Размещено на http://www.allbest.ru/

Одной из важнейших органических кислот, получаемых путем микробиологического синтеза, является лимонная кислота. Большая ее часть используется в пищевой промышленности, в производстве напитков, кондитерских изделий, сиропов и т.д., а также в фармацевтической промышленности и для технических целей. Растущая потребность в лимонной кислоте, составляющая только для России десятки тысяч тонн, требует новых, более интенсивных и эффективных способов ее получения, также выделения и очистки [1-3].

Рентабельность основного производства лимонной кислоты резко возрастает при расширении дополнительной номенклатуры продукции, в частности солей и эфиров лимонной кислоты. Их применение в пищевой промышленности разнообразна: продукты детского и диетического питания, приготовление фруктовых консервов, желе, сухих напитков, фруктового мороженого, а также моющих средств. Перспективными программами научно-технического прогресса предусматриваются разработки технологий получения цитратов калия и натрия. Ассортимент солей лимонной кислоты составляет более 30 наименований, причем большинство из них пользуется значительным спросом и нуждается в развитии производства на промышленной основе. Весьма перспективны поставки солей лимонной кислоты за рубеж, где их стоимость в 5-10 раз превышает стоимость лимонной кислоты. Эффективная организация таких производств требует перехода на новые прогрессивные технологии и новые высокопродуктивные типы основного технологического оборудования.

Перспективы совершенствования лимонной кислоты состоят в следующем. Во-первых, необходимо расширить сырьевую базу для получения лимонной кислоты и перейти на технологические процессы переработки новых видов сырья, экологически более чистых по сравнению с традиционно используемой мелассой: полупродукты сахарного и крахмалопаточного производства, гидролизаты крахмала, спирта, концентрированные соки сахаросодержащих растений. Применение нового углеводсодержащего сырья имеет ряд преимуществ, что прежде всего выражается в стабильности процесса и высоком выходе лимонной кислоты. Кроме того, оно позволяет отказаться от использования наиболее опасного в экологическом отношении комплексообразования - гексацианоферрата калия.

В природе лимонная кислота встречается довольно часто, главным образом в незрелых плодах цитрусовых, ананасов, груш, инжира, брусники, клюквы и др. Лимоны и апельсины были главными источниками естественной (растительной) лимонной кислоты, которую производили преимущественно в Италии, где в середине XIX в. начали действовать первые заводы по производству кристаллической лимонной кислоты. Затем аналогичные заводы начали действовать в Калифорнии (США), на Гавайских островах и в Вест-Индии.

Для получения лимонной кислоты путем микробного синтеза в лабораторных условиях использовали микромицеты (Aspergillus clavatus, Penicillium luteum, P. citricum, Mucor piriformis, Ustina vulgaris и др.), но для промышленного биосинтеза наиболее подходящим оказался Aspergillus niger. Впоследствии из него было селекционировано множество производственных штаммов для биосинтеза лимонной кислоты из сахарозы.

Многие органические вещества сбраживаются микромицетами и могут быть трансформированы в лимонную кислоту, но максимальный выход получается при биосинтезе из сахарозы или фруктозы. В последнее время успешно завершены эксперименты по биосинтезу лимонной кислоты дрожжами (Candida lipolytica и др.) из парафинов и низших спиртов (этанола) с высоким выходом (80--140%).

Лимонная кислота по объему производства является одним из главных продуктов микробного синтеза. Ее общий выпуск в различных странах достигает 400 тыс. т в год (по данным В. А. Смирнова, 1983). Лимонную кислоту получают в основном из мелассы. Заводы небольшой или средней мощности производят лимонную кислоту поверхностным методом культивирования. Глубинный метод экономически выгоден тогда, когда мощность завода превышает 2500 т лимонной кислоты в год.

Лимонную кислоту широко используют в кулинарии и в пищевой промышленности для приготовления безалкогольных напитков, мармелада, вафель, пастилы и др. Лимонная кислота включена в рецептуры некоторых сортов колбас и сыра, ее применяют в виноделии, для рафинирования растительных масел, для производства сгущенного молока. С помощью лимонной кислоты сохраняются естественные вкус и аромат при длительном хранении в замороженном состоянии мяса и рыбы.

При умеренном употреблении лимонная кислота стимулирует деятельность поджелудочной железы, возбуждает аппетит, способствует усвоению пищи.

Натриевые соли лимонной кислоты стимулируют вспенивание и механическую устойчивость пен, поэтому лимонную кислоту ценят кулинары, ее также применяют для изготовления шампуней и моющих средств. Последнее имеет важное экологическое значение, так как лимонная кислота и ее соли легко поддаются микробиологической деградации при очистке канализационных вод.

Применение находят и побочные продукты ферментации: мицелий грибов и культуральная жидкость. Мицелий высушивают и используют как сырье или добавляют к удобрениям. Недавно предложено использование мицелия как источника хитина, который служит биосорбентом. Хитозан - глюкановый комплекс, полученный их мицелия, обладает лучшими хелатирующими свойствами, чем хитозан животных. В культуральной жидкости обнаружены гидролитические ферменты пектиназа, протеаза, целюлаза и в-глюкозидаза.

Основные способы производства и сырье.

Общепризнано, что производство лимонной кислоты химическими способами экономически нецелесообразно: стоимость сырья значительно выше стоимости мелассы; технология многостадийна, требует применения сильно токсичных реагентов и дает относительно низкий выход целевого продукта. Поэтому не удивительно, что, несмотря на большой прогресс в области химического синтеза различных органических соединений, такие сравнительно простые вещества, как лимонная, молочная и некоторые другие кислоты, до сих пор вырабатывают из сахаросодержащегося сырья с помощью микроорганизмов. Преимущества микробного способа в последовательном ферментативном осуществлении в клетке даже значительно большего числа химических реакций в одну производственную стадию - ферментацию. Это упрощает технологию, увеличивает выход кислот и снижает их себестоимость.

В качестве сырья для ферментативного получения лимонной кислоты в большинстве стран используют мелассу - побочный продукт производства сахара из сахарной свеклы или сахарного тростника.

В США "Miles Laboratories, Inc." перерабатывает глюкозные сиропы, получаемые ферменативным гидролизом кукурузного крахмала, во Франции завод фирмы "Melle - Bezons" - кристаллический сахар (сахарозу). Исследована возможность применения и других видов сырья. Еще в начале ХХ века В.С. Буткевич показал, что лимонная кислота может образовываться при культивировании Aspergillus niger на растворах уксусной кислоты, ацетатов, метилового и этилового спирта как единственных источников углерода. Позднее другими исследователями предложены н-парафины, а в качестве продуцента - дрожжи рода Candida.

В расчете на дешевую арабскую нефть в ряде стран большая надежда возлагалась на н-парафины - один из продуктов ее переработки. Однако ввиду истощения запасов и повышения цен на нефть, относительно небольшого выход парафинов и необходимости их использования в других направлениях они вскоре перестали быть перспективным сырьем. Синтетические спирты уксусную кислоту получают на основе переработки попутных газов нефти и собственно природных газов; источники их не безграничны, к тому же эти виды сырья, как н-парафины, широко используются в отраслях народного хозяйства. При ферментации парафинов, спиртов и уксусной кислоты дрожжами одновременно с лимонной кислотой в значительных количествах образуется изолимонная, чем снижается выход целевого продукта и возникает дополнительная проблема их разделения.

Как источник сырья гораздо надежнее и дешевле побочные продукты переработки растительного сырья, ежегодно возобновляемого в больших количествах. Это прежде всего относится к сахароносам (сахарная свекла и сахарный тростник), дающим сахарный сок, или, при переработки его на кристаллический сахар, мелассу, и в некоторой мере - к крахмалоносам (кукуруза, картофель), к растительным отходам сельского хозяйства и механической переработки древесины.

Меласса как исходное сырье.

Для промышленного производства лимонной кислоты в качестве субстрата применяют мелассу - отход сахарного производства.

Меласса -- оттек (маточный раствор), получающийся при отделении кристаллов сахарозы на центрифугах от последней кристаллизации. В мелассе содержатся несахара сока сахарной свеклы или сахарного тростника, не удаляемые при его химической очистке, и сахароза, которую методом кристаллизации выделять уже экономически невыгодно. При выработке сахара выход мелассы в расчете на безводную колеблется от 3 до 6% к массе сахарной свеклы. С мелассой отходит от 10 до 15% всего сахара, содержащегося в перерабатываемой свекле.

В соответствии с видом исходного сырья для производства сахара различают свекловичную и тростниковую мелассу. В России сахарный тростник не произрастает, но на свеклосахарных и сахарорафинадных заводах перерабатывают импортный тростниковый сахар-сырец на белый сахар-песок и сахар-рафинад. В первом случае получаемую мелассу называют сырцовой; во втором случае, независимо от исходного сырья,-- рафинадной патокой. Производство мелассы в России составляет около 4,5 млн. т в год.

Химический состав свекловичной мелассы.

По внешнему виду свекловичная меласса представляет собой густую вязкую жидкость темно-коричневого цвета со специфическим запахом, обусловленным в основном присутствием триметиламина и диметилсульфида. Это -- лучшее сырье для производства. Ценность его заключается в том, что наряду с высоким содержанием сахара в мелассе содержатся все вещества, необходимые для нормальной жизнедеятельности гриба. Выход лимонной кислоты при использовании ее -- наибольший.

Меласса имеет сложный и непостоянный химический состав, зависящий от почвенно-климатических условий вегетации свеклы, вносимых удобрений, способов уборки, условий и продолжительности хранения, технологии сахароварения и др. Например, механизированная уборка свеклы, транспортировка, доочистка и складирование травмируют корни, способствуя их загниванию при хранении. Корни с не полностью обрезанными головками склонны к прорастанию. Все это ухудшает качество свеклы и мелассы.

В мелассе содержится в среднем 80% сухих веществ и 20% воды. Учитывая состав мелассы, можно предполагать, что значительная часть воды находится в связанном состоянии вследствие гидратации в растворе коллоидов, молекул сахарозы и ионов минеральных веществ.

Сухие вещества. Общее содержание сухих веществ в мелассе непосредственно после фуговки утфеля на сахарном заводе составляет около 85% - реализуемая (товарная) меласса имеет несколько меньшую концентрацию, так как разбавляется водой и конденсатом при промывании и пропаривании трубопроводов, по которым она транспортируется в баки-хранилища. Снижение концентрации препятствует образованию кристаллов сахара при хранении, уменьшает вязкость, что облегчает отгрузку мелассы, особенно в холодное время года, и зачистку баков.

Сухие вещества мелассы слагаются из следующих компонентов (в среднем, % масс.): сахарозы 60,0, безазотистых органических веществ 16,7, азотистых веществ 14,8, и минеральных веществ (золы) 8,5. В свеклосахарном производстве учет ведут по сахарозе - основному продукту, в соответствии с чем другие сахара, полностью или частично используемые грибом, и сумму их называют "ферментируемые сахара".

В качестве минеральных веществ в мелассе содержится около 40% К₂О, от 1,5 до 4,5 % MgO и 7,3 - 13,8% СаО к массе золы.

Около 97% содержащегося в свекле фосфора теряется в процессе сахарного производства (осаждается в основанном на дефекации). При переработке здоровой сахарной свеклы с нормальной натуральной щелочностью в чистой золе содержится 0,2 - 0,6% Р₂О₅, или 0,02 - 0,06% к массе мелассы.

В мелассе присутствуют микроэлементы, количество которых сильно колеблется, что может отражаться как на росте гриба, так и на выходе лимонной кислоты. Элементы - алюминий, железо, кремний и стронций - могут содержаться как в макро-, так и в микроколичествах.

Меласса, пригодная для производства лимонной кислоты, должна удовлетворять следующим требованиям: содержать сухих веществ не менее 75%; сахара по прямой поляризации не менее 46%; инвертного сахара не более 1%; окиси кальция не более 0,7%; диоксида серы не более 0,03%; Р₂О₅ не более 0,05%; жироподобных веществ не более 0,5%. Величина рН должна быть на ниже 6,5. Перечисленные показатели технологического качества мелассы, однако, еще не могут служить надежным критерием ее пригодности для производства лимонной кислоты, и окончательное заключение об этом может быть сделано только по результатам биохимического испытания (опытной ферментации).

Заготовка мелассных сред.

Мелассу заготавливают на сахарных заводах на основании предварительных испытаний по ферментации, в конце сентября - ноябре. Меласса, заготовленная в более поздние сроки, обычно характеризуется пониженным выходом лимонной кислоты. Заготавливают мелассу исходя из 15-месячного запаса.

Меласса считается пригодной для производства лимонной кислоты, если в оптимальных условиях подготовки и ферментации в поверхностных условиях (в стаканах с площадью дна 0,42 дм², концентрации сахара 15%, высоте слоя 9см, продолжительности ферментации 7сут и соответствующем штамме - поверхностном или глубинном) будет получен съем: на мелассе для глубинной ферментации не менее 1800г/(м², сут), для подливов - не менее 1500; на мелассе для поверхностной ферментации - не менее 1400г/(м², сут).

Так как процесс биохимической оценки качества меласс очень длителен, то для поверхностного способа производства лимонной кислоты предложены ускоренные методы: по накоплению инвертного сахара в среде на вторые сутки ферментации и по величине съема на третьи сутки для штаммов Р-l и Р-3. Математическая обработка экспериментальных данных по первому методу подтвердила линейную зависимость, подчиняющуюся уравнению:

у = 57,6 + 15,2х,

где у - прогнозируемый съем лимонной кислоты, г/(м²·сут); х - концентрация инвертного сахара в мелассной среде через двое суток после начала ферментации, г/л.

При наличии на вторые сутки ферментации в культуральной жидкости не менее 90г инвертного сахара в 1л возможен съем, удовлетворяющий требованиям к мелассе.

Второй метод дал также хорошие результаты. Съем лимонной кислоты на седьмые у и на третьи сутки х ферментации выражается уравнением:

у = 526 + 1,03х.

Достаточно высокий коэффициент корреляции (0,885) свидетельствует о тесной связи между у и х. Точность прогнозирования по первому и последнему методам ±10%.

Стерилизация мелассных сред.

При возникновения производства лимонной кислоты предполагали, что благодаря сильному подкислению среды во время ферментации не следует бояться инфекции. Однако, вскоре выяснилось, что это не так и обсеменение посторонними микроорганизмами наносит вред производству.

Наиболее надежным и экономичным способом стерилизации является тепловая - насыщенным водяным паром. Температура должна быть выше летальной для наиболее стойких споровых форм. При преобладании спороносящих бактерий выдерживают температуру 125-130⁰С и экспозицию не меньше 30мин. Нужно добиваться уничтожения всех микроорганизмов (стерильности) среды, но так как в производстве это очень трудно, то для оставшегося пренебрежимо малого (технически допустимого) количества микрофлоры, а также для посторонних микроорганизмов, случайно попавших со сжатым воздухом и другими путями, создают неблагоприятные для развития условия добавлением в среду антимикробных веществ, т.е. проводят защищенную ферментацию.

Формалина, обычно применяемого с этой целью при поверхностной ферментации, достаточно 0,006-0,01% к массе мелассы, большая доза отрицательно действует на кислотообразующую способность А. пigег. Эффективен фурациллин в концентрации 10-15мг/л (добавляют при температуре 50⁰С ), 5-нитрофурилроданид и другие производные фурана.

Испытаны также муравьиная кислота, кремнефтористый натрий, пентахлорфенолят натрия, но они одновременно снижают выход лимонной кислоты. Сульфамидные препараты не подавляют бактерий. Бактерицидные концентрации антибиотиков (млн. ед./м³): стрептомицин 40, биомицин 4, тетрамицин 2, полимиксин 1. Известны рекомендации по применению неомицина, низина, левомицетина, полимиксина, а при вспышке дрожжевой инфекции - леворина. Однако, обладая эффективным антимикробным действием и отсутствием отрицательного влияния на А. niger, антибиотики имеют тот недостаток, что они очень дороги.

Тепловая стерилизация мелассных сред при указанной выше температуре снижает качество их для биохимической переработки. С целью "смягчения" теплового режима целесообразно тепловую обработку проводить в присутствии антимикробных веществ. Снижение температуры без существенного изменения состава питательной среды может быть достигнуто также предварительной обработкой ферментным препаратом, расщепляющим стенки бактерий и спор. Во всех случаях, когда требуется сохранить термолабильные компоненты среды, стерилизацию ведут при более высокой температуре и соответственно меньшем времени, так как с повышением температуры скорость гибели микроорганизмов возрастает быстрее скорости разрушения этих компонентов.

Предложено применение и других методов стерилизации мелассы: различными видами лучистой энергии (УФ-лучи, г-лучи, лазерное излучение), ультразвуком, импульсными электрическими разрядами, наложением электромагнитных полей сверхвысокой частоты, фильтрацией через антимикробные волокна и т.д., но они пока не нашли применения в производстве.

Культура Aspergillus niger - продуцент лимонной кислоты

В настоящее время для ферментации сахарсодержащих сред используют специальные штаммы A. niger. Имеются патенты на применение других видов Aspergillus и других родов, принадлежащих к различным классам микроскопических грибов: A. wentii, A. lichinensis, A. clavatus, A. foetidus, A. awamori, A. carbonarius, A. glaucus, A. fumaricus, A. cinnamoneus, A. aureus, A. lanosus, A. melleus, A. ochraceus, A. gorakphurensis; Penicillium luteum, P. janthinellum, P. restricum, P. adamentzii, P. arenarium, P. olivaceum, P. divaricatum, P. sunguiflaus, P. glaucum; Mucor piriformis; Trichoderma viride; Botrytis sp.; Nematospora corily и др. С производственной точки зрения A. niger и другие мицелиальные грибы имеют существенные недостатки: медленно растут, вследствие чего процесс накопления необходимого количества биомассы продолжителен; большая вязкость культуральной жидкости, переходящая в неньютоновскую область, затрудняет массообмен, в частности снабжение гриба кислородом воздуха, увеличивает расход энергии на перемешивание. Перспективным является поиск и селекция немицелиальных микроорганизмов -- дрожжей, бактерий, которые не имеют отмеченных недостатков. Это особенно желательно для перевода процесса ферментации на непрерывно-проточный.

Морфология Aspergillus niger

Aspergillus niger относится к классу сумчатых грибов (Ascomycetes), семейству аспергилловых (Aspergillaceae), роду Aspergillus, который в настоящее время насчитывает свыше 120 видов. Тело гриба (рис. 4) состоит из бесцветных, сильно разветвленных и переплетенных между собой тонких нитей -- гиф, образующих мицелий (грибницу). Гифы септированы -- разделены поперечными перегородками (септами) на клетки. Диаметр гиф от 3 до 6 мкм.

Рис 1. Aspergillus niger. 1 - гифы; 2 - конидиеносец; 3 - пузырек; 4 - стеригмы первого ряда; 5 - стеригмы второго ряда; 6 - конидии; 7 - опорные клетки.

Для аспергиллов характерен поверхностный стелющийся рост, однако при достаточной аэрации и строгом соблюдении асептики они могут размножаться и в толще твердой и в глубине жидкой среды.

При поверхностном росте возвышаются органы плодоношения -- конидиеносцы, которые отходят от особых опорных клеток мицелия. Конидиеносцы представляют собой утолщенные неветвящиеся несептированные, сильно зернистые на вид гифы длиной до 2000 мкм и более. На концах конидиеносцев появляется перетяжка без перегородки, выделяющая "пузырек" будущей головки. Пузырек округляется, увеличивается до 400 мкм, на его поверхности вырастают радиально расположенные продолговатые одно- или двухрядные клетки -- стеригмы. На свободных концах стеригм размещаются цепочками более мелкие клетки -- конидии. Такое строение головки внешне похоже на наконечник лейки, из отверстий которого льются струйки воды. Отсюда русское название аспергилла -- леечный гриб. Однако точный перевод термина аспергилл -- "косматая голова".

Конидии -- покоящиеся клетки, с минимальным содержанием воды, шаровидной или элипсовидной формы, средним размером в поперечнике 4 мкм. Поверхность конидий -- гладкая, бугристая или шиповатая, черная (откуда и название этого гриба niger) или коричневая с различными оттенками. Окраска конидий определяет цвет всей конидиеносящей поверхности. Число конидий на каждой головке достигает 10 тысяч.

Зрелые конидии очень легко отделяются от головок током воздуха или струей воды. Попав в жидкую питательную среду, они сначала набухают, а затем прорастают, образуя одновременно один или два проростка (гифы), на твердой среде прорастают при наличии капельно-жидкой влаги, почти не набухая. Гифа растет на свободном конце; удлиняясь, дает боковые отростки, которые в свою очередь также удлиняются, ветвятся, переплетаются между собой, образуя колонии, видимые невооруженным глазом. Через 16--20 ч в центральной гифе начинают появляться обособленные клетки, из которых вырастают конидиеносцы. Образование зрелых конидий заканчивается через 3--4 суток.

Рассмотренный способ размножения A. niger называется бесполым. Вообще же аспергиллы могут размножаться и половым путем -- посредством асков, образующихся в плодовых телах. Однако развитие плодовых тел A. niger прекращается на самой ранней стадии и недоразвитые плодовые тела превращаются в плотные скопления сплетенных гиф (склероции). Многие штаммы A. niger склероции не образуют. Гриб может размножаться и вегетативным путем -- отделившиеся от гиф частицы способны самостоятельно расти и образовывать новый мицелий.

Условия жизнедеятельности Aspergillus niger

Жизнедеятельность A. niger проявляется в процессах питания, дыхания, роста и в реакциях на внешние раздражения. Питание и дыхание, необходимые организму для синтеза клеточного вещества и получения энергии, являются основой метаболизма (обмена веществ).

По типу питания аспергиллы относятся к гетеротрофным организмам, усваивающим углерод из органических соединений. Поступление в клетку растворенных в воде веществ происходит путем диффузии и осмоса через всю поверхность тела и регулируется цитоплазматической мембраной. Таким образом организм отбирает из окружающей среды необходимое питание.

Вследствие полупроницаемости цитоплазматической мембраны через нее свободно проникают в основном молекулы растворителя (воды). При этом главной движущей силой диффузии является разность концентраций веществ в окружающей среде и в цитоплазме клетки (перенос по градиенту концентрации) -- пассивная диффузия. Большинство других веществ проходит через мембрану благодаря специальной системе переноса, находящейся в мембране и состоящей из белков-переносчиков и ферментов пермеазы, катализирующих связь субстрата с белком-переносчиком. При участии пермеаз осуществляется перенос одних веществ по градиенту концентрации-- облегченная диффузия, других -- против него--активный транспорт. В первом случае диффузия происходит без затраты энергии, во втором при переносе каждой молекулы субстрата затрачивается одна молекула АТФ (О.И.Колешко).

По сравнению с автотрофами аспергиллы имеют клетки, проницаемые для веществ большей молекулярной массы и обладающие высоким осмотическим давлением (осмотрофы). Питательная среда должна содержать все вещества или их фрагменты, которые не могут быть синтезированы клетками, но необходимы им для роста, размножения и снабжения энергией. Полноценное, сбалансированное питание, удовлетворяя эти потребности организма, не обеспечивает накопления в среде таких первичных метаболитов, как органические кислоты.

Таким образом, подобно всем живым организмам, A. niger нуждается в обычных органогенах -- углероде, азоте, кислороде, водороде и многих других элементах.

Содержатся витамины (мкг/г): тиамин 150; рибофлавин 70--85; пантотеновая кислота 244--727; никотинамид 120--840; фолиевая кислота 210; цианкобаламин 178.

Существует мнение, что присутствие витаминов в среде не обязательно, так как A. niger может синтезировать их сам. Все же присутствие некоторых из них в питательной среде желательно. Так, биотин необходим для нормального функционирования всех организмов. Он является простетической группой карбоксилаз.

Добавление небольших количеств биотина в питательную среду стимулирует рост A. niger. Аналогичное действие оказывает добавление пантотеновой кислоты (простетической группы ацетил-КоА). Образование лимонной кислоты стимулируется тиамином.

Биохимическая схема и система регуляции

Биосинтез лимонной кислоты осуществляется с помощью культуры А. niger, специально селекционированной для получения высоких выходов продукта. В качестве углеродсодержащего субстрата используют мелассу, которая кроме углеводов, содержит большой ряд органических кислот. Применение определенной питательной среды с сахарозой приводит к меньшему качественному разнообразию кислот (лимонная, щавелевая и глюконовая кислота).

Биохимический механизм образования лимонной кислоты основан на функционировании цикла трикарбоновых кислот. Дегидрирование уксусной кислоты приводит к образованию двух молекул СО₂ и четырех пар ионов водорода. В цикле происходит также образование НАДН и АТФ. Хотя большинство реакций цикла обратимы, основным направлением течения энзиматических реакций является образование щавелевоуксусной кислоты через б-кетоглутаровую, янтарную и фумаровую кислоты.

Реакцией, лимитирующей скорость оборота цикла, является синтез лимонной кислоты, катализируемый аллостерическим ферментом цитратсинтетазой. Источником ацетил-КоА, который идет на синтез метаболитов цикла, является продукт цикла - лимонная кислота - легко переходящая в цитоплазму через мембрану. Как правило, из ЦТК на нужды биосинтеза уходит значительное количество метаболитов, и пополнения их фонда и функционирования полного цикла в клетках существуют дополнительные возмещающие (анаплеротические) ферментативные механизмы, например глиоксилатный шунт. В последнем, в отличие от ЦТК, уксусная кислота расходуется на синтез. Следовательно, первой реакцией ЦТК является конденсация ацетил-КоА со щавелевоуксусной кислотой, катализируемая цитратсинтетазой. Именно активность этого фермента является контролирующим параметром, определяющим скорость метаболического потока в цикле. Ингибирующий эффект на цитратсинтетазу оказывает НАДН и сукцинил-КоА. Но основное влияние на скорость синтеза лимонной кислоты оказывает поступление субстрата (щавелевоуксусной кислоты). Так как непрерывная "работа" ЦТК требует реокисления восстановленных эквивалентов (используются 4 пары дегидрогеназ), максимальная скорость цикла наблюдается в условиях достаточного доступа кислорода в клеточную систему (т.е. при хорошей аэрации).

Аэрация имеет критическое значение для глубиной ферментации. Пропускание чистого О₂ увеличивает образование лимонной кислоты, но это дорого; газовая фаза может циркулировать, если при этом поглощается СО₂. Прерывание аэрации на короткое время может иметь губительное действие на продукцию лимонной кислоты, но если при этом повысить рН с 3,0 до 4,0, то ферментация может начаться снова.

У грибов различают трофофазу, которая характеризуется ростом мицелия и активным дыханием с выделением СО₂, и идиофазу (продукционную фазу), когда рост завершен, дыхание подавлено, а оставшаяся глюкоза перерабатывается во вторичные метаболиты; в данном случае в лимонную или другие кислоты.

Образование лимонной кислоты может быть условно разделено на три процесса: 1 - разложение гексоз до пирувата и ацетил-КоА при гликолизе, 2 - анаплеротическое образование оксалоацетата из пирувата и СО₂ и 3 - аккумуляция цитрата в ЦТК. А. niger разлагает глюкозу по гексозодифосфатному (80%) и гексозомонофосфатному пути.

При работе первого пути СО₂,образованная в результате декарбоксилирования пирувата, фиксируется при анаплеротическом образовании оксалоацетата. (При работе гексозомонофосфатного пути СО2 не фиксируется). Наряду с гликолизом у A. niger частично реализуется и другой путь окисления углеводов -- пентозофосфатный, называемый также пентозным, гексозомонофосфатным, или фосфоглюконатным. Общим с гликолизом исходным продуктом является глюкозо-6-фосфат, но в дальнейшем их пути расходятся: фермент фосфофруктокиназа определяет дихотомический путь, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа -- апотомический. Конечными продуктами процесса являются 3-фосфоглицериновый альдегид и рибозо-5-фосфат. Первый из них по реакциям гликолиза превращается в пировиноградную кислоту, поэтому пентозофосфатный цикл рассматривается как шунт гликолитического пути. Основное назначение цикла -- снабжение клетки НАДН₂, необходимой для восстановительных реакций синтеза липидов и стероидов, и пентозами, в основном рибозой, используемой в синтезе нуклеотидов и нуклеиновых кислот.

Гексозомонофосфатный путь и гликолиз имеют много общих ферментов. Таким образом, оба пути могут реализовываться в клетке одновременно. При превращении 6 молекул глюкозо-6-фосфата по гексозомонофосфатному пути суммарный эффект будет тот же, что и при окислении 1 молекулы гексозы в СО2 по пути гликолиза и ЦТК.

В процессе разложения глюкозы образуются промежуточные соединения: манит, арабит, эритрит, глицерин.

Рис. 2 Биохимическая схема синтеза лимонной кислоты

Образование лимонной кислоты тесно связано со скоростью фиксации СО₂. Фиксацию СО₂ у А. niger осуществляет конститутивный фермент пируваткарбоксилаза. Существуют почти стехиометрическое отношение между фиксацией СО₂ и продукцией цитрата.

Фермент аконитаза, участвующий в расщеплении цитрата в ЦТК, снижает его продукцию. Считали, что при дефиците Fe или при добавлении Cu происходит ингибирование аконитазы и соответственно увеличение выхода цитрата. Однако аконитаза катализирует реакцию, сильно сдвинутую в сторону образования цитрата, и необходимости в ее ингибировании нет. Другой фермент - НАДФН-зависимая изоцитратдегидрогеназа, которая теоретически должна способствовать снижению аккумуляции лимонной кислоты, ингибируется цитратом. Правда, у А. niger имеется еще один аллостерически НАД-связанный фермент - изоцитратдегидрогеназа, которая активируется цитратом.

Выход лимонной кислоты зависит от активности б-кетоглутаратдегидрогеназы. Образование сукцинил-КоА из б-кетоглутарата под действием б-кетоглутаратдегидрогеназы называют узким местом ЦТК. Фермент ингибируется физиологической концентрацией щавелевоуксусной кислоты и НАДН. Увеличение клеточного оксалоацетата снижает катаболизм цитрата на уровне б-кетоглутарата и одновременно усиливает скорость его синтеза при участии цитратсинтазы. Аккумуляция б-кетоглутарата и НАДН снижает активность НАД(НАДФ)-изоцитратдегидогеназы, что способствует увеличению накопления цитрата до уровня, при котором сам ингибирует вышеуказанный фермент.

Цитрат сильно ингибирует транспорт глюкозы в клетке путем подавления активности фосфофруктокеназы. Последнему противодействует увеличение концентрации NH₄⁺, а накоплению NH₄⁺ способствует дефицит Mn в среде. Полагают, что при дефиците Mn усиливается разложение белков и внутриклеточное содержание NH₄⁺ возрастает. Повышение концентрации аммонийных ионов внутри клеток смягчает ингибирующее влияние цитрата на фосфофруктокиназу.

Большинство исследователей склоняется к мнению, что основную роль играет ингибирование ферментов -- аконитатгидратазы и изоцитратдегидрогеназы. Ингибирование аконитатгидратазы объясняют действием самой лимонной кислоты или избытка гексацианоферроата калия, применяемого для обработки мелассных сред перед ферментацией.

При интенсивном кислотообразовании активность цитратсинтетазы возрастает приблизительно в десять раз. Однако по имеющимся данным еще нельзя решить вопрос, что является причиной накопления лимонной кислоты -- ингибирование указанных двух ферментов или активирование цитратсинтетазы.

Известно, что ко вторым суткам ферментации в среде, уже покрытой тонкой мицелиальной пленкой, в ощутимых количествах содержатся янтарная и яблочная кислоты, а также не относящиеся к ЦТК кислоты: глюконовая, сахарная и малоновая. Первые две кислоты образуются непосредственным окислением глюкозы, малоновая, по-видимому, как промежуточный продукт на пути синтеза насыщенных жирных кислот: +СО2

Ацетил-КоА > Малонил-КоА > Малонат

Содержание всех этих кислот возрастает до третьих--пятых суток ферментации. Таким образом, ингибирование аконитатгидратазы и изоцитратдегидрогеназы начинают вызывать перечисленные выше кислоты, что вызывает постепенное накопление лимонной кислоты, которая в свою очередь еще больше ингибирует данные ферменты, и усиливает их синтез.

Следует обратить внимание еще на одного возможного участника в этом механизме -- малоновую кислоту, являющуюся специфическим ингибитором сукцинатдегидрогеназы. Малоновая кислота образуется больше других кислот и содержание ее в среде возрастает до четвертых-пятых суток -- времени начала наиболее интенсивного продуцирования лимонной кислоты.

В период интенсивного накопления лимонной кислоты в ЦТК преобладает анаплеротический путь метаболизма, т.е. сначала происходит карбоксилирование пировиноградной кислоты с образованием щавелевоуксусной, а затем конденсация ее с ацетил-КоА. Интенсивность образования лимонной кислоты в этот период может быть понятна также из того, что в данном случае резко ограничиваются возможности конструктивного и энергетического обмена веществ клетки и A.niger для поддержания жизнеспособности вынужден перерабатывать значительно большее количество субстрата.

Фактором, стимулирующим аккумуляцию лимонной кислоты, служит аэрация: глюкоза+3/2 О₂ > лимонная кислота+2Н₂О. О₂ необходим и для реокисления гликолитического НАДН в процессе лимоннокислой ферментации.

Технологическая схема.

В отдельном цехе осуществляют наработку спор (конидий) гриба в виде трехстадийной схемы. В первую стадию A.niger выращивают на скошенной агаризованной среде (например, на сусло-агаре) в пробирках, во вторую и третью стадии его размножают на плотной или жидкой среде соответственно в колбах Эрленмейера или в алюминиевых кюветах площадью 8,5-12 дм² и с высотой бортиков от 7 до 20 см. Продолжительность каждой стадии - от 2 до 4 суток при температуре 32⁰С. При образовании и созревании конидий вначале бесцветный мицелий становится затем черным; конидии собирают по принципу аспирации (по лат. aspiratio - вдыхание, надувание) специальным вакуумным насосом, подсушивают в термокамере при 28-30 ⁰С, смешивают со стерильным активированным углем (1:2), фасуют в стерильные флаконы (колбы) и хранят в течение от полутора до двух лет. С 10 дм² питательной среды в кюветах можно получить до 4-5 г сухих конидий. Подобный посевной материал может быть самостоятельным коммерческим продуктом, поставляемым на заводы лимонной кислоты.

В варочном аппарате 5 при работающей мешалке растворяют отвешенное количество мелассы в кипящей воде (соотношение 1:1). При содержании в мелассе кальция более 0,4% СаО избыток его осаждают ЩКА, кипятят 5 - 10 минут, добавляют серную кислоту или кальцинированную соду, необходимые для установления рН в пределах 6,8 - 7,2. Затем прибавляют раствор гексоцианоферроата, снова кипятят 5 - 10 минут, проверяют на содержание свободного гесоцианоферроата и проводят корректировку. При обработке мелассных растворов трилоном Б заменяют от20 до 40% гексоцианоферроата калия. Применение трилона повышает выход лимонной кислоты примерно на 15%. При внесении в среду трилона Б рН ее понижается на 0,2 - 0,3 ид., что необходимо учитывать.

Далее вводят растворы хлорида аммония и сульфата магния, доводят водой до объема среды, соответствующего 3%-ной концентрации, нагревают до кипения и насосом 2 перекачивают на стерилизационную установку непрерывного действия.

Стерилизационная установка состоит из стерилизационной колонки 6, выдерживателя 7 и холодильника типа "труба в трубе" 8. Стерилизационная колонка имеет 2 трубы - наружную и внутреннюю. Пар подается по внутренней трубе со щелевидными прорезями, через которые он поступает в питательную среду. Среда подается снизу, движение ее происходит по спирали благодаря наличию винтовых направляющих. Стерилизацию ведут при температуре 122 - 124 ⁰С; стерилизуемая среда поступает в выдерживатель на 10 - 15 минут, а затем минуя холодильник, поступает в посевной ферментатор 9. Приготовление среды завершается в посевном ферментаторе. В нее при работающей мешалке и температуре 70 - 80 ⁰С вводят из инокулятора через посевной штуцер антимикробный раствор, охлаждают через рубашку ферментатора водой до 35 - 36 ⁰С и затем вводят стерильные растворы КН₂РО₄ и ZnSO₄. Контролируют рН готового раствора (6,8 - 7,2) и в необходимых случаях корректируют его добавлением серной кислоты или стерильного раствора соды. В посевной ферментатор 9 к подготовленному раствору температурой 35 - 36 ⁰С через инокулятор вводят суспензию конидий, которую готовят за 5 - 6 часов. Предварительно определенное количество сухих конидий замачивают в небольшом объеме мелассной среды и выдерживают при 32 ⁰С в термостате. С целью активирования конидий (ускорение их прорастания и усиления кислотообразования) иногда добавляют препараты, содержащие набор микроэлементов, продукты метанового термофильного брожения, обрабатывают малыми дозами мутагенов или применяют другие способы.

Рис.3 Технологическая схема производства лимонной кислоты

После засева в ферментатор сразу подают стерильный воздух и включают в работу лопастную мешалку с частотой вращения 180 об/мин. Аэрацию и перемешивание раствора ведут в течение всего времени приготовления посевного материала при избыточном давлении 0,02 - 0,03 МПа. Температуру 34 - 35 ⁰С поддерживают охлаждением водой через рубашку ферментатора. В посевном ферментаторе объемом 10 м³ в первые шесть часов, когда конидии набухают и начинают прорастать, достаточно небольшого расхода воздуха 9 - 10 м³/ч. в следующие 7- 11 ч количество воздуха постепенно увеличивают до 18 м³/ч и через 12 ч до 36 м³/ч. в 10 - 12-часовом мицелии в центральных участках гиф появляются первые поперечные перегородки и начинается ветвления.

С этого времени происходит сильное вспенивание культуральной среды, поэтому в патрубок для посева вводят 25 - 30 мл стерилизованной технической олеиновой кислоты (группы А или Б по ГОСТ 10475 - 63), которая содержит не менее 92%жирных кислот в безводном продукте, не более 0,25% влаги и имеет температуру застывания 10 - 16 ⁰С.

Если через некоторое время культуральная жидкость начинает вновь пениться, вводят еще пеногаситель, так как при активном росте мицелия расход воздуха уменьшать нельзя.

К 16 - 19 ч подают 45 м³ воздуха в 1 ч; к 20 - 24 ч, когда вырастает значительная масса мицелия, пенообразование обычно прекращается. Объем раствора заметно увеличивается за счет образовавшегося мицелия и мелких пузырьков воздуха, жидкость становится густой и светлой. С этого времени подают в ферментатор 70 - 72 м³ воздуха в 1 ч. После 24 - 30 ч количество подаваемого воздуха увеличивают до 90 м³/ч и до конца процесса поддерживают на уровне 90 - 100 м³/ч.

Готовая 28 - 36-часовая культура должна быть светлой, молочно-бежевой, насыщенной пузырьками воздуха со всплывающим мицелием. Мицелий - хлопьевидный, диффузный, содержащий немного мелких шарообразных комочков. Гифы - светлые, тонкие, вытянутые, активно ветвящиеся, со светлой прозрачной цитоплазмой, расположенной в пристенном слое; в центральной части клетки расположена большая вакуоль; общая (титруемая) кислотность - около 0,7 - 2,0 %.

Процесс формирования мицелия и чистоту культуры контролируют микроскопированием проб. Присутствие посторонней микрофлоры недопустимо. Патологический мицелий образуется при нарушении технологического режима выращивания и при инфицировании посторонними микроорганизмами, что легче выявляется в 12-часовых пробах.

Мелассную среду в основном ферментаторе 11 засевают подросшим мицелием. Способ перемешивания ферментируемой среды в основном ферментаторе - эрлифтный. Приготовление мелассной среды в основном ферментаторе 11 проводят следующим образом. В варочном аппарате 5 кипятят водопроводную воду и направляют ее в стерилизационную установку, где стерилизуют при температуре 128 - 130 ⁰С и после охлаждения переводят в ферментатор. Затем в варочном аппарате 5 готовят мелассный раствор. Мелассу разбавляют водой в соотношении 1:1 и обрабатывают горячий раствор ЩКА, как обычно. Раствор кипятят 5 - 10 минут, доводят рН до 6,8 - 7,2, кипятят 10 - 20 минут и обрабатывают раствором гексоцинофероатом калия, после чего кипятят еще 5 - 10 минут и проверяют на содержание свободного гексоцианоферроата. Проверяют и корректируют рН в пределах 6,8 - 7,2. Мелассная среда, пройдя стерилизационную установку, поступает в ферментатор. Здесь среду разбавляют стерильной водой до объема 60 м³ с учетом внесения посевного мицелия. Концентрация сахара в среде должна быть около 3%, температура 32 - 34 ⁰С. При непрерывной подаче воздуха через стерилизационную установку последовательно вводят (при объеме ферментатора 100 м³) 9 м³ горячей воды температурой 126 - 129 ⁰С, 9 м³ воды температурой 32 - 34 ⁰С, 6 - 10 м³ стерильных растворов питательных солей температурой 32 - 34 ⁰С, 6 - 10 м³ горячей воды, 8 - 8 м³ мелассного раствора и охлажденную воду в количестве, необходимом для доведения объема исходного мелассного раствора до 54 м³.

Во время заполнения ферментатора содержимое его охлаждают водой до температуры 32 - 33 оС. Затем по пропаренной коммуникации из посевного ферментатора 9 переводят приготовленную посевную культуру, при этом объем содержимого в основном ферментаторе 11 увеличивается до 60 м³. Его перемешивают 30 минут отбирают пробу для определения рН, концентрации сахара и микробиологической чистоты. После зарядки ферментатора все продуктовые коммуникации промывают стерильной горячей водой и пропаривают 1 час.

Аэрацию и перемешивание в эрлифтных ферментаторах следует рассматривать как единый процесс, так как нельзя аэрировать среду, не вызывая ее перемешивания. При перемешивании раствор вспенивается. Это вызвано присутствием в питательной среде сапонина, азотистых веществ и пектинов. В ферментеры подают сжатый воздух, который предварительно проходит через стерилизационные фильтры 10.

Через сутки после засева, когда подросший мицелий разрастается и начинается интенсивное образование лимонной кислоты, проводят подливы более концентрированной мелассной среды (20 - 25% по сахару). Среду подливают периодически (по 5 - 20 л в один прием на 1 м³ геометрического объема) или непрерывно до заполнения объема ферментатора примерно на 80%. Подливы обычно начинают, когда в культуральной жидкости общая кислотность достигнет 1,5 - 2%, а содержание сахара уменьшится до 0,4 - 0,8%. В дальнейшем концентрацию сахара поддерживают на уровне 0,8 - 1,2%.

Подливы проводят с интервалами по 1,5 часа и заканчивают на третьи сутки от начала ферментации. Суммарная концентрация сахара составляет 12 - 13% в расчете на исходный объем среды в ферментаторе (60 м³ в 100 м³ ферментаторе). После подливов ферментируемая среда сильно пенится, поэтому в нее добавляют немного пеногасителя. Если по окончании подливов образуется много мицелия и среда становится очень густой, в ферментатор доливают немного стерильной воды.

При каждом периодическом подливе концентрация сахара в среде возрастает и требуется определенное время, чтобы гриб адаптировался к ней и продолжал продуцировать кислоту. При непрерывных подливах концентрация сахара на значительном отрезке времен остается практически постоянной, обеспечивая непрерывное кислотообразование и сокращение длительности цикла ферментации.

Если титруемая кислотность в двух пробах, взятых в конце ферментации, с интервалом 4 - 8 ч, не нарастает, то ферментацию заканчивают. Прекращают подачу воздуха, нагревают культуральную жидкость паром до 65 - 70 ⁰С и переводят в сборник 13.

Отделение мицелия и отмывку от него лимонной кислоты проводят на барабанных вакуум-фильтрах 14 непрерывного действия. Культуральную жидкость из приемного сборника 13 центробежным насосом 3 передают в корыто вакуум-фильтра, где мицелий отделяют. Культуральный раствор собирают в сборнике 16, а мицелий - в сборнике 15. Фильтрат из сборника 14 подают на химическую обработку, а промытый мицелий удаляют. Содержание кислоты в отмытом мицелии не должно превышать 0,2.

В собранной культуральной жидкости содержится смесь органических кислот - лимонная, глюконовая, щавелевая и неиспользованный сахар в примерном соотношении 45-50:3:1:7, то есть лимонная кислота составляет от 80 до 90%. Ее выделяют химическим путем - добавляют к нагретой до 100 ⁰С культуральной жидкости известковое молоко - Са(ОН)₂ или мел - СаСО₃, доводя рН до 6,8-7,0; это количество составляет примерно 2,5-3%; трехзамещённый кальция цитрат, хуже растворимый в горячей воде, чем в холодной, выпадает в осадок вместе с оксалатом кальция (кальция глюконат остается в растворе); осадок отфильтровывают, промывают горячей водой и гидролизуют серной кислотой. Свободная лимонная кислота остается в растворе, а негидролизованный оксалат кальция и образовавшийся гипс - CaSO4 остаются в осадке. Раствор лимонной кислоты очищают, подвергают вакуум-упариванию и кристаллизуют. Кристаллы кислоты высушивают и фасуют.

Выбор способа ферментации

Процесс производства лимонной кислоты включает все основные стадии микробиологической технологии (рис. 3):

1. получение посевного материала;

2. подготовка сырья-мелассы к ферментации;

3. подготовка и стерилизация воздуха;

4. ферментация;

5. отделение биомассы продуцента -- мицелия;

6. выделение из культурной жидкости лимонной кислоты и получение ее в кристаллическом виде.

В промышленном производстве лимонной кислоты применяется несколько вариантов процесса.

Поверхностный способ ферментации

Приготовление питательной среды при поверхностном способе культивирования осуществляют в варочном котле. Мелассу разбавляют кипящей водой в соотношении 1:1 и, добавляя серную кислоту, доводят рН раствора до значения 6,7 - 7,2. Для осаждения солей железа и тяжелых металлов водят при кипячении определенное количество раствора желтой кровяной соли. В раствор мелассы при температуре 60 - 70 ⁰С последовательно добавляют источники азота, фосфора, макро- и микроэлементов. Содержание сахаров в среде должно составлять 12 - 16%.

лимонный кислота ферментация микромицет

Рис. 4. Технологическая схема получения лимонной кислоты из мелассы поверхностным способом (жидкофазная ферментация): 1 - цистерна для мелассы, 2 - центробежные насосы, 3 - реактор для разбавления мелассы, 4 - стерилизатор, 5 - бродильная камера, 6 - сборник сбраживаемых растворов, 7 - нейтрализатор, 8, 10 - нутч-фильтры, 9 - расщепитель, 11 - сборник-монтежю, 12 - вакуум-аппарат, 13-дисольвер, 14 - фильтр-пресс, 15 - кристаллизатор, 16 - приемник, 17 - сушилка, 18 - готовая продукция, 19 - сборник фильтрата.

Основная ферментация осуществляется в специальных камерах, представляющих собой закрытые помещения, в которых на стеллажах расположены кюветы. Кюветы прямоугольной формы изготавливают из алюминия или нержавеющей стали. Заполнение кювет питательной средой и слив из них культуральной жидкости осуществляется через щтуцеры в дне кювет. Камеры оборудованы системой для подачи нагретого стерильного воздуха.

Перед началом нового цикла ферментации камеры и кюветы тщательно моют и стерилизуют параформалиновой смесью с последующей дегазацией пароаммиачной смесью. После стерилизации и охлаждения камер в кюветы наливают питательную среду слоем от 12 до 18 см. с помощью специального устройства для распыления в питательную среду вносят посевной материал - конидии гриба A.niger.

Через сутки после засева образуется тонкая серовато-белая пленка мицелия, которая по истечении трех суток сильно утолщается и приобретает складчатую структуру. Температуру в период активного роста мицелия гриба поддерживают в предела 34 - 36 ⁰С при умеренной аэрации. В период активного кислотообразования температуру снижают до 32 - 34 ⁰С, а подачу воздуха увеличивают в 3 - 4 раза. По мере снижения интенсивности кислотообразования и уменьшения количества выделяемой теплоты подачу воздуха в камеру постепенно уменьшают. Процесс ферментации прекращают, когда в растворе остается 1 - 2% сахаров, а содержание кислот в культуральной жидкости достигает 12 - 20%.

Культуральную жидкость сливают из кювет в сборник, откуда ее подают в химический цех для выделения лимонной кислоты. Содержание лимонной кислоты в культуральной жидкости составляет 12 - 20%.

Мицелий отмывают от кислоты горячей водой и используют как корм для скота.

Изложенный выше способ называют бессменным. По сменному способу после сливания культуральной жидкости под пленку A.niger вводят немного воды температурой 30 - 32 ⁰С, выдерживают 0,5 часов, промывную жидкость сливают, вводят свежую мелассную среду и ферментируют. По доливному способу ферментации на 4-5 сутки под пленку A.niger доливают свежую питательную среду в количестве, компенсирующем уменьшения объема вследствие испарения влаги. При работе этими способами экономится расход конидий, реже перезаряжаются камеры и появляется возможность ферментировать низкокачественные мелассы, не пригодные для выращивания грибной пленки.