Современные возможности исследования ДНК животных при раскрытии и расследовании экологических преступлений

Статья посвящена проблеме установления видовой принадлежности особо ценных диких животных, занесенных в Красную книгу Российской Федерации и (или) охраняемых международными договорами Российской Федерации, которые могут являться объектами незаконной добычи и оборота. Браконьерство и незаконная охота являются одним из самых распространенных видов экологических преступлений, что обусловливает актуальность указанной проблемы.

Авторами проведен анализ и показаны возможности применения различных типов молекулярных маркеров (ДНК-маркеров) для установления видовой принадлежности животных, а также использования баз данных нуклеотидных последовательностей ДНК животных при проведении ДНК-анализа в рамках раскрытия и расследования преступленный указанных категорий. На примере подбора праймеров для гена COXI бурого медведя рассмотрен порядок работы в специальных онлайн-программах.

В статье показано, что применение молекулярно-генетических методов видового определения животных для решения экспертных задач при расследовании преступлений в сфере экологии позволило бы дополнить не только механизмы по противодействию незаконной охоте, но и порядок рассмотрения дел, отнесенных к мошенничествам с продуктами питания.

of Examination and Expert-Criminalistic Support for Counteraction

to Drug-Related Crime, Directorate of Scientific Research

of the Expert-Criminalistic Center of the Ministry of the Interior of Russia;

of the Directorate of Biological Examinations and Records

of the Expert-Criminalistic Center of the Ministry of the Interior of Russia

The article is devoted to the problem of determining the species of particularly valuable wild animals listed in the Red Book of the Russian Federation and (or) protected by international treaties of the Russian Federation, which can be objects of illegal hunting and trafficking. Poaching and illegal hunting are one of the most common types of environmental crimes, which makes this problem especially relevant. генетический экспертный преступление

The authors analyze and demonstrate the possibilities of using various types of molecular markers (DNA markers) to determine the species of animals as well as using databases of nucleotide sequences of animal DNA during the DNA analysis while solving and investigating crimes of these categories. By the example of the selection of primers for the brown bear COXI gene, the order of working with special online programs is analyzed.

The article shows that the use of molecular genetic methods of determining the species of animals for solving expert problems in investigation of environmental crimes would improve not only the mechanisms of counteraction to illegal hunting, but also the procedure of consideration of cases related to fraud in the sphere of food products.

Key words: environmental crimes, illegal hunting, wild animals, clearance and investigation of crimes, examination of the scene of an incident, bioresources, forensic DNA analysis, molecular genetic examination, DNA markers, polymerase chain reaction, identification of animals, databases.

* * *

Экологическая преступность многообъектна и затрагивает все сферы жизнедеятельности человека. В результате грубого вмешательства в процессы, происходящие в природной среде, при совершении отдельных видов экологических преступлений причиняется вред окружающей среде в целом, который порой имеет невосполнимый характер. Анализ уголовно-правовой статистики последних лет показывает, что в общей структуре преступности доля зарегистрированных экологических преступлений составляет в среднем 1,3 %, а в структуре экологических преступлений доля деяний, объектами посягательства которых являются животные, - 12,5 % [1].

Масштабы преступлений против дикой природы в мире велики. Оборот ресурсов дикой природы при незаконной торговле составляет в среднем около 20 млрд долларов в год и стоит в пятерке самых дорогих видов международной преступной деятельности после наркобизнеса, изготовления фальшивых денег, работорговли, торговли оружием [2, с. 2]. Наибольшее количество противоправных действий в отношении диких животных, занесенных в Красную книгу Российской Федерации либо охраняемых международными договорами Российской Федерации, осуществляется в отношении ограниченного количества их видов [3]. По данным Российской академии наук, в 2015 г., например, на территории России насчитывалось 245 видов млекопитающих (без китообразных), из которых 65 (20 %) - занесены в Красную книгу Российской Федерации [4]. Все они являются потенциальными объектами браконьерства, нелегального оборота животных редких видов и находящихся под угрозой исчезновения.

Законодательством Российской Федерации предусмотрена уголовная ответственность за совершение преступлений, связанных с незаконными добычей и оборотом, включая хранение, перевозку и продажу диких животных, особенно это касается видов животных, занесенных в Красную книгу Российской Федерации и (или) охраняемых международными договорами страны.

В практике раскрытия и расследования преступлений наиболее распространенным преступным деянием в сфере экологии считается незаконная охота. Объективной стороной преступления является совершение хотя бы одного из перечисленных в диспозиции действий: добыча, содержание, приобретение, хранение, перевозка, пересылка и продажа. В соответствии со ст. 258.1 Уголовного кодекса Российской Федерации предметом преступления являются не только цельные экземпляры (живые или мертвые) особо ценных видов животных, но и их части (шкуры, рога, части туловища, внутренние органы, шерсть животных и др.) и производные (дериваты) (например, экстракты, мази, порошки) [5, с. 686-688].

При расследовании преступлений, связанных с незаконной охотой, выделяются некоторые особенности осмотра места совершения преступления - это размеры территории осмотра (протяженность, обширность, например, лесной участок, прилегающий берег реки, моря и т. д.), удаленность от населенного пункта, подъезды к территории осмотра (при необходимых случаях подготовка транспортных средств повышенной проходимости). Кроме того, осмотру подлежат различные транспортные средства, орудия охоты и т. д., а также разнообразные представители биоресурсов (объектов посягательства). При этом большое значение имеет необходимость сокращения до минимума промежутка времени между моментами совершения преступления и начала осмотра места происшествия.

При определении границ осмотра следует руководствоваться следующим правилом. Для обеспечения максимально полного выявления и изъятия информативных следов и вещественных доказательств необходим тщательный осмотр не только места убийства животного, но и пути подхода браконьеров к данному месту и отхода от него, т. е. местом осмотра должен стать весь участок незаконной охоты, а не только место добычи и разделки туши животного. Все следы и вещественные доказательства, выявляемые при этом, можно разделить на две группы:

- характеризующие как сам факт преступления, так и способ его совершения и сокрытия (например, следы добытых животных и их убийства);

- способствующие установлению лиц, причастных к его совершению, такие как следы орудий преступления, автотранспортных средств, а также следы, традиционные для криминалистики (следы пальцев рук, объектов биологической природы (слюна на табачных изделиях, кровь и т. п.)).

Как правило, после совершения преступления злоумышленники пытаются скрыть факт убийства животного. Так, браконьеры разделывают тушу убитого оленя таким образом, что определить вид данного животного по морфологическим признакам было невозможно. В результате незаконно добытое мясо дикого животного реализуется под видом мяса крупного или мелкого рогатого скота. На этом основании следы биологического происхождения убитого животного, обнаруженные как на месте происшествия, так и на одежде и обуви подозреваемых лиц и их транспортных средствах, могут значительно ускорить и упростить процесс расследования данной категории преступлений за счет сужения пределов доказывания как в отношении события преступления, так и причастных к нему лиц.

В связи с изложенным остро стоит вопрос о необходимости выработки современного методического инструментария для установления видовой принадлежности объектов биологического происхождения и внедрения молекулярно-генетических методов, пригодных для решения типовых задач, при исследовании вещественных доказательств в рамках раскрытия и расследования преступлений рассматриваемых категорий.

В современной генетике (популяционной, сравнительной, молекулярной) в зависимости от развития уровня познания генома организма, выявленных эволюционных отличий от ближайших сородичей и других поставленных задач для видовой идентификации применяются молекулярные маркеры (или ДНК-маркеры). Они представляют собой нуклеотидные последовательности молекулы ДНК, выявляемые методами молекулярной биологии при сравнении генотипов разных организмов и служащие для установления вида животного. С помощью ДНК-маркеров составлены подробные карты геномов десятков видов животных. В молекулярно-генетических исследованиях наиболее широко используются следующие типы маркеров: маркеры полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и полиморфизма длин амплифицированных фрагментов, маркеры участков генов митохондриальной ДНК (мтДНК-маркеры), микросателлиты (STR-локусы), однонуклеотидные полиморфизмы (SNP).

Маркеры полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP-маркер) и полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (AFLP-маркер) стали одними из первых молекулярных маркеров, которые благодаря простоте проведения исследования и некоторой степени надежности в конце 90-х гг. прошлого столетия получили широкое распространение в молекулярной биологии для решения идентификационных задач. По мере того как происходило технологическое и инструментальное совершенствование проведения ДНК-анализа, применение данных маркеров утратило свой первоначальный приоритет. Одними из наиболее значимых причин этого стали: необходимость использования большого количества ДНК для исследования; наблюдаемая у некоторых представителей вида изменчивость анализируемой нуклеотидной последовательности ДНК (потеря диагностической значимости); затруднения в интерпретации результатов исследования.

В настоящее время анализ AFLP- и RFLP-маркеров преимущественно используется в научных целях. Однако, наряду с этим, также известно вполне успешное применение метода исследования полиморфизма длин рестрикционных фрагментов для дифференциации кабана и домашней свиньи (рис. 1). Применяемая методика базируется на исследовании генов меланокортинового рецептора 1 (MC1R) и ядерного рецептора (NR6A1) ДНК. Точность результатов установления принадлежности биологического материала дикому животному составляет не менее 98 %.

Рис. 1. Результаты электрофоретического разделения фрагментов генов MC1R и NR6A1 (1,2 - Кабан, 3, 4 - Свинья домашняя)

Следующие маркеры ДНК - митохондриальные. Они приобрели наибольшую популярность в молекулярно-генетических исследованиях, связанных с установлением видовой принадлежности животного. Это обусловлено с тем, что в отличие от ядерной ДНК митохондриальная ДНК (внехромосомная ДНК) присутствует в клеточной органелле митохондрии многими тысячами копий, имеет небольшой кольцевой геном размером около 16 000 пар оснований. Размер митохондриальной ДНК может варьироваться у различных организмов, но количество генов остается неизменным.

Несмотря на то, что митохондриальный геном не подвергается рекомбинации, его изменчивость достаточно велика из-за высокой частоты мутаций. Изменчивость разных областей митохондриального генома животных неодинакова и увеличивается в ряду: гены субъединиц 12S и 16S рибосомной РНК (самые медленно изменяющиеся гены, они применяются для получения филогенетических схем на различных таксономических уровнях - от видов до семейств или даже отрядов); ген цитохром-с-оксидазы I (частота его мутаций достаточна для того, чтобы можно было дифференцировать один вид животного от другого); ген цитохрома b (высокая эволюционная скорость, но проявляет значительную внутривидовую изменчивость, применяется в качестве маркера для установления межпопуляционного разнообразия, определения происхождения видов и построения филогенетических связей); последовательность D-петли (высоковариабельный участок, он может быть полезен для установления популяционных и межвидовых связей, но мало подходит для определения вида организма, хотя бывают и исключения) (рис. 2).

Рис. 2. Структура митохондриальной ДНК

Результаты молекулярно-генетических исследований показали, что ген цитохром-с-оксидазы I (COXI или COI) является наиболее подходящим в качестве идентификатора для определения большинства видов животных. Это обусловлено тем, что данный ген достаточно изменчив; имеет консервативные участки, к которым можно подобрать универсальные праймеры для определения большого числа видов; имеет небольшую длину исследуемого фрагмента гена (648 пар оснований (п. о.) [6, с. 7-18], размер которого оптимален для анализа с помощью секвенирования по Сэнгеру). С 2004 г. ген цитохром-с-оксидазы I получил общенаучное признание как видовой идентификатор для высших и низших животных и определен в качестве видового маркера для создания единой генетической идентификационной системы ДНК-штрихкодирования организмов Barcode for Life (BOLD) по определению места животного в уже существующей классификации видов. Разумеется, выбор этого гена в качестве ДНК- штрихкода не означает, что другие гены и области митохондриальной ДНК непригодны для установления видовой принадлежности животного. Определение генетического маркера для исследования во многом зависит от степени изученности структуры генома, скорости изменчивости генетического материала у изучаемого вида, а также наличия проверенной и отработанной методики исследования данного вида живых организмов.

МтДНК-маркеры позволяют устанавливать видовую принадлежность различных млекопитающих, рыб и прочих живых организмов, однако ввиду наследования митохондриальной ДНК исключительно по материнской линии не подходят для установления принадлежности исследуемого биологического материала чистокровному животному или гибриду. Данная проблема может быть решена с помощью выявления видоспецифичных маркеров ядерной ДНК - микросателлитов (STR-маркеров).

Исследования ядерной ДНК позволили выявить микросателлитные локусы, специфичные для семейств, родов или видов животных. Видоспецифичные STR-локусы (короткие тандемные повторы - short tandem repeats, STR) являются участками ядерной ДНК, состоящими из тандемов повторяющихся нуклеотидов: моно-, ди-, три-, тетра- и т. д., а повторы от 1 до 15 нуклеотидов называют микросателлитами. Анализ STR-локусов (микросателлитов) был рекомендован Международным сообществом судебных генетиков как один из методов видовой идентификации животных при проведении судебно-генетических исследований. Из-за полиморфности микросателлиты приобрели большую распространенность как вид генетических маркеров при изучении филогеографии и структуры популяций некоторых животных. Данный маркер является удобными инструментом для установления принадлежности биологического материала определенному виду животного, половой принадлежности животного (самка - самец), выявления особей гибридного происхождения.

Развитие высокопроизводительных методов анализа генома способствовало созданию и использованию панелей на основе полиморфизмов единичных нуклеотидов при идентификации происхождения животных. Однонуклеотидный полиморфизм (single nucleotide polymorphism, SNP) - это замена одного основания в последовательности ДНК у представителей одного вида или между гомологичными участками гомологичных хромосом. Хотя SNP менее разнообразны по сравнению с SYR-маркерами, этот недостаток полностью компенсируется благодаря возможности проводить одновременный анализ нескольких десятков и даже сотен SNP. Преимущество анализа "снипов" состоит в отсутствии особых требований к качеству ДНК, анализу результатов, автоматизации процесса генотипирования и использования микрочиповой технологии. Международным обществом генетики животных (ISAG, International Society for Animal Genetics) разработан перечень маркеров SNP для тестирования одомашненных животных [7]. Выбор SNP для включения в панель осуществляется по результатам тестирования видов и подвидов животных. Как отмечают исследователи, маркеры будут полезны при поиске различий между эволюционно родственными видами и подвидами, как в случае диких животных и их одомашненных сородичей.

Следует обратить внимание, что в рамках молекулярного исследования видового определения животных используется метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который основан на способности фермента ДНК-полимеразы осуществлять множественное копирование определенного участка ДНК in vitro при условии введения в состав всех необходимых компонентов (праймеров, раствора нуклеотидов, буфера, ДНК-матрицы). Праймеры (короткие нуклеотидные последовательности) являются одним из ключевых компонентов ПЦР и служат так называемой затравкой для синтеза копий цепей исследуемого (целевого) участка ДНК. Как правило, в ПЦР применяются праймеры, входящие в состав коммерческих наборов. Современные технологии позволили исследователям самостоятельно разрабатывать праймеры с использованием онлайн-программ (PrimerBlast, Primer3plus).

Моделирование праймеров, в том числе к специфическим участкам митохондриальной ДНК для установления видовой принадлежности животного, в программах PrimerBlast и Primer3plus происходит с учетом прогнозирования специфичности связывания "затравки" с целевым участком ДНК, расчета оптимальной температуры отжига праймеров и G-C состава. Порядок работы с данными программами можно рассмотреть на примере подбора праймеров для гена COXI бурого медведя. Следует отметить, что Бурый медведь (Ursus arctos) - крупный хищник, обитающий в Евразии, Северной Америки, России (Республика Карелия, Сибирь, материковая территория Дальнего Востока и Камчатки). В начале ХХ в. бурый медведь почти исчез с территории Северной Европы, а в Скандинавии и Финляндии его популяция достигла своего минимума из-за неконтролируемой охоты. Для дизайна и подбора праймеров при работе с онлайн-программами осуществляется следующее:

1) поиск нуклеотидной последовательности гена COXI в базе данных на сайте Национального центра биотехнологической информации в разделе Nucleotide;

2) определение графического изображения исследуемого гена и координаты его расположения относительно других генов митохондриальной ДНК (рис. 3);

Рис. 3. Графическое изображение гена COXI бурого медведя

3) подбор в системе PrimerBlasts возможных вариантов пар праймеров для гена COXI с детальным описанием физических параметров (длины праймеров, GC-составом (в %), температуры плавления) (рис. 4);

4)

Рис. 4. Графическое изображение и сведения о парах праймеров

5) использование файла FASTA для конструирования праймеров в программе Primer3Plus (рис. 5);

6) проверка специфичности праймеров с помощью программы BLAST.

Рис. 5. Интерфейс программы Primer3Plus

После получения достаточного количества амплифицированных фрагментов исследуемого участка ДНК проводится секвенирование по Сэнгеру, которое основано на включении в синтезируемую цепь фрагмента ДНК терминирующих дидезоксинуклеотидов (ddNTP), меченных флуорохромом, и разделение меченых продуктов с помощью высокоразрешающего капиллярного гель-электрофореза на генетическом анализаторе. Полученные данные переводятся в последовательность оснований ДНК с помощью программного обеспечения, записываются в файл-FASTA и анализируются.

Идентификация животных осуществляется в результате сравнения нуклеотидной последовательности фрагмента гена или целевого участка митохондриальной ДНК, полученной в процессе исследования, с различными нуклеотидными последовательностями ДНК, хранящимися в международных базах данных. Последовательность известного биологического вида, полностью совпадающая с анализируемой, свидетельствует об одинаковом биологическом происхождении.

На данный момент существуют три глобальные базы нуклеотидных последовательностей: GenBank, EMBL и DNA Data Bank of Japan. Наиболее развитой и популярной среди исследователей является GenBank - открытая база данных, содержащая все аннотированные последовательности нуклеиновых кислот, а также закодированных в них белков более чем 100 000 различных организмов. Пополнение базы происходит за счет предоставления исследователями своих научных результатов. Для поиска гомологов нуклеиновых кислот в базе GenBank используют программу BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (рис. 6).

Рис. 6. Интерфейс программы BLAST blastn

Программа BLAST может строить карту локального сходства найденных последовательностей и формировать выравнивание в виде изображения (рис. 7). Во вкладке Taxonomy отображаются данные представителей, имеющие нуклеотидную последовательность ДНК, подобную анализируемой.

Рис. 7. Попарное выравнивание нуклеотидной последовательности (на примере Бурого медведя (Ursus arctos))

Вывод о том, что анализируемая ДНК произошла от животного определенного биологического вида (например, бурого медведя) делается при учете проведенного парного выравнивания, построенного в BLAST.

В настоящее время вопросам развития, совершенствования работы в области установления видового происхождения образцов биологического материала животных и использования данных ДНК-типирования в раскрытии и расследовании экологических преступлений уделяется большое внимание. Необходимо отметить положительный опыт работы в этом направлении белорусских ученых. Так, например, на основании проведенных исследований в ГУ "Научно-практический центр Государственного комитета судебных экспертиз Республики Беларусь" по установлению происхождения образцов биологического материала животных методом ПЦР-ПДРФ разработаны, запатентованы и включены в Реестр судебно-экспертных методик Республики Беларусь следующие методики:

- Методика дифференцирования биологических образцов от Дикого кабана (Sus scrofa) или от Домашней свиньи (Sus scrofa domesticus), разработанная на основе SNP-полиморфизма генов MCR1 и NR6A1 с применением соответствующих SNP-маркеров.

- методика исследования полиморфизма микросателитных локусов для видового определения биологических образцов диких животных семейства Оленевые - Благородный олень (Cervus elaphus), Лось (Alces alces), Косуля европейская (Capreolus capreolus), Лань (Dama dama) и дифференциации их от других парнокопытных (бык, овца, коза, свинья; зубр, кабан) с применением двух наборов микросателлитных локусов (STR-локусов): № 1 (Т 108, Т 501, ВМ 1824, CSSM036, RT24, RT9, DYS392), предназначенного для установления видовой принадлежности образцов лося, оленя, косули, лани, зубра / крупного рогатого скота, и № 2 (Т 108, ВМ 1824, RT9, BL4, МсМ 505, SO766), позволяющего установить принадлежность образца овце, козе или дикому кабану / свинье домашней.

Данные методики успешно применяются при расследовании дел о незаконной охоте на территории Республики Беларусь [8].

В качестве положительного опыта применения мтДНК-маркеров для идентификации животного в рамках раскрытия и расследования преступлений можно привести также следующие примеры. В 2003 г. генетики Wan Q. H. и Fang S. G. в рамках расследования убийства тигра в китайском цирке провели молекулярно-генетическое исследование волоса, обнаруженного на месте происшествия, и фрагмента мышечной ткани, изъятого у продавца мяса. В результате анализа участка гена цитохрома b митохондриальной ДНК они установили принадлежность биологического материала тигру [9].

Таким образом, совершенствование работы по внедрению современных молекулярно-генетических методов видового определения животных в экспертную практику позволит укрепить доказательственную базу при расследовании преступлений в сфере экологии, связанных с незаконной добычей и оборотом диких животных, а также преступлений, связанных с фальсификацией продуктов питания (видового состава мясной продукции). В последнем случае результаты ДНК-анализа будут выступать фактором гарантии достоверности информации о продукции, нанесенной на маркировке.

Список библиографических ссылок