Аналіз технології визначення вмісту глюкози у виноматеріалі ензимним амперметричним біосенсором

На відміну від НАД+-ГД, ПХХ-ГД має у своєму складі кофактор піролохінолінхінон, однак через його слабкий зв'язок з апоензимом біосенсори на основі цього ензиму також, як правило, не виявляють високої стабільності та придатні лише для одноразового використання.

Застосування ГОД для розроблення глюкозного біосенсора видається більш перспективним, оскільки цей ензим має у своєму складі сильно зв'язаний природний кофактор (ФAД) та виявляє високу стабільність після іммобілізації у біоселективну мембрану.

Створені із застосуванням НАД+- та ПХХ-залежних глюкозодегідрогеназ біосенсори здатні детектувати від 9-10 мкМ глюкози.

Межа визначення біосенсорів на основі ГОД є дещо вищою -- 30-60 мкМ і лише для описаного у роботі датчика вона становила 4,4 мкМ. Верхня межа лінійного діапазону для біосенсорів з іммобілізованою ГД становить 0,8 мМ, з ГОД -- 1,5, 3, 8 і навіть 25 мМ.

Датчики з іммобілізованою ГОД -- високостабільні, вони виявляють 100 % активності через місяць та до 95 % через 8 місяців зберігання. Стабільність біосенсорів, створених на основі дегідрогеназ, є значно нижчою -- 80 % від початкового сигналу через місяць зберігання для ПХХ-ГД та 30 % через 2 тижні для НАД+ ГД. Операційна стабільність біосенсорів з іммобілізованою ГОД також є вищою -- 100 % активності через 120 год. безперервної роботи, тим часом як датчик з ПХХ-ГД після 20 год. вимірювань зберігає 60 % від початкового відгуку.

Наведені дані свідчать про перспективність розроблення глюкозного біосенсора саме на основі глюкозооксидази, однак його використання для контролю якості вина може супроводжуватися низкою складнощів під час проведення аналізу. Передусім це пов'язано з наявністю у вині цілого спектра різноманітних речовин, що можуть впливати на відгук біосенсора і спричинювати виникнення похибок, а іноді й унеможливлювати застосування біосенсорів у виноробстві. До таких інтерферуючих речовин належить, зокрема, аскорбінова кислота, яка міститься у вині та суслі у значній кількості й у процесі аналізу призводить до появи неспецифічного сигналу, ускладнюючи інтерпретацію результатів.

Електрохімічно активні фенольні компоненти, на які особливо багаті червоні вина, також можуть істотно впливати на роботу амперометричного біосенсора, особливо вони перешкоджають аналізу сухих вин з незначним вмістом глюкози --менше 1 г/л.

Наприклад, у роботі повідомляється, що біосенсор на основі іммобілізованої у парах глутарового альдегіду (ГА) ГОД та вуглецевого електрода дає відгук близько 200 нА на внесення в електрохімічну комірку 0,25 мМ аскорбінової кислоти. Нанесення додаткової нафіонової мембрани дозволило знизити цей неспецифічний сигнал майже у 10 разів. У ще одному дослідженні встановлено, що біосенсор з іммобілізованою у парах ГА ГОД дає незначний відгук на етанол та лимонну кислоту. Проте істотний відгук спостерігався у цьому разі на внесення в електрохімічну комірку 10 мМ аскорбінової кислоти або 20 мМ фруктози -- він був еквівалентним відгуку на 0,138 мМ глюкози. Іншою групою дослідників встановлено, що іммобілізована у парах ГА ГОД не реагує на етанол та фруктозу, проте на внесення 10 мМ аскорбінової кислоти дає відгук, рівний відгукові на 0,36 мМ глюкози. Дослідження селективності біосенсора на основі іммобілізованої ПХХ-ГД показало, що він не реагує на внесення в електрохімічну комірку етанолу та гліцеролу.

Аналіз впливу інших інтерферуючих речовин на роботу глюкозного біосенсора не проводився. Таким чином, залежність роботи глюкозних датчиків від інтерферуючих речовин ускладнює, а іноді й унеможливлює визначення за їх допомогою вмісту глюкози у реальних зразках виноматеріалів. Тому в разі використання глюкозних біосенсорів для аналізу вина та виноматеріалів їхня селективність має бути поліпшена, а неспецифічний відгук -- мінімізований. Метою даної роботи оптимізація методики визначення глюкози амперметричним біосенсором на основі іммобілізованої глюкозооксидази та платинового друкованого електрода SensLab для проведення її аналізу у винах та виноматеріалах.

Матеріали і методи.

У роботі використовували ензим глюкозооксидазу з Penicillium vitale виробництва фірми КНПО «Діагностикум» (Львів, Україна) з активністю 130 од. акт./мг. Для електрохімічної полімеризації ензиму застосовували мономер 3,4-етилендіокситіофен (ЕДТ) виробництва фірми Baytron M (Німеччина) та полі(етиленгліколь) 1450 фірми Sigma (Швейцарія). Для іммобілізації ензиму використовували бичачий сироватковий альбумін (БСА) виробництва фірми Sigma-Aldrich Chimie S.a.r.l. (Франція) та глутаровий альдегід виробництва фірми Fluka (Швейцарія). Також у роботі застосовували реагенти Na2HPO4·7H2O, KH2PO4, глюкозу та L-аскорбінову кислоту виробництва фірми Sigma-Aldrich Chimie S.a.r.l. (Франція), пероксид водню виробництва фірми «Фаргомед» (Україна), лактат натрію виробництва фірми Sigma (США), етанол виробництва фірми Fluka (Німеччина) і гліцерол виробництва України. Усі реактиви, як вітчизняного, так й імпортного виробництва були кваліфікації «ос. ч.» і «х. ч.».

Вимірювання. Усі електрохімічні експерименти було виконано за допомогою традиційної триелектродної системи, в якій друкований електрод SensLab (SensLab GmbH, Leipzig, Німеччина) поєднав у собі всі три електроди: платиновий робочий, допоміжний та електрод порівняння.

Платинові друковані електроди SensLab досліджували на відтворюваність та працездатність у діапазоні потенціалу від 0 до +600 мВ (швидкість розгортання потенціалу 20 мВ/с). Циклічну вольтамперометрію було виконано на потенціостаті PalmSens (Palm Instruments BV, Нідерланди).

Встановлено, що з додаванням у робочу комірку пероксиду водню спостерігається поява окиснювального струму та підвищення сигналу датчика. Як компроміс між чутливістю біосенсора та зменшенням впливу на його відгук інтерферуючих частинок (які зазвичай окиснюються при більш високих потенціалах) потенціал +200 мВ було обрано нами як робочий. Амперметричне вимірювання за постійного потенціалу проводили в електрохімічній комірці об'ємом 5 мл за допомогою потенціостата PalmSens.

Іммобілізація ГОД електрохімічною полімеризацією у полімері ЕДТ.

Процес електрохімічної полімеризації становить особливий інтерес, тому що є технологічно зручним. Він дозволяє обирати й підтримувати розмір, форму і товщину матриці та забезпечує чіткий контроль за процесом осадження ензиму і носія.

Окрім того, одержані із застосуванням цього методу напівпроникні полімерні плівки можуть виступати селективним бар'єром для електрохімічно активних інтерферуючих частинок, таких як аскорбінова кислота.

Для електрохімічної полімеризації у роботі використовували суміш компонентів, приготованих у 20 мМ фосфатному буфері, рН 6,2, яка складалася з 10-2 М 3,4-етилендіокситіофену, 10-3 М поліетиленгліколю та 30 мг/мл розчину ГОД. Полімеризацію ЕДТ здійснювали, прикладаючи потенціал від +0,2 В до +1,5 В зі швидкістю 0,1 В/с протягом 15 циклів.

Іммобілізація ГОД у парах глутарового альдегіду.

Для утворення біоселективних мембран готували суміш, що містила 30 мг/мл ГОД та 5 мг/мл БСА в 10 мМ фосфатному буфері, рН 7,2. У суміш додавали гліцерол до кінцевої концентрації 10 % длястабілізації іммобілізованого ензиму, а також для запобігання передчасному висиханню суміші, нанесеної на поверхню перетворювача. Для полімеризації мембран датчики вміщували в атмосферу насичених парівглутарового альдегіду на 10 хв, після чого підсушували на повітрі.

Визначення вмісту глюкози у модельних розчинах. Вимірювання проводили при кімнатній температурі у відкритому об'ємі за інтенсивного перемішування. Як робочий буфер використовували розчин 20 мМ KH2PO4 -- Na2HPO4, рН 7,2, оскільки, як було встановлено, саме такий рН є оптимальним для функціонування іммобілізованої ГОД. Концентрацію субстратів змінювали, додаючи певні аліквоти концентрованих розчинів. Після отримання кожного відгуку сенсор відмивали робочим буферним розчином до стабілізації базового сигналу.

Визначення вмісту глюкози у вині та в суслі. Аналіз глюкози проводили у 12 зразках вин різного типу, а також у 2 зразках білих та червоних виноматеріалів, вироблених в умовах мікровиноробства в Інституті винограду та вина «Магарач». Вимірювання вмісту глюкози у вині та в суслі за допомогою амперометричного біосенсора проводили у 20 мМ фосфатному буферному розчині, рН 7,2, при кімнатній температурі у відкритому об'ємі за інтенсивного перемішування. Визначення концентрації глюкози здійснювали за допомогою методу стандартних додавань. Для проведення аналізу пробу розводили у 250-1 000 разів. Після отримання кожного відгуку сенсор відмивали буферним розчином до стабілізації базового сигналу. Контрольне визначення глюкози у суслі та в готових винах проводили за допомогою методу високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) на хроматографі Agilent з використанням рефрактометричного детектора.

Аналіз результатів.

Робота амперометричних біосенсорів на основі ГОД базується на такій ензиматичній реакції:

Глюкоза + О2 > Глюконолактон + Н2О2.

Процес ензиматичного перетворення глюкози супроводжується виділенням електрохімічно активної речовини -- пероксиду водню, що окиснюється з утворенням електронів, які реєструються амперометричним перетворювачем: Н2О2 >О2 + 2Н+ + 2 e-.

На перших етапах роботи для іммобілізації ГОД застосовували метод електрохімічної полімеризації у полімері ПЕДТ, що довів свою ефективність під час розроблення амперометричного біосенсора для визначення лактату.

Калібрувальну криву амперометричного біосенсора на основі іммобілізованої у ПЕДТ глюкозооксидази подано на рис. 2. Мінімальна концентрація глюкози, що визначається розробленим біосенсором, становить 0,04 мМ, діапазон визначення вмісту глюкози в межах 0,04 -- 50 мМ.

Такий діапазон роботи біосенсора виявився неочікуваним, оскільки він був значно ширшим за визначений для біосенсорів з іммобілізованою іншими методами ГОД, описаних у роботах.

Було зроблено припущення, що глюкоза може окиснюватись на електродах без використання ензиму. Для дослідження цього феномену на поверхню амперометричного перетворювача замість ГОД було іммобілізовано бичачий сироватковий альбумін у ПЕДТ і отримано відгуки на внесення в електрохімічну комірку глюкози та інших основних компонентів вина. Як видно з рисунка, полімерна мембрана з ПЕДТ безензиму дає відгуки на етанол та гліцерол, проте практично не реагує на глюкозу у межах концентрацій, в яких реєструється надзвичайно широкий динамічний діапазон роботи біосенсора з іммобілізованою ГОД. Окрім того, у роботі було показано, що біосенсор на основі лактатоксидази, електрохімічно іммобілізованої на поверхню амперометричного електрода SensLab у ПЕДТ, також не давав сигналу на глюкозу. При цьому нами встановлено, що платиновий друкований електрод SensLab сам по собі, без будь-якої ензимної мембрани, практично не дає відгуку на основні інтерферуючі речовини вина.

Усе це свідчить про те, що такий нетипово широкий динамічний діапазон створеного датчика не є результатом неспецифічного окиснення глюкози, а зумовлений конформаційними змінами глюкозооксидази під час електрохімічної іммобілізації в ПЕДТ. Варто також зазначити, що у роботі, в якій ГОД було іммобілізовано на поверхню платинового електрода також шляхом електрохімічної полімеризації у полімері полі (о-фенілендіамін), верхня межа динамічного діапазону визначення біосенсора теж була досить високою -- 25 мМ.

Після одержання таких перспективних результатів біосенсор з іммобілізованою в ПЕДТ ГОД досліджували на селективність.

Було отримано калібрувальні криві розробленого датчика за етанолом (у межах концентрацій від 1 до 160 мМ), гліцеролом (0,05-51мМ), лактатом (0,5-40 мМ) та аскорбіновою кислотою (0,001-0,5 мМ). Можна зробити висновок, що іммобілізована у ПЕДТ ГОД майже не реагує на лактат та аскорбінову кислоту, проте дає істотні відгуки на внесення в електрохімічну комірку гліцеролу та етанолу, причому величина сигналу біосенсора на етанол становить близько 50 % від величини відгуку на еквівалентну концентрацію глюкози.

Оскільки вміст етанолу у винах є великим (до 20 % за об'ємом), очевидно, що аналіз вина за допомогою такого біосенсора супроводжуватиметься значною похибкою. Платиновий друкований електрод SensLab без ензимної мембрани дає дуже малі неспецифічні відгуки на етанол та гліцерол (15 нА та 12 нА на додавання 100 мМ етанолу і гліцеролу відповідно).

Тобто поява неспецифічного сигналу глюкозного біосенсора на етанол та гліцерол зумовлена реакцією останніх не з поверхнею голого електрода, а з електродом, модифікованим ПЕДТ, і цей метод іммобілізації ГОД є непридатним у разі створення біосенсора для аналізу глюкози у вині. Тому

з метою зниження неспецифічного сигналу глюкозного біосенсора нами було використано інший метод іммобілізації ГОД на поверхню платинового друкованого електрода SensLab, а саме -- іммобілізацію в парах глутарового альдегіду в БСА мембрані.

Мінімальна концентрація глюкози, що визначається, становить 0,04 мМ, як і у випадку електрохімічної полімеризації у ПЕДТ.

Лінійний діапазон цього біосенсора є значно вужчим 0,04-2,5 мМ, що повністю узгоджується з попередніми роботами, в яких показано, що обмеження за верхньою межею визначення глюкози (близько 2 мМ) пов'язано саме з браком у розчині кисню -- косубстрату ензиматичної реакції.

Аналіз селективності розробленого біосенсора показав, що іммобілізована у парах ГА ГОД зовсім не реагує на лактат та гліцерол, дає мінімальний негативний сигнал на аскорбінову кислоту та незначний відгук на етанол у концентраціях понад 10 мМ

Таким чином, створений на основі ГОД, іммобілізованої у парах ГА, амперометричний біосенсор демонструє кращу, порівняно з біосенсором на основі ГОД у ПЕДТ, селективність, і його відгук на глюкозу значно перевищує величину неспецифічних сигналів на основні компоненти вина.

З метою встановлення впливу на роботу створеного датчика інших компонентів вина (наприклад, фенольних сполук), нами було проведено такий дослід. До проби вина Кара-Даг було додано препарат ГОД у кількості 1 мг і проведено інкубацію з ензимом для розщеплення глюкози (згідно з даними ВЕРХ, концентрація глюкози у цьому вині становить 83 г/л). Потім було отримано відгуки біосенсора на внесення 10 мкл цієї суміші, відібраної через певні проміжки часу після змішування проби та ензиму. Показано, що вже через годину інкубації суміші величина відгуку біосенсора зменшилась у 2 рази, а через 24 год інкубації, коли глюкозу було повністю розщеплено ензимом, біосенсор не реагує на внесення проби вина в електрохімічну комірку.

Цей експеримент свідчить, що нами було розроблено дійсно високоспецифічний та селективний біосенсор для аналізу глюкози у вині.

Дослідження чутливості та селективності глюкозного амперометричного біосенсора на основі іммобілізованої у парах ГА ГОД уможливило проведення за його допомогою аналізу глюкози у реальних зразках. На першому етапі роботи з виноматеріалами визначали оптимальне розведення проб вина для аналізу їх за допомогою розробленого амперометричного біосенсора.

Враховуючи одержані результати, для подальшої роботи нами було обрано таке розведення проб: для сусла -- у 1 000 разів, для сухих вин -- у 250 разів, для всіх інших використаних вин -- у 500 разів. Варто зазначити, що максимально можливий вміст основних інтерферуючих речовин у суслі та вині, розведених у 500 разів, такий [40]: етанол -- до 7 мМ, гліцерол -- до 0,25 мМ, лактат -- до 0,1 мМ, аскорінова кислота -- до 0,005 мМ, а, як свідчать результати, наведені на рис. 5, біосенсор на основі ГОД, іммобілізованої в ГА, є зовсім не чутливим до цих речовин у наведених концентраціях.

Для визначення вмісту глюкози у винах за допомогою амперометричного біосенсора застосовували метод стандартних додавань.

Для цього спочатку отримували відгук біосенсора на внесення в електрохімічну комірку проби вина, що аналізується. Потім до ідентичних об'ємів вина додавали стандартні розчини глюкози з певними концентраціями та реєстрували сигнали датчика на внесення цих сумішей. Після здійснення серії послідовних аналізів (з використанням стандартних розчинів з різною концент рацією глюкози) отримували набір точок -- пряму лінію, яка після екстраполяції на вісь абсцис відсікала на ній значення концентрації глюкози у пробі аналізованого вина.

Це означає, що в цих винах та виноматеріалі концентрація глюкози така: 0,43 г/л (2,4 мМ) для аліготе, 7,56 г/л (42 мМ) для мадери, 31,6 г/л (176 мМ) для портвейну білого та 124,9 г/л (694 мМ) для сусла білого. Наступним етапом роботи було порівняння результатів аналізу глюкози у виноматеріалі, одержаних за допомогою біосенсора,із даними традиційного методу аналізу --високоефективної рідинної хроматографії.

Як об'єкт дослідження було використано 12 проб вина різного типу та 2 проби білого й червоного сусла. Слід відзначити високу кореляцію між результатами, одержаними із використанням амперометричного біосенсора та класичного хроматографічного методу визначення глюкози. Деяка розбіжність між даними ВЕРХ та біосенсора спостерігається лише в разі аналізу сухих вин, концентрація глюкози в яких є надто малою.

Урешті-решт, було досліджено відтворюваність відгуків та операційну стабільність створеного глюкозного біосенсора та показано, що через 8 год безперервної роботи біосенсор демонструє дещо більші, порівняно з початковими відгуками, сигнали на додавання розчину глюкози.

Зростання відгуку біосенсора протягом першої доби після іммобілізації ГОД у парах ГА можна пояснити тим, що молекули ензиму поступово набувають найбільш оптимальної для їх функціонування конформації у мембрані.

А з додаванням у комірку проби вина відгук зменшився на 13 % від початкового через 8 год безперервної роботи сенсора. Також було вивчено стабільність глюкозного амперометричного біосенсора під час зберігання його в сухому стані при + 4С.

Наведені на рис. 10 дані свідчать, що через 2 місяці після іммобілізації ГОД залишається близько 100 % від початкової активності ензиму, а потім величина відгуку починає поступово зменшуватися. Такий ефект можна пояснити тим, що зниження активності ГОД протягом перших двох місяців зберігання не призводить до зменшення величини відгуку біосенсора, оскільки ензим у чутливій мембрані перебуває в надлишку і на каталіз ензиматичної реакції вистачає навіть його зменшеної активності. Подальше ж падіння активності ГОД нижче того рівня, який забезпечував повне розщеплення субстрату, спричинює поступове падіння активності біосенсора.

Висновки

Алкогольними називають напої, до складу яких входить етиловий спирт . Алкогольні напої містять не менше 9 % етилового спирту, отримують їх шляхом повного або перерваного зброджування цукровмісної сировини або розбавлення спирту водою.

Алкогольне бродіння - складний біохімічний процес, який проходить під дією дріжджів. Сутність спиртового бродіння полягає в тому, що цукор під дією ферментного комплексу дріжджів перетворюється на спирт і вуглекислий газ.

Лікерно-горілчані вироби - це алкогольні напої, що представляють собою суміші різних спиртованих соків, морсів, настоїв і ароматних спиртів, які отримують переробкою плодово-ягідної рослинної сировини з додаванням цукрового сиропу, ефірних олій, лимонної кислоти та інших харчових добавок, а також спирту і води.

Для виробництва цих виробів використовують свіжі та сушені плоди і ягоди, сушені ароматні трави, квіти, бруньки рослин, кореневища, кору, цитрусові плоди, прянощі і інше.

Якість лікеро-горілчаних виробів визначають за органолептичними та фізико-хімічними показниками. Органолептично оцінюють зовнішній вигляд виробу (упакування, маркірування, обсяг, прозорість), колір, смак і запах.

Вино -- алкогольний напій, одержаний цілковитим повним або частковим зброджуванням соку із свіжого, підв'яленого винограду, що містить 8-20 % спирту.

Основні технології одержання вина. Червоне вино одержують з винограду зі шкіркою, біле вино -- із внутрішньої м'якоті винограду. Цукор перетворюється в спирт під впливом дріжджів Saccharomyces ellipsoideus, що живуть у шкірці винограду. Щоб одержати сухе вино, бродіння повинне продовжуватися довше, ніж для солодкого чи десертного. Шампанське (ігристе вино з області Шампань у Франції) розливають по пляшках, поки процес бродіння не закінчився, в інші ігристі вина штучно додають вуглекислоту. Деякі вина зміцнюють, додаючи спирт і консерванти. Останні можуть мати серйозні побічні ефекти. Тому останнім часом стають усе більш популярні вина без консервантів.

Пиво -- алкогольний напій середньої міцності, який виготовляють ферментацією ячмінного, кукурудзяного або рисового солоду. Пиво характеризується специфічною гіркотою та ароматом, що надає йому хміль, а також здатністю до піноутворення. Процес виробництва пива називається броварством, інколи пивоварінням.

Складові, що входять до пива. Пиво зазвичай виготовляється з води, ячмінного солоду, хмелю, пивних дріжджів. Іноді додатково застосовуються несолоджені матеріали (непророщене рисове, ячмінне, кукурудзяне борошно та крупи, а також інша сировина, яка містить вуглеводи) та інші допоміжні інгредієнти.

Через те, що пиво в основному складається з води, вода і її характеристики мають важливий вплив на якість пива.

Серед різних типів солоду, ячмінний солод є найпоширенішим завдяки високим ферментаційним якостям

Хміль додає напою смаку гіркоти, що збалансовує смак солоду і має антибіотичний ефект, що знешкоджує небажані мікроорганізми.

Виробництво пива -- складний і тривалий процес, що складається з кількох нетехнологічних циклів: виробництва солоду, отримання пивного сусла, зброджування сусла пивними дріжджами, доброджування, фільтрація пива і розлив.

По даній роботі був зроблений літературний огляд з проблем виробництва міцних спиртних напоїв. Вивчено технічні схеми виробництва, особливості хімічного складу, питання оцінки якості та фальсифікації напоїв. Була дана характеристика всіх сортів пива та виноградного вина. Так само, аналізуючи дані наукових праць, було досліджено селективність амперометричних біосенсорів, розроблених із застосуванням двох різних методів іммобілізації глюкозооксидази. Показано, що датчик на основі ГОД, іммобілізованої у парах глутарового альдегіду, є селективним і не демонструє неспецифічного відгуку на основні компоненти вина, на відміну від біосенсора з ГОД, іммобілізованою у полімері ПЕДТ.

Вивчено відтворюваність відгуків та операційну стабільність створеного датчика на основі іммобілізованої у парах глутарового альдегіду ГОД та досліджено його стабільність під час зберігання. За допомогою розробленого біосенсора проведено аналіз концентрації глюкози у винах різного типу та в суслі. Показано високу кореляцію результатів, отриманих за допомогою глюкозного амперометричного біосенсора, із даними традиційного методу аналізу глюкози -- високоефективної рідинної хроматографії.

Крім того, у ході роботи встановлено, що біосенсор з іммобілізованою у полімері ПЕДТ ГОД виявляє надзвичайно широкий динамічний діапазон роботи (до 50 мМ глюкози) і може бути успішно застосований для аналізу крові.

спиртний біосенсор глюкозооксидаза виноматеріал

Список використаної літератури

1. ГОСТ 7208)93. Вина виноградные и виноматериалы виноградные обработанные. Общие технические условия: Сб. ГОСТов. -- М.:ИПК Изд-во стандартов, 2003.

2. Разуваев В.С. Винный корень // Виноград. Вино. -- 2001. -- № 6; 2002. -- № 1, 2, 4.

3. Мгалоблишвили К.И. Грузинские виноградные вина // Химия и жизнь. -- 1969. -- №1. --С. 52-63.

4. Эмерин М.А. Я бы назвал это химической симфонией // Химия и жизнь. -- 1965. --№2. -- С. 60-65.

5. Родопуло А.К. Основы биохимии виноделия. -- М.: Легкая и пищевая промышленность, 1983. -- 240 с.

6. Шольц Е.П., Пономарев В.Ф. Технология переработки винограда. -- М.: Агропромиздат, 1990. -- 447с.

7. Гугучкин А.А., Агеева Н.М., Гугучкина Т.И. Качественная характеристика вин из нових перспективных сортов винограда // Виноделие и виноградарство. -- 2001. -- № 3. --С. 12-15.

8. Нужный В.П. Токсикологическая характеристика этилового спирта, алкогольных напитков и содержащихся в них примесей //Вопр. наркологии. -- 1995. -- № 3. -- С. 65-74.

9. Родопуло А.К. Биохимия виноделия. -- М.: Пищевая промышленность, 1971. -- 428с.

Размещено на Allbest.ru