 1) опыт - (E 2 - E 1) контроль]•V•M•F

е?d?v?10000

где (E ₂ - E ₁) _опыт -- разница конечной и начальной оптической плотности в кювете с пробой; (E ₂ - E ₁) _{контроль}-- разница конечной и начальной оптической плотности в кювете без пробы; V -- общий объем реакционной смеси, мл; М -- молярная масса искомого соединения, г/моль; F -- фактор разведения пробы; е -- молярный коэффициент экстинкции (например, кофермента НАДФ/НАД при л = 340 нм, е = 6,3 л/ммоль • см); d -- толщина кюветы, см; v -- объем пробы, добавляемый в кювету, мл.

В большинстве ферментативных методов прямому фотометрическому контролю доступно измерение таких вспомогательных компонентов тестовой системы, как коферментов НАД⁺/ПАДН или НАДФ⁺/НАДФН. Количество восстановленных или окисленных коферментов прямопропорционально количеству искомого соединения. Система конечных значений с фотометрическим измерением результата настолько надежна, что служит в качестве стандарта для оценки других методик. Для проведения ферментативного анализа используется стандартное оборудование, которое имеется практически в любой производственной лаборатории: спектрофотометры или фотометры с интервалом измерений от 325 до 800 нм; кюветы для фотометрических измерений, мерные пипетки и дозаторы, весы, центрифуга, рН-метр, водяной термостат, фильтры и т. п.

4. Высокая чувствительность метода и хорошая воспроизводимость результатов. Высокая чувствительность позволяет использовать ферментативные методы для определения следовых количеств веществ. Например, в продуктах питания могут быть определены следующие концентрации компонентов (г/л): этанол -- 0,001; ацетоальдегид -- 0,001; лимонная кислота -- 0,002; глицерин -- 0,001; D-глюкоза -- 0,002; D-сорбит -- 0,001; лактоза -- 0,005; нитраты -- 0,001.

Кроме вышеперечисленных достоинств ферментативных методов анализа можно назвать и универсальность применения, высокую надежность и устойчивость к мешающим факторам, низкие затраты на проведение анализа (время, оборудование, расходуемые материалы), а также использование безопасных реактивов.

Области применения ферментативного анализа на практике многообразны. Это и производственный контроль, и контроль качества готовой продукции, а также контроль сырья, анализ состава пищевого продукта с целью установления их свойств и соответствия законодательным нормам, оценка гигиенического статуса, идентификация и установление фальсификации.

Определение первичной структуры белков сводится к выяснению порядка расположения аминокислот в полипептидной цепочке. Эту задачу решают с помощью метода секвенирования (от англ. sequence последовательность).

Собственно секвенирование на его сегодняшнем уровне позволяет определить аминокислотную последовательность в полипептидах, размер которых не превышает несколько десятков аминокислотных остатков. В то же время исследуемые полипептидные фрагменты значительно короче тех природных белков, с которыми приходится иметь дело. Поэтому необходимо предварительное разрезание исходного полипептида на короткие фрагменты. После секвенирования полученных фрагментов их необходимо снова сшить в первоначальной последовательности.

Таким образом, определение первичной последовательности белка сводится к следующим основным этапам:

1) Расщепление белка на несколько фрагментов длиной, доступной для секвенирования.

2) Секвенирование каждого из полученных фрагментов.

3) Сборка полной структуры белка из установленных структур его фрагментов.

Для специфического расщепления белков по определенным точкам применяются как ферментативные, так и химические методы. Из ферментов, катализирующих гидролиз белков по определенным точкам, наиболее широко используют трипсин и химотрипсин. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, расположенных после остатков лизина и аргинина. Химотрипсин преимущественно расщепляет белки после остатков ароматических аминокислот - фенилаланина, тирозина и триптофана. При необходимости специфичность трипсина может быть повышена или изменена. Например, обработка цитраконовым ангидридом исследуемого белка приводит к ацилированию остатков лизина. В таком модифицированном белке расщепление будет проходить только по остаткам аргинина. Наиболее специфичными и перспективными методами определения сахаров считаются методы, основанные на использовании чистых ферментов. Так, глюкозу в биологических жидкостях определяют с помощью фермента глюкозооксидазы. Этот фермент окисляет глюкозу до глюконовой кислоты, при этом в реакции образуется перекись водорода; ее расщепляют ферментом пероксидазой, и образовавшийся в реакции атомарный кислород окисляет какой-либо краситель до окрашенной формы. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию в пробе глюкозы. Метод унифицирован и широко распространен во многих клинико-диагностических лабораториях. Для определения глюкозы были разработаны также методы с использованием фермента гексокиназы, которая при участии аденозинтрифосфата превращает глюкозу в глюкозо-6-фосфат; в реакции образуется также аденозиндифосфат. Далее определяют глюкозо-6-фосфат с помощью глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы или содержание аденозиндифосфата с помощью пируваткиназы и лактатдегидрогеназы. Гексокиназные методы точны и специфичны, но используются редко из-за дефицита и высокой стоимости чистых ферментов. Специфическое определение галактозы в крови больных с галактоземией проводилось с помощью галактозооксидазы -- фермента по своему действию близкого к глюкозооксидазе.

Проблема идентификации сахаров в биологических жидкостях возникла вследствие необходимости диагностировать различные мелитурии, болезни накопления, а также с целью установления строения олигосахаридов. Первые методы идентификации были качественными пробами на определенные виды сахаров. Они основывались на образовании различных видов озазоновых и гидразоновых кристаллов моносахаридов, на сбраживании сахаров различными микроорганизмами, на различной способности моносахаридов образовывать фурфуролы. Пентозы в моче обнаруживали пробами с флороглюцином, орцином, бензидином и др.; фруктозу -- резорциновым, тиобарбитуровым и другими методами; галактозу и лактозу -- по образованию белой слизевой кислоты в присутствии азотной кислоты; дезоксисахара (фукозу, дезоксирибозу и др.) -- методами Дише по дифениламиновой реакции в кислой среде; сиаловые кислоты после их гидролитического отщепления от гликопротеидов определяли по реакции Гесса с серной и уксусной кислотами или по реакции с тиобарбитуровой кислотой; сахарозу -- по кислотному или ферментативному гидролизу и образованию глюкозы и фруктозы. Все ферментативные методы определения сахаров являются также и методами их идентификации.

В основе метода ферментативного определения концентрации липидов лежат специфические взаимодействия двух типов ферментов - эстеразы и оксидазы - со своим субстратом, то есть веществом, относящимся к специфическому классу липидов. В случае, например, метода определения концентрации холестерина - это холестерол-эстераза, гидролизующая сложные эфиры холестерина, и холестерол-оксидаза, окисляющая образовавшийся в предыдущей реакции холестерин с образованием в качестве одного из продуктов реакции пероксид водорода.

Количество образовавшегося при работе системы ферментативного определения концентрации липидов пероксида водорода (перекись) пропорционально содержанию определяемого липидного компанента крови (холестерина, фосфолипида или триглицерида). Конечной реакцией тест-системы такого рода является взаимодействие пероксида водорода с 4-аминофеназоном и фенолом с образованием 4-(p-бенозохинон-моноимино)-феназона, эффективно поглащающего свет с длиной волны 500 нм. Фотометрическая абсорбция, измереная при 500 нм, отражает содержание холестерина, фосфолипидов или триглицеридов крови (в зависимости от использованой тест-системы) и легко может быть переведена в значения концентрации или молярной концентрации.

Список используемой литературы

1. Нечаев А.П., Траубенберг Светлана Евгеньевна, Кочеткова Алла Алексеевна, Нечаев А.П. Пищевая химия, 2003

2. Лит.: Долманова И. Ф., Угарова Н.Н., "Ж. аналит. химии", 1980, т. 35, в. 8, с. 1597-1639;

3. http://www.xumuk.ru

Размещено на Allbest.ru