Цитохром С
Основные способы получения цитохрома C из различных природных источников, широкое применение изобретения в медицине, ветеринарии в качестве лекарственного препарата, в виде реактива в биохимии. Стадии выделения цитохрома C в промышленных масштабах.
| Рубрика | Производство и технологии |
| Вид | монография |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 27.05.2013 |
| Размер файла | 215,8 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Содержание
- Цитохром С
- Очистка
- 1. Осаждение
- 1.1 Высаливание
- 1.2 Изменение температуры и рН
- 1.3 Осаждение органическими растворителями
- 2. Коагуляция и флокуляция
- 2.1 Цельные клетки
- 2.2 Остатки клеток и белки
- 3. Центрифугирование
- 3.1 Сигма-анализ
- 3.2 Центрифуги с роторами трубчатого типа
- 3.3 Многокамерные центрифуги
- 4. Хроматография
- 4.1 Адсорбция
- 4.2 Фракционирование посредством ионного обмена
- 4.3 Сорбция-десорбция
- 5. Электрофорез и центрифугирование
- 5.1 Электрофорез
- 5.2 Зональное ультрацентрифугирование
- 6. Отделочные операции
- 6.1 Обессоливание
- Стадии предкультивированием
- Применение цитохрома С
Цитохром С
Использование: изобретение относится к химии биологически активных веществ белковой природы, более точно к выделению цитохрома C из мышц сердца крупного рогатого скота. Сущность изобретения: цитохром C получают обезжириванием сердец крупного рогатого скота, удалением из них связок, сосудов, измельчением и отмыванием крови. Полученный фарш экстрагируют водным раствором сильной кислоты - 0,10 - 0,15% серной или 2,0 - 2,5% трихлоруксусной при 10 - 15oC и при pH 3,9 - 4,2. Экстракт после отделения от фарша подщелачивают до pH 6,8 - 7,4 и непосредственно из него ведут сорбцию целевого продукта на карбоксильном катионите, представляющем собой полимер из ряда, включающего сополимер метакриловой кислоты N,N' - гексаметилендиметакриламидом и сополимер акриловой кислоты с дивинилбензолом, катионит используют в Na+-форме. Элюцию проводят 10 - 12% -ным раствором сульфата аммония с pH 9,0 - 9,8, из элюата при pH 7,2 - 7,5 осаждают балластные белки добавкой сульфата аммония в количестве 0,5 г/мл элюата, из надосадочной жидкости осаждают цитохром C действием 20% -ного раствора трихлоруксусной кислоты при охлаждении. Выпавший осадок растворяют в малом количестве воды и диализуют против изотонического раствора хлористого натрия до полного удаления иона SO24
Изобретение относится к химии биологически активных веществ белковой природы, более точно к выделению металлопротеида цитохрома C из мышц сердца крупного рогатого скота. Цитохром C нашел широкое использование в медицине, ветеринарии в качестве лекарственного препарата, а также в виде реактива в биохимии.
Изобретение может использоваться при выделении цитохрома C в промышленных масштабах.
Цитохром C белок, содержащий железо, может быть выделен из разнообразных видов природного сырья: дрожжей, риса, мышц сердца млекопитающих (лошадей, крупного рогатого скота, свиней, собак, кроликов, человека), птиц (голубей, пингвинов), рыб и т.д.
Стоимость 1 г цитохрома C высокой чистоты в зависимости от источника выделения и метода получения составляет от 108,6 до 247,7 долларов США (каталоги фирм Флока 1993/94, Олдрич 1992/93, Сигма 1994).
Описаны способы получения цитохрома C из различных природных источников, в первую очередь из такого широко распространенного сырья как мышцы сердца млекопитающих, предпочтительно крупного рогатого скота. Известен способ получения цитохрома C из бычьих сердец (1), включающий следующие стадии.
1. Свежие сердца крупного рогатого скота обезжиривают, удаляют сосуды и связки, измельчают, отмывают водой от крови.
2. Полученный фарш экстрагируют 1,0 н. водным раствором уксусной кислоты, pH смеси 4,3.
3. Смесь выдерживают 1 ч при 4oC, добавляют 1 н. водный раствор NH4OH до pH 6,0 и при той же температуре выдерживают сутки, затем отделяют фильтрат.
4. В фильтрат добавляют фосфатный буферный раствор с pH 7,4 в таком количестве, чтобы его конечная концентрация составила 0,02 М.
5. Фильтрат пропускают через колонку с сорбентом, в качестве которого берут алюмосиликат магния.
6. Сорбент промывают 1,0% раствором сульфата алюминия, содержащего 0,02 М фосфатный буфер с pH 7,4.
7.5,0 мас. раствором сульфата аммония, содержащего 0,02 M фосфатный буфер, элюируют цитохром C с отбором фракций, окрашенных в красный цвет.
8. Эти фракции объединяют, разбавляют водой в 5 раз и еще дважды рехроматографируют в тех же условиях.
9. Показатель чистоты цитохрома C в полученном конечном водном элюате оценивают как отношение экстинкций раствора цитохрома C в восстановленной форме при длине волны 550 нм и раствора цитохрома C в окисленной форме при длине волны 280 нм, эта величина для продукта, полученного описанным способом, составляет 1,10.
Данный способ характеризуется относительно малой емкостью сорбции используемого сорбента алюмосиликата магния: не более 4,5 5 мг/мл или 13 - 15 мг/г. Это приводит к необходимости использовать 200 250 мл сорбента на 1 кг сырья. Выход очищенного цитохрома C не превышает в известном способе 74% от того количества, которое было получено после первой хроматографии, где показатель чистоты находился в пределах 0,45 0,67. Из-за многостадийной операции хроматографирования известный способ практически невозможно масштабировать.
Описан также способ получения цитохрома C с использованием хроматографии на карбоксильных смолах катионитах (2) (ближайший аналог). Этот способ реализуется следующей совокупностью существенных признаков:
1. Свежие сердца крупного рогатого скота обезжиривают, удаляют сосуды и связки, измельчают, отмывают от крови.
2. Полученный фарш экстрагируют 1,0 н. водным раствором уксусной кислоты, pH полученной смеси 4,3.
3. Смесь выдерживают 1 ч при 12 15oC и добавляют 4 н. водный раствор NH4OH до pH 6,5, а затем 400 г порошковатого сульфата аммония на 1 кг исходного сырья, через 3 ч выдержки при 20oC или через сутки при 4oC экстракт отделяют.
4. В экстракт добавляют 30% раствор NH4OH до pH 7,0, затем порциями добавляют порошкообразный сульфат аммония при полном растворении каждой порции до получения раствора плотностью 1,220, после чего суспензию фильтруют.
5. Фильтрат яркокрасный раствор, содержащий 80% от насыщенного раствора сульфата аммоний с pH 6,8, охлаждают до 2 4oC и добавляют 3 н. раствор трихлоруксусной кислоты до pH 4,8 5,0.
6. Осадок отделяют, промывают раствором сульфата аммония с концентрацией 90% от насыщенного, ресуспендируют в воде и устанавливают pH, равное 7,0, добавлением 30% раствора NH4OH.
7. Суспензию отделяют, фильтрат диализуют против дистиллированной воды.
8. Диализованный раствор окисляют малым количеством 0,01 M калия феррицианида до исчезновения полосы восстановленной формы цитохрома C при 550 нм, раствор сорбируют на карбоксильном катионите Амберлит ХЕ-64 в H+-форме, уравновешенном 0,25 н. аммонийфосфатным буфером с pH 7,0.
9. Сорбент промывают 0,125 н. аммоний-фосфатным буфером с pH 7,0.
10. Ту часть смолы, которая в результате сорбции цитохрома C окрасилась в красный цвет, извлекают из колонки, суспендируют в 0,02 н. буферном растворе и переносят в колонку меньшего размера.
11.0,5 н. буферным раствором с pH 7,0 элюируют цитохром C, в элюат добавляют небольшое количество 0,01 М калия феррицианида, разбавляют равным объемом воды и пропускают через тот же сорбент, уравновешенный 0,25 н. аммоний-фосфатным буфером с pH 7,0.
12. Элюцию ведут 0,25 н. буферным раствором с pH 7,0, содержащим 0,01 М раствор калий феррицианида.
13. Элюент, содержащий цитохром C, диализуют против дистиллированной воды и вновь ведут адсорбцию на Амберлите ХЕ-64 в H+-форме.
14. После сорбции часть смолы, окрашенной в красный цвет, переносят в меньшую по размеру колонку.
15. Элюцию ведут 5% раствором сульфата аммония в pH 8,0.
Показатель чистоты полученного конечного продукта до 1,25, выход до 52,4% от имевшегося в растворе после первой обработки сульфатом аммония.
цитохром биохимия лекарственный реактив
В известном способе цитохром C выделяют методом сорбции на карбоксильном катионите Маберлит ХЕ-64, представляющем сополимер метакриловой кислоты с дивинилбензолом (5%). Этот сорбент специально подготовлен для использования в фармацевтической промышленности (3). Сорбцию цитохрома C проводят на Маберлите ХЕ-64 в H+-форме, поскольку экспериментально установлено, что высокая емкость сорбции и достаточная селективность достигаются на карбоксильных катионитах в H+-форме сорбента.
Кроме того, хроматографирование может быть эффективно только при использовании цитохрома C в окисленной форме (4,5), поскольку еще раньше было найдено, что восстановленная форма цитохрома C обладает малым сродством к сорбентам. Известная технология выделения цитохрома C предусматривает не только окисление самого выделяемого продукта, но и предобработку карбоксильного катионита 5% раствором натрий гипохлорита, которая предупреждает восстановление окисленной формы цитохрома C в процессе выделения.
Низкая емкость сорбции карбоксильного катионита даже в окисленной форме: она не превышает 1,5 мг/мл сорбента (100 мл Амберлита ХЕ-64 на 125 мг цитохрома C) или около 4,5 мг/г сорбента.
В известном способе не указана величина обратимости процесса сорбции-десорбции. Однако эксперименты показали, что введение в состав сорбента таких гидрофобных групп как ароматические ядра и/или метильные группировки значительно уменьшает обратимость сорбции. В описании известного способа указано, что даже после однократного использования сорбента его необходимо регенерировать не только обычными реагентами водными растворами едкого натра и соляной кислоты, но и раствором натрий гипохлорита до полного обесцвечивания, которое иначе не достичь
Известный способ сложно масштабировать из-за многостадийности: только процесс сорбции-десорбции используется четырежды.
Задачей предлагаемого изобретения является создание способа получения цитохрома C, который может быть легко масштабирован, с однократной хроматографической очисткой целевого продукта на сорбенте, гарантирующем высокую обратимость сорбции и повышенную емкость сорбции и селективность при сохранении высокой степени чистоты промышленно получаемого продукта. При этом сорбент должен обеспечивать высокую емкость и селективность вне зависимости от формы цитохрома C (окисленной или восстановленной).
Эта задача была решена способом получения цитохрома C, который включает следующую совокупность существенных признаков.
1. Свежие сердца крупного рогатого скота обезжиривают, удаляют сосуды и связки, измельчают, отмывают водой от крови.
2. Измельченное сырье обрабатывают разбавленным раствором сильной кислоты при pH 3,9 4,2 в течение 1,5 2 ч при 10 15oC, экстракт отделяют от сырья.
3. В качестве разбавленных растворов сильных кислот берут 0,10 0,15% водный раствор серной кислоты или 2,0 2,5% водный раствор трихлоруксусной кислоты.
4. В отфильтрованном экстракте добавлением 10 15 мас. раствора едкого натра устанавливают pH 6,8 7,4 и пропускают через карбоксильный катионит в Na+-форме, уравновешенный солевым раствором с ионной силой 0,1.
5. В качестве карбоксильного катионита используют сополимер метакриловой кислоты с 3 5% N,N'-гексаметилендиметакриламида или сополимер акриловой кислоты и дивинилбензола (6).
6. После завершения сорбции катионит промывают водным раствором сульфата аммония с концентрацией 0,5 0,8%
7. Элюцию целевого продукта ведут 10 12 мас. водным раствором сульфата аммония с pH 9,0 9,8, устанавливая его 1 н. раствором NH4OH, отбирая фракции.
8. Фракции, окрашенные в красный цвет, объединяют, подкислением 20% серной кислотой устанавливают pH 7,2 7,5, затем порциями добавляют порошкообразный сульфат аммония в количестве 0,5 г/мл элюата и перемешивают до полного растворения, выпавшие балластные белки отделяют, процесс осаждения повторяют до достижения показателя чистоты цитохрома C в растворе не менее 0,8.
9. К полученному охлажденному до 5 10oC фильтрату добавляют 20 25 мл/л 20 мас. раствора трихлоруксусной кислоты, при той же температуре выдерживают раствор до выпадения осадка, который отделяют.
10. Осадок растворяют в минимальном количестве воды и диализуют против изотонического раствора хлористого натрия до полного удаления иона SO24-.
Для данного способа характерно следующее.
1. Используют карбоксильные катиониты в Na+-форме с емкостью сорбции по цитохрому C до 615 1490 мг/г сухой смолы при обратимости сорбции 85 98% (известные катиониты, например КМД (8), являющийся сополимером стирола с дивинилбензолом, хлорметилированный и карбоксилированный, характеризуются емкостью сорбции чистого цитрохрома C около 50 60 мг/мл сорбента при обратимости сорбции 30 43%).
2. Процесс хроматографирования проводят без перевода цитохрома C в окисленную форму и без предобработки экстракта и сорбента.
Таким образом, способ основан на обнаруженной впервые новой, неочевидной функции у выбранных для выделения цитохрома C карбоксильных катионитов, что позволило разработать новую промышленную технологию.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Синтез сополимера метакриловой кислоты и N, N'-гексаметилендиметакриламида.
516 г метакриловой кислоты и 79,5 г N, N'-гексаметилендиметакриламида растворяют в 2,33 л 20% водной уксусной кислоты. При перемешивании в инертной атмосфере вводят 3,06 г персульфата аммония и 2,34 г аскорбиновой кислоты. Образовавшийся блок прогревают при 100oC в течение 30 мин. Сополимер измельчают, обрабатывают 1 н. едким натром (3 х 9 л), затем 1 н. соляной кислотой (1 х 9 л), отмывают водой и сушат. Выход 566 г или 95% Коэффициент набухания в воде Kнаб.5,0, в буферном растворе с pH 6,8 Kнаб.10,0. Емкость по иону натрия 9,4 мг·экв/г сухой смолы. Полученный карбоксильный катионит хранится в H+-форме. Для выделения цитохрома C его переводят в Na+-форму действием избытка 1 н. едкого натра с последующим отмыванием водой до pH на выходе колонки 7,0 8,5 и уравновешиванием солевым раствором ионной силы 0,1 (5,6 г/л хлористого натрия или 5 г/л сульфата аммония).
Пример 2.
7,5 кг фарша, полученного из сердечных мышц крупного рогатого скота после обезжиривания, удаления сосудов, связок и измельчения, отмывают водой от остатков крови и экстрагируют 10,0 л 0,125 мас. водного раствора серной кислоты. Экстракцию ведут 2 ч при 10oC, pH полученного экстракта 4,1. Экстракт отделяют от исходного сырья прессованием. Всего получают 6,5 л экстракта. Добавкой 15% водного раствора едкого натра устанавливают pH экстракта 6,8. Полученный раствор пропускают через сорбент, полученный по примеру 1. Объем колонки 250 мл (диаметр 6 см, высота слоя сорбента 8,5 см, количество сорбента 240 мл или 24 г сухой смолы). Сорбцию ведут при скорости пропускания раствора 3,0 л/ч. Время сорбции около 4,5 ч. Затем сорбент промывают 2,5 л 0,5% раствора сульфата аммония. Время промывки 1 ч. Элюцию цитохрома C проводят 10% раствором сульфата аммония с pH 9,6 (pH устанавливают добавкой 1 н. раствора NH4OH). Скорость подачи элюирующего раствора 240 мл/ч. Время элюции 5,5 ч. Элюат отбирают фракциями. Фракции, окрашенные в красный цвет, объединяют. Объем таких фракций 770 мл при показателе чистоты цитохрома C 0,58. Объединенные фракции подкисляют 20% раствором серной кислоты до pH 7,5. В элюат порциями добавляют безводный порошкообразный сульфат аммония и смесь перемешивают до полного растворения очередной порции. Количество сульфата аммония составляет 0,5 г/мл элюата или 385 г. Выпавший аморфный осадок балластных белков отфильтровывают и определяют показатель чистоты цитохрома C. На этой стадии он составляет 0,80. К фильтрату при охлаждении до 5oC добавляют 20 мл 20% водного раствора трихлоруксусной кислоты, то есть 25 мл/л раствора, при перемешивании. Раствор выдерживают при той же температуре 15 мин. Центрифугированием отделяют надосадочную жидкость. Осадок суспендируют в 10 мл насыщенного раствора сульфата аммония и вторично центрифугируют. Осадок растворяют в минимальном количестве воды (25 мл) и диализуют против изотонического раствора хлористого натрия до полного отделения иона SO24-. Показатель чистоты целевого продукта 1,21. Цитохром C может быть получен в сухом виде лиофилизацией. Выход 757 мг или 101 мг/кг исходного сырья.
Примеры 3 11 выполнены в условиях примера 2.
Все экспериментальные данные представлены в табл.1. При этом в табл.1
4 индекс K1 означает сорбент, полученный по примеру 1, К2 - сорбент на основе сополимера акриловой кислоты с дивинилбензолом.
Дополнительно определяют значения предельной емкости сорбции и обратимости сорбции на чистом цитохроме C в условиях максимальной емкости на катионитах в Na+-форме. Данные представлены в табл.2.
Определяют также значения предельной емкости катионитов по цитохрому C в зависимости от ионной силы раствора. Данные представлены в табл.3.
Предварительными модельными опытами были найдены pH-зависимость сорбции цитохрома C на карбоксильных катионитах K1 и K2. Данные представлены в табл.4.
Таким образом, наибольшая емкость по цитохрому C достигается при pH 5,0 на K2 и при pH 6,2 на катионите K1. Проведенные исследования показали, что при сорбции из экстракта с pH 6,8 7,4 снижаются абсолютные количества сорбируемого цитохрома C, но существенно увеличиваются относительные его количества по отношению к сорбируемым той же смолой кислым балластным белкам, что значительно увеличивает селективность сорбции.
Регенерацию сорбентов, используемых в данном способе, проводят после завершения элюции. Сорбент сначала промывают водой (5 8 объемов колонки), затем 1 н. раствором соляной кислоты (до pH 1,8 на выходе колонки), после чего сорбент обрабатывают 1 н. раствором едкого натра (до pH 11,0 на выходе колонки) и промывают водой до pH 7,0 8,5.
Формула изобретения:
1. Способ получения цитохрома С, включающий обезжиривание сердец крупного рогатого скота, удаление из них связок и сосудов, измельчение и отмывку от крови, экстракцию измельченного сырья кислотным раствором, осаждение балластных белков сульфатом аммония, сорбцию и элюцию на карбоксильных катионитах, осаждение целевого продукта трихлоруксусной кислотой при охлаждении, очистку его диализом, отличающийся тем, что экстракцию проводят водным раствором сильной кислоты при 10 15oС и pH 3,9 4,2, полученный экстракт отделяют от фарша, подщелачивают его до pH 6,8 7,4 и сорбцию целевого продукта проводят непосредственно из экстракта на карбоксильном катионите, представляющем собой полимер из ряда, включающего сополимер метакриловой кислоты с N, N'-гексаметилендиметакриламидом и сополимер акриловой кислоты с дивинилбензолом в Na+-форме, элюцию проводят 10 12% -ным раствором сульфата аммония с pH 9,0 9,8, осаждение балластных белков осуществляют после стадии элюции, при этом сульфат аммония добавляют в количестве 0,5 г на 1 мл элюата при pH 7,2 7,5, а осаждение целевого продукта осуществляют из полученной надосадочной жидкости с использованием 20% -ного водного раствора трихлоруксусной кислоты, осажденный цитохром С растворяют в воде и диализуют против изотонического раствора хлористого натрия до полного удаления ионов SO24-.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что измельченное сырье экстрагируют 0,10 0,15% -ным водным раствором серной кислоты.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что измельченное сырье экстрагируют 2,0 2,5% -ным водным раствором трихлоруксусной кислоты.
Очистка
Почти все ферменты, выделяемые в настоящее время в промышленных масштабах, относятся к внеклеточным, т.е. к таким, которые выделяются клетками в окружающую среду. Выделение таких ферментов проще, чем внутриклеточных. Целевые ферменты, находящиеся внутри микробных клеток, не только имеют свойства, которые весьма похожи на свойства многих других внутриклеточных ферментов, но также сильно загрязнены различными контаминантами. У многих микроорганизмов внутриклеточные ферменты защищены исключительно плотной оболочкой. Однако, несмотря на это, за последние годы несколько внутриклеточных ферментов начали производиться в промышленных масштабах. К ним, в частности, относятся глюкозооксидаза для консервации пищевых продуктов, пенициллинацилаза для превращения антибиотиков и аспарагиназа для возможной терапии раковых заболеваний. Хотя процессы выделения внутриклеточных и внеклеточных ферментов существенно отличаются друг от друга, многие из применяемых для этого операций являются общими. Следует сделать особый акцент на указанной общности, поскольку именно в этом направлении усматриваются наибольшие надежды на то, что в будущем значительно больше ферментов станет производиться промышленностью на одних и тех же технологических линиях.
Подавляющее большинство применяемых в настоящее время ферментов относится к внутриклеточным. До тех пор, пока не будут найдены штаммы микроорганизмов, способные к выделению таких ферментов в культуральную жидкость, главная роль в прогрессе производства ферментов будет принадлежать технологической стадии выделения их из клеток. Есть основания полагать, что в ближайшее десятилетие многие из известных ферментов смогут выделяться из микробных клеток уже в промышленных масштабах, что создаст стимул для реализации на практике ряда процессов биосинтеза и биотрансформации в реакторах с изолированными биокатализаторами-ферментами.
1. Осаждение
Процесс при котором добавление некоторых реагентов или изменение условий вызывает выход белка из раствора с образованиемо садка нерастворимых частиц называется преципитацией, или осаждением. В ферментологии этот термин не имеет того специфического сопутствующего значения, которое характерно для общей химии, где он означает химическое связывание за счет обмена связями-мостиками. В самом деле, круг методов осаждения ферментов чрезвычайно широк. Эти методы простираются от добавления нейтральных солей и спиртов или изменения рН до специфического химического действия ионов металлов и органических реагентов.
1.1 Высаливание
Термином "высаливание" называют осаждение белков при высокой концентрации нейтральных солей. Этот метод является одним из старейших и наиболее широко применяемых 'при выделении или фракционировании белков. Среди применяемых солей предпочтение отдается сульфату аммония, так как он достаточно дешев и имеет высокую растворимость даже при пониженных температурах. При хранении сульфат аммония проявляет тенденцию к закислению, а при повышенных значениях рН - к выделению аммиака. Поскольку сульфат аммония в высшей степени коррозионно способен в отношении металлов и бетона серьезную проблему составляет нейтрализация его остатков.
Сульфат натрия не имеет указанных недостатков, но должен применяться с целью достижения адекватной растворимости при температуре 35-40°С. Резкое снижение растворимости при повышении температуры позволяет достаточно просто обеспечить "восстановление" остаточной соли, но требует для этого предварительного нагревания любого производственного оборудования и осуществления строгого контроля температуры с тем, чтобы предотвратить преждевременную кристаллизацию и забивание оборудования, и коммуникаций. Наблюдаемое снижение растворимости белка при повышении концентрации соли может быть охарактеризовано уравнением
где - растворимость белка; с - концентрация соли; и К - константы, индивидуальные для каждой конкретной белковой системы (является также функцией температуры и рН).
Данное эмпирическое уравнение справедливо только для конкретного режима высаливания. Оно дает надлежащую основу для проведения в лабораториях операций фракционированного осаждения, благодаря которым ферменты с различными значениями (J3 и К частично, разделяются друг от друга. При проведении лабораторных экспериментов наблюдали, что усиление перемешивания оказалось выгодным при осуществлении периодического процесса осаждения пектиназы в том отношении, что оно позволяло увеличить скорость всего процесса осаждения и выделения фермента.
Все это уменьшало зависимость потерь фермента от продолжительности процессов обработки. При использовании сульфата аммония показано, что феномен осаждения критически зависит от примененного метода контактирования соли с обрабатываемой жидкостью.
Периодическое осаждение насыщенным раствором сульфата аммония повышало процент насыщения, при котором происходило высаливание, по сравнению со случаем, когда применялась та же соль, но в твердом состоянии. Очевидно, что непрерывное контактирование в потоке соли и белка с последующим уравновешиванием будет вести к дальнейшему изменению положения метода высаливания среди других методов выделения ферментов.
Для фумаразы и спиртовой дегидрогеназы, которые также подверглись изучению, уравнение скорости осаждения имеет такой порядок кинетики, который первоначально характеризуется весьма высокими значениями (до 3,1), но по мере завершения процесса приближается к единице. Образование твердой фазы завершалось примерно после 4-минутной экспозиции. Формирование осадка сопровождалось его ресуспендированием. Последний процесс характеризовался уравнением скорости первого порядка. Таким образом, различие между точкой завершения осаждения и конечным равновесием было эквивалентно примерно 4,5 % от насыщения.
1.2 Изменение температуры и рН
Зависимость величины из уравнения от температуры и рН означает, по существу, что изменение растворимости может быть достигнуто или путем поддержания постоянства ионной силы раствора или же путем варьирования температурой или рН. Большинство белков проявляет нормальное увеличение растворимости при повышении температуры. Благодаря тому, что для ферментов наблюдается также обычная зависимость растворимости от температуры, температурные воздействия не часто применяются для интенсификации процесса фракционирующего осаждения. Однако различия в стабильности ферментов при повышенных температурах выражены довольно четко. Поэтому общепринятой процедурой для них служит селективная тепловая денатурация, которая ведет к необратимому осаждению. Причинами, по которым такая методика пользуется успехом у промышленников, являются ее простота и отсутствие необходимости иметь специальный, зачастую довольно дорогой реагент. Однако данный метод требует строгого контроля во избежание потерь продукта. Кроме того, зарастание теплообменников денатурированным белком может сделать метод трудно реализуемым.
Изменение рН также привлекает внимание как промышленный метод фракционированного осаждения, поскольку стоимость реагентов в этом случае невелика. Наличие широкого разнообразия соотношений между основными и кислыми группами в молекулах различных ферментов обусловливает широкий диапазон значений рН, при которых ферменты характеризуются изоэлектрическими свойствами или имеют пулевой заряд. Это согласуется с теорией растворимости, так как в указанной точке наблюдается самая низкая эффективная полярность, и фермент проявляет низкую растворимость в полярной водной среде.
Принципиальной трудностью в использовании диффepeнциaльнoгo осаждения под воздействием изменения рН является то, что диапазон рН, в котором многие ферменты остаются еще стабильными, весьма узок. Dunnill и другие исследователи, проводившие эксперименты с выделением пролил-t-PHK синтетазы из сои с применением Phaseolus aureus, попытались осуществить периодическое фракционирующее осаждение с помощью уксусной кислоты. Было установлено, что при рН 5,0 основная часть белка переходила в осадок, однако дляперевода в осадок синтетазы оптимум рН находится на уровне 4,2. Из-за того, что стабильность фермента при низких значениях рН резко уменьшалась, процесс сопровождался значительными потерями материала. По этой причине было применено непрерывное осаждение в сочетании с непрерывной сепарацией при использовании дисковых центрифуг с периодической разгрузкой. Это снижает длительность процесса переработки 25 кг сои с 9,5 до 3 ч. Масштабирование указанного процесса возможно без изменения оборудования.
1.3 Осаждение органическими растворителями
Теперь уже вполне определенно известно, что большинство молекул ферментов имеют полярные группы, являющиеся внешними по отношению к молекуле. Добавление органических растворителей к водным растворам белков будет понижать диэлектрическую постоянную смеси, создавая среду, которая больше отличается от полярной поверхности молекул фермента. Как свидетельствует теориярастворимости, это ведет к снижению растворимости белков. Однако, поскольку молекулы ферментов имеют внутренние гидрофобныеаминокислотные остатки и поэтому относительно свободно могут свертываться, то альтернативно добавлению органических растворителей они принимают новую, неактивную форму с экспонированием в окружающую среду гидрофобных группировок. Повреждение таких молекул при изменении их формы и последующая денатурация тем больше, чем выше температура. Это приводит к необходимости использовать для фракционирования большинства ферментов с помощью органических осадителей низкие температуры (часто ниже 0° С).
2. Коагуляция и флокуляция
Слово "коагуляция" описывает в данном случае ситуацию, когда очень мелкие частицы вынуждены сцепляться друг с другом. Заряд на частицах нейтрализуется при добавлении поливалентных ионов, несущих противоположный заряд, вследствие чего наступает ихкоалесценция (слипание). Довольно долго в этих целях использовали неорганические соли. В последние годы получили распространение органические полиэлектролиты.
Термином "флокуляция" описывается образование значительно более рыхлых агрегатов, в которых флокулирующий агент выполняет роль мостикообразова - теля между частицами. Флокулирующие агенты включают в себя различные природные полимеры, такие, как желатина, и большое количество синтетических полимеров. Полимеры могут быть электролитами или неэлектролитами. Неорганические ионы не могут вызывать флокуляцию, хотя они могут быть использованы для нейтрализации зарядов частиц и в этом отношении способствовать флокуляции. Органические полиэлектролиты могут вызывать одновременно и коагуляцию и флокуляцию. Методы коагуляции и флокуляции применяют при работе с цельными микробными клетками, остатками клеток после лизиса и растворимыми белками.
2.1 Цельные клетки
При выделении ферментов флокулянт, если он присутствует в системе, не должен взаимодействовать с внеклеточными ферментами. При промышленном получении внеклеточной протеазы из Bacillus subtilis успешное применение нашли синтетические полиэлектролиты как вспомогательное средство, облегчающее отделение микробных клеток на фильтр-прессах. Поскольку флокулянт связывается с клетками, он может при последующем разрушении клеток для выделения ферментов войти в контакт с этими ферментами.
Проблеме коагуляции и флокуляции микробных клеток посвящено весьма мало исследований, за исключением работ, направленных на решение частных задач в пивоварении. Nakamura со ставил перечень основных требований, которые должны предъявляться к реагентам, предназначенным для применения в качестве коагулянтов или флокулянтов микробных клеток. К ним относятся: низкая стоимость, низкая доза применения и отсутствие резкого влияния на изменение рН. Среди неорганических веществ в качестве потенциальных коагулянтов было испытано множество агентов, включая квасцы, соли железа и кальция. Хлорид кальция (0,1-0,5 %) применялся с гидроокисью натрия (0,2-0,8 %) для того, чтобы обеспечить поддержание рН смеси на уровне 8,0-9,5. Эффективным агентом при этом оказалась гидроокись кальция, вызывающая коагуляцию и копреципитацию (совместное осаждение). Кальций может быть удален из концентрированной клеточной массы путем добавления разбавленной кислоты. Особенно эффективными оказались титановые соли в концентрации около 0,01 % для дрожжей, бактерий и микроводорослей. Это связано с четырехвалентным зарядом иона титана.
Была изучена флокуляция различных бактерий катионным полиамином и положительно заряженными микроскопическими волокнамиалюминия. Количество алюминия, потребного для флокуляции Е. coli, составляло около одной десятой от того, что требовалось в случаеLactabacillus deilbruckii. Эффективность флокуляции зависела от температуры, физиологического "возраста" культуры, характерасуспендирующей среды и особенно от фактических усилий сдвига, воздействовавших; на клетки перед флокуляцией.
2.2 Остатки клеток и белки
Получающиеся после разрушения микробных клеток (для выделения внутриклеточных ферментов) остатки клеточной оболочки обычно подлежат удалению из смеси до того, как она будет подвергнута фракционированию с целью получения различных белковых компонентов. Остатки клеток при механическом разрушении последних колеблются в размерах от нескольких микрон до долей микрона и поэтому трудно подвергаются извлечению из смеси. На помощь в этом случае приходят флокуляция и коагуляция клеточных остатков. Однако весьма существенно, что такие методы обработки суспензий приводят к переводу в нерастворимое состояние также и внутриклеточных ферментов. В отношении седиментации клеточных остатков эффективными коагулянтами оказались квасцы. Однако они переводят белок в нерастворимое состояние с образованием мелких, медленно оседающих, нерастворимых флокул.
Флокуляция или коагуляция ферментов с целью получения нерастворимых белковых агрегатов представляет собой достойную альтернативу классическим методам осаждения, которые требуют высоких концентраций реагентов.
На протяжении ряда лет с целью выделения внеклеточных ферментов из культуральных жидкостей использовалась дубильная кислота. В концентрациях 0,1 - 1,0 % она образует легко фильтрующиеся осадки. Флокулы содержат достаточно устойчивые ферменты и могут быть промыты ацетоном для удаления дубильной кислоты. В случае применения таких носителей, как крахмал (2 - 5 %), при высушивании флокул может быть достигнуто 100-кратное увеличение концентрации ферментов. Непосредственное высушивание в отсутствии носителя обеспечивает 500 - кратное увеличение концентрации. Флокулы обладают тем недостатком, что трудно подвергаются растворению.
3. Центрифугирование
Отделение твердых частиц от жидкостей представляет собой основную операцию в процессе выделения ферментов. Оно включает выделение клеток из культуральной жидкости, удаление клеточных остатков, сбор осадка и выделение адсорбентов белка из белоксодержащей надосадочной жидкости. Общепринято также включать в эту операцию отделение растворенных макромолекул от растворителя с помощью ультрацентрифугирования.
3.1 Сигма-анализ
Определенные трудности при сепарировании биологических частиц центрифугированием проистекают чаще всего из недостаточного понимания принципов процесса седиментации частиц в гравитационном поле. Эффективность центрифугирования повышается при увеличении диаметра частиц, разности между плотностями частицы и жидкости и при уменьшении вязкости жидкости. Эффективность также возрастает при повышении угловой скорости, увеличении радиуса центрифугирования, увеличении объема жидкости и уменьшении толщины слоя жидкости, подвергаемой центрифугированию. Однако биологические частицы характеризуются низкой плотностью и очень малыми размерами. Они также могут находиться в среде, которая благодаря присутствию растворенных твердых частиц обладает высокой вязкостью и повышенной плотностью.
В условиях лабораторий указанные неудобства могут быть преодолены путем применения центрифуг с высокой угловой скоростью. Однако эти центрифуги имеют очень малую производительность и работают периодически с точки зрения подачи в них суспензии и извлечения надосадочной жидкости и сконцентрированных твердых частиц. В случае центрифуг промышленного типа повышение производительности за счет увеличении радиуса центрифугирования не может быть достигнуто, так как механические напряжения возрастают пропорционально квадрату радиуса. Поэтому конструкция машины при увеличении радиуса ротора быстро становится небезопасной для применения.
Увеличение вместимости корзины центрифуги и непрерывное пропускание через нее центрифугируемой жидкости ограничивает величину безопасной угловой скорости. Эта величина также ограничивается, если твердый осадок подлежит разгрузке непосредственно в ходе операции, поскольку значительное влияние на угловую скорость оказывает степень дебаланса. Исходя из этих ограничений, промышленность создала ряд центрифуг, применимых к переработке продуктов биологической природы. Но только лишь некоторые из них оказались пригодными для выделения ферментов, так как чрезвычайно ограничивающим фактором в этом отношении являются свойства системы жидкость - "твердая" частица. Для сепарации микробных клеток, остатков животных и микробных клеток и различных типов осадков применяются главным образом три типа центрифуг: трубчатые, многокамерные и дисковые. Меньшее, хотя и очень важное, применение находят спиральные центрифуги, центрифуги с твердой корзиной и ультрацентрифуги.
3.2 Центрифуги с роторами трубчатого типа
Цилиндрический ротор подвешивается при помощи гибкого вала к находящемуся в головке центрифуги мотору или воздушной турбине. Такая конструкция снижает нагревание ротора по сравнению с тем, что имеет место при нижнем расположении привода. Ротор установлен в подшипниках скольжения из мягкого металла. Для этой цели обычно применяется латунь, и хотя теоретически контакт между обрабатываемой жидкостью и подшипниками и данном типе машин не должен иметь места, тем не менее в тех случаях, когда обработке подвергаются растворы сульфата аммония, может происходить явная контаминация их медью. Подшипники скольжения из сплава Вууда являются в этом плане относительно надежной альтернативой при более высокой или более низкой частоте вращения в машинах небольших масштабов. Ослабление таких подшипников дает возможность ротору возвращаться в центрированное положение во время любого временного разбалансирования и обеспечивает более высокую частоту вращения по сравнению со всеми другими типами центрифуг, за исключением зональных ультрацентрифуг. В случае лабораторной модели центрифуги Sharpies IP (Pennwalt) с диаметром ротора 4,5 см и частотой вращения 50 ООО об/мин развивается усилие в 62 500 g, а в случае модели 6Р (диаметр ротора 10,8 см, частота вращения 15 500 об/мин) - 14 000 g. Модель IP оснащена воздушной турбиной, модель GP приводится в действие с помощью электродвигателя.
Жидкость перекачивается в ротор через донный штуцер, омывая при этом нижние подшипники. По море продвижения жидкости вверх по ротору происходит седиментация находящихся в ней твердых частиц на стенках ротора. Освобожденная от твердых включений жидкость отбрасывается центробежной силой из ротора в его верхней части и собирается в окружающую ротор чашу. Обе модели при обработке суспензий микробных, животных и растительных клеток, большинства суспензий остатков микробных клеток, а также суспензий твердых белковых адсорбентов дают прекрасное их осветление, а также прекрасное обезвоживание полученных твердых осадков. С помощью лабораторной модели можно также отделить от жидкой фазы белковую фракцию, осажденную солями или полимерами. Однако отделение невозможно, если плотность жидкости очень высока.
Применение пластиковых гильз ускоряет удаление осадка по сравнению с тем, как это происходит в случае извлечения из машины самого центрифужного ротора. Время оборачиваемости 15 - 20 мин. Однако количество накапливаемого твердого осадка при этом незначительно - около 4 кг (по влажной массе).
Вывод жидкости из центрифуги влечет за собой ценообразование и генерирование аэрозоля. Последний может представлять опасность. Поэтому все машины, занятые в производстве ферментов, должны позволять осуществлять их монтаж внутри ограждающего кожуха. Аэрация жидкой фазы при разгрузке центрифуг может повреждать находящиеся в ней ферменты, особенно когда они содержат активные сульфгидрильные радикалы. В этих случаях может оказаться полезным применение противопенных и защитных в отношении сульфгидрильных групп агентов.
Следует иметь в виду, что при входе обрабатываемой суспензии в центрифугу очень высокое угловое ускорение может привести к дезагрегированию имеющихся в ней конгломератов и элементов осадка и, следовательно, к уменьшению вероятности удаления твердых частиц из жидкости. Когда двигатель выключается, жидкость, остающаяся в роторе центрифуги, будет вытекать из нее через донный штуцер и может выносить с собой определенное количество твердых частиц. Поэтому не следует смешивать эту часть жидкости с уже осветленной.
Несмотря на указанные недостатки, такие простые и доступные машины, как описанные центрифуги, являются наиболее пригодными и универсальными для разделения жидкой и твердой фаз при получении ферментов в полупромышленных условиях.
3.3 Многокамерные центрифуги
В машинах центробежного типа размеры ротора ограничиваются механическими усилиями. Альтернативой центрифугам с роторами большой вместимости являются многокамерные центрифуги, у которых серии концентрических камер монтируются внутри и снаружи ротора (рис.3 - б). Сложность такого ротора и его жесткое монтирование на донном подшипнике выше коробки передач и электродвигателя ограничивают возможную частоту его вращения (для ротора диаметром 46 см - 6500 об/мин). Жидкость вводится в центрифугу через центральную трубку, преодолевает зигзагообразный путь вверх и вниз между концентрически расположенными камерами и удаляется с помощью насоса центростремительного действия, расположенного концентрически относительно трубы, подводящей обрабатываемую жидкость. Твердые частицы собираются на внутренних поверхностях каждой камеры, а не осевшие во внутренних камерах движутся наружу, где подвергаются воздействию еще больших седиментационных сил. Однако для достижения необходимой степени обезвоживания осадок должен почти полностью заполнять весь ротор центрифуги.
В некоторых моделях многокамерных центрифуг, по мере того как ротор замедляет свой ход, жидкость приостанавливает движениепо камерам и проходит через отверстие вблизи центральной оси. В других моделях жидкость удаляется посредством сифонирования. Но в обеих из них твердый осадок может быть довольно легко вымыт из ротора центрифуги. Поэтому многокамерные центрифуги хорошо подходят для одноразового применения, когда размер ротора может быть выбран довольно точно и исходя из желательного объема партии получаемого материала. Они менее годятся для случаев, когда загрузка исходной суспензии твердой фазой может существенно изменяться. Разборка многокамерных центрифуг - операция довольно длительная, поскольку прокладки при разборке сохранить весьма затруднительно, твердый осадок должен соскабливаться со стенок осадительных камер без разборки машины. Квадратное поперечное сечение ротора центрифуги и ее расположение непосредственно над коробкой передач затрудняют отвод тепла от электродвигателя и шестерен коробки передач.
Стандартная многокамерная центрифуга может охлаждаться с помощью холодной воды, подаваемой через распылительную головку, смонтированную над центрифужной корзиной. Однако такой способ охлаждения не обеспечивает отвода тепла от центростремительного разгрузочного насоса, который является вторым источником генерации тепла (температура поднимается на 15°С при производительности, не достигающей расчетного значения).
4. Хроматография
С процессами выделения ферментов в первую очередь связаны операции разрушения клеток, экстракции с помощью растворителей, осаждения, сепарации в фазах твердое вещество - жидкость. Возможности этих операций как средства для фракционирования ферментов в промышленных масштабах ограничены. Основной удельный вес в процессах фракционирования ферментов приходится на группу операций, построенных на феномене различной миграции ферментов. Наиболее важными из указанных операций являются хроматографияи связанные с ней периодические операции сорбции-десорбции. Определенную роль в качестве операций (методов) дифференциальной миграции могут играть также электрофорез и зональное ультрацентрифугирование. Периодические процессы сорбции-десорбции являются специальным случаем дифференциальной миграции, при котором один или несколько компонентов не могут мигрировать или перемещаться под влиянием определенной движущей силы, в то время как другие компоненты к этому способны. Все другие методы дифференциальной миграции по сравнению с дистилляцией характеризуются как подлинно автоматические каскадные.
При каскадных операциях множество ступеней очистки материала располагается в определенной последовательности. Каждая ступень способна обеспечить лишь небольшое обогащение продукта целевым компонентом. Но при этом общая достигаемая мощность сепарирования может быть значительной. Некоторые каскадные системы для биологической сепарации, такие, как противоточные машины, включают автоматическое сопряжение дискретных стадий сепарации. Однако в большинстве систем, включая системы для хроматографии,электрофореза и ультрацентрифугирования, сочетание стадий производится непосредственно в пределах общей системы, а индивидуальные стадии обогащения не могут быть разделены ни в одном случае, кроме теоретических выкладок. В наиболее благоприятных случаях разделяющая способность каскадных методов, используемых при биологической сепарации, выражена настолько же сильно, как и при процессах дистилляции, но при очистке внутриклеточных ферментов она является критической из-за большой сложности подлежащей фракционированию смеси.
Периодические методы сорбции-десорбции по сепарирующей способности занимают промежуточное положение между методами осаждения и хроматографии. Однако их наиболее удобно обсуждать после рассмотрения возможностей таких процессов с сильно выраженной разделяющей способностью, как процессы хроматографии, т. с. когда механизм процессов сорбции-десорбции уже выяснен.
Хроматография определяется как равномерная перколяция, т.е. фильтрация через адсорбирующий слой зернистого материала,, жидкости, проходящей через колонку, заполненную определенным, более или менее тонко раздробленным веществом, которое селективно задерживает конкретные компоненты жидкости. Это пространное определение, сформулированное в 1950 г. A. J. P. Martin, охватывает широкий диапазон селективных методов задержания и элюирования (извлечения из адсорбента) уловленных жидкостей. Для выделения ферментов с применением методов хроматографической сепарации наиболее важными представляются их водные растворы. Ниже будут рассмотрены общие пути селективного задержания ферментов методами хроматографии с тем, чтобы на этой основе обсудить проблемы масштабирования соответствующих процессов.
4.1 Адсорбция
Первые операции хроматографической сепарации, связанные с получением ряда биохимикалиев, были проведены с применением веществ, которые адсорбируют их благодаря силам Ван-дер-Ваальса и пространственному взаимодействию. Указанные силы являются наиболее важными для веществ со сла - бовыраженной полярностью. В случае более полярных веществ серьезная проблема может возникнуть в связи с необратимым характером связывания всех компонентов.
При выделении ферментов применяется ограниченный круг адсорбентов. Широко используется в лабораторных работах фосфат кальция, особенно в кристаллической форме, известной как гидро - ксилапатит. Недостаточно совершенные его механические свойства и ограниченность размера гранул сдерживают применение гид - роксилапатита в колоннах крупных масштабов. Однако недавно проведенные работы свидетельствуют о прогрессе в данном вопросе. При лабораторных работах в определенной мере применяется также алюминий, особенно в форме у-алюмогеля. Однако его механические свойства неудовлетворительны, а текучесть выражена крайне слабо. Для адсорбции белков п редких случаях, но все же применяется диатомитовая земля.
Побочная адсорбция белка при применении диатомитовой земли в качестве основы грунтовочного слоя при фильтрации представляет серьезную проблему.
4.2 Фракционирование посредством ионного обмена
Раздробленные вещества с ионообменными свойствами предста - ляют собой наиболее важные твердофазные продукты для фракционирования ферментов. Широкое индустриальное применение нашли материалы, у которых ионообменные группы присоединены к гидрофобным остовам, как это имеет, например, место у сополимера дивинилстирола. Однако их применение к решению задач получения ферментов ограничивается случаями, когда идет речь об устойчивых ферментах, имеющих небольшие молекулы. Эти ограничения обусловлены слаборазвитой пористостью материалов, которые имеют требуемый размер пор. К тому же гидрофобные остовы молекул полимеров могут в потенции оказывать дестабилизирующее влияние на ферменты. Широко используются в лабораториях ионообменники на основе целлюлозных и декстрановых остовов. Как и в случае адсорбции, общепринято начинать хроматографическое разделение с добавления к системе белка, предполагая, что некоторые или все компоненты смеси прочно связаны друг с другом.
4.3 Сорбция-десорбция
Препаративная хроматография па границе фаз твердое вещество - жидкость представляет собой самую медленную операцию в общей технологической схеме выделения ферментов. Хотя этот метод не имеет равных по фракционирующей способности, известно множество примеров, когда этой способностью жертвуют ради достижения более высокой производительности. Как было показано для проведения процессов адсорбции, ионного обмена и аффинной хроматографии наиболее пригодны периодические методы. Периодические процессы сорбции-десорбции могут проводиться или в колонках насадочного типа, или путем перемешивания адсорбента с раствором фермента в аппарате емкостного типа с мешалкой с последующим применением метода сепарации и отделения твердой фазы от жидкой. Требования к конструкции насадочных колонок в этом случае могут быть менее строгими, чем в случае зональной хроматографии, так как в процессах сорбции-десорбции желательно использовать весь объем насадки. Однако и при этом следует обеспечить поршневое течение жидкости.
Альтернативный метод, включающий стадию отделения твердой фазы от жидкой, может быть реализован различными путями. При работе с плотными гидрофобными гелями осаждение в поле силы тяжести может быть адекватно стадии вторичной промывки. Для гидрофильных носителей желательно применение центрифугирования или фильтрации. При центрифугировании могут использоваться роторные центрифуги, центрифуги со сплошным ротором или сепараторы. Роторные центрифуги отличаются ограниченной производительностью, а разливающиеся на входе в эти машины суспензии срезающие усилия могут вызывать абразивное повреждение ее компонентов. Эта отличительная способность к повреждению присуща также и применяемым иногда спиральным центрифугам. Отвечают условиям процесса разделения фаз высокопроизводительные центрифуги со сплошным ротором. Но идеальными в этом отношении являются сепараторы, обеспечивающие эффективное обезвоживание и промывку осадка. Если необходимо, могут быть оборудованы автоматическим устройством для разгрузки твердой фазы с помощью приводного поршня.
...Подобные документы
Технология производства лекарственного препарата "Нитокс 200". Сведения о продукции и факторы, влияющие на ее качество. Диаграммы Исикавы, Парето. Анализ стабильности основных процессов лекарственного препарата. Расчет среднеквадратического отклонения.
курсовая работа [113,9 K], добавлен 10.01.2011Спектр полезных свойств природного полисахарида хитозана и его широкое применение в самых различных областях. Свойства вещества – экологически чист и полностью распадается в природных условиях, не опасен для человека. Панцири камчатских крабов как сырье.
курсовая работа [96,6 K], добавлен 24.02.2009Способ получения хитозана, предусматривающий последовательное экстрагирование водой. Получение патента. Использование изобретения - устройство для получения полимерных гранул. Сущность изобретения. Анализ патентной и научно-технической документации.
дипломная работа [21,3 K], добавлен 24.02.2009Распространенность металлов в природе. Содержание металлов в земной коре в свободном состоянии и в виде сплавов. Классификация областей современной металлургии в зависимости от методов выделения металлов. Характеристика металлургических процессов.
презентация [2,4 M], добавлен 19.02.2015Широкое применение металлорежущих станков с числовым программным управлением и автоматизированных технологических комплексов. Изготовление режущих инструментов. Выбор заготовки для детали. Технологический процесс изготовления отливок. Литье под давлением.
реферат [32,4 K], добавлен 24.02.2011История применения красителей, номенклатура их производства, техническая и химическая классификации. Химические свойства, применение, способы и стадии промышленного производства оптических отбеливателей. Способы очистки сточных вод от красителей.
курсовая работа [412,5 K], добавлен 02.05.2011Построение экспериментальных искусственных наномашин с использованием биологических природных материалов, синтез живых и технических систем. Молекулярная электроника, свойства наноструктур, разработка новых способов их получения, изучение и модификация.
контрольная работа [38,1 K], добавлен 14.11.2010Достижения науки и техники XX века. Предсказание Эйнштейном в 1916 г. существования вынужденного излучения - физического базиса действия любого лазера. Широкое применение лазера во всех отраслях науки и техники. Развитие лазерной техники в России.
реферат [21,3 K], добавлен 08.03.2011Строение полупроводникового материала группы АIIIВV – GaAs, сравнение свойств арсенида галлия со свойствами кремния, способы получения, использование в качестве деталей транзисторов. Перспективы развития технологии изготовления приборов на его основе.
курсовая работа [2,6 M], добавлен 04.12.2012Широкое применение сварки в строительстве и на предприятиях строительной индустрии. Ее технико-экономические преимущества по сравнению с другими способами соединения металлических заготовок и деталей. Физическая сущность и основные способы сварки.
курсовая работа [1,6 M], добавлен 07.11.2010Обработка пивной дробины анолитом для ее дезинфекции и подбор ферментного препарата для гидролиза ее ингредиентов. Интенсификация процессов брожения при производстве кваса и пива за счет использования спирулины платенсис в качестве источника питания БАД.
дипломная работа [9,9 M], добавлен 21.11.2014Научная систематика рыб семейства лососевых, их образ жизни и жизненный цикл. Строение и биохимическая ценность красной икры и липидов лососевых рыб. Способы получения и применение биологически активных веществ из мышечной ткани и молок лососевых рыб.
курсовая работа [544,4 K], добавлен 22.11.2014Требования, предъявляемые к каучукам. Свойства и применение бутадиен-стирольных каучуков. Способы получения бутадиен-стирольного каучука полимеризацией в растворе и в эмульсии, их стадии и схемы процесса. Расчёт материального баланса производства.
курсовая работа [811,5 K], добавлен 16.09.2013История изобретения и использования подъемных устройств. Упоминания о существовании прообразов лифтов. Применение паровой машины в качестве привода для них в начале XIX века. Значение и функции современных лифтов. Принципы устройства их приводной системы.
реферат [16,9 K], добавлен 29.10.2013Технологические процессы в промышленности, связанные с затратой или выделением энергии, ее взаимными превращениями из одного вида в другой. Роль энергии в технологических процессах и ее рациональное использование. Применение нефти для получения топлива.
контрольная работа [26,4 K], добавлен 20.09.2011Изучение промышленных способов получения металлов. Электрометаллургия - под действием электрического тока. Гидрометаллургия - на основе химических реакций в растворах. Пирометаллургия - при высоких температурах. Металлотермия - выделение из оксидов.
презентация [3,8 M], добавлен 31.01.2012Физические и химические свойства никеля, распространение в природе. Методы получения: селективное обогащение руды; технология извлечения из штейна, выщелачивание. Применение никеля в сплавах, в аккумуляторах, в радиационных технологиях, в медицине.
реферат [58,6 K], добавлен 17.01.2013Способы получения пекарских дрожжей. Промышленное производство дрожжей без запаха и вкуса. Особенности получения данного продукта методом химической активации. Характеристика и технология получения винных дрожжей с высокой бродильной активностью.
реферат [44,7 K], добавлен 08.12.2014Свойства винилацетата и его применение. Общие методы получения винилацетата. Технология получения винилацетата окислением этилена в присутствии уксусной кислоты. Характеристика сырья технологии. Сравнение различных методов получения винилацетата.
курсовая работа [2,0 M], добавлен 25.12.2009Применение промышленных роботов в производстве. Технические характеристики токарного станка. Выбор промышленного робота. Загрузочно-накопительное устройство. Компоновка роботизированного технологического комплекса. Блок-схема и циклограмма работы.
контрольная работа [604,4 K], добавлен 07.06.2014
