Антигіпертензивні властивості пептидів, які утворюються у процесі протеолізу казеїну ферментами молочнокислих бактерій

Размещено на http://www.allbest.ru/

Львівський національний університет імені Івана Франка

УДК 577.112.6 /.152.34 + 576.852.24

Антигіпертензивні властивості пептидів, які утворюються у процесі протеолізу казеїну ферментами молочнокислих бактерій

03.00.13 - Фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Луговий Богдан Любомирович

Львів 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у Львівському національному університеті імені Івана Франка Міністерства освіти і науки України та у Тернопільському державному технічному університеті імені Івана Пулюя Міністерства освіти і науки України

Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, м.Київ

Захист відбудеться “30” березня 2001 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К35.051.14 Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою: 79005, м.Львів, вул.Грушевського, 4, біологічний факультет Львівського національного університету ім.І.Франка, аудиторія № 333.

З дисертацією можна ознайомитись у науковій бібліотеці Львівського національного університету ім.І.Франка за адресою: 79005, м.Львів, вул Драгоманова, 17

Автореферат розісланий “24” лютого 2001 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук Санагурський Д.І.

кисломолочний молоко казеїн

Анотації

ЛуговиЙ Б.Л. Антигіпертензивні властивості пептидів, які утворюються у процесі протеолізу казеїну ферментами молочнокислих бактерій. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13. - фізіологія людини і тварин. - Львівськийнаціональний університет імені Івана Франка, Львів, 2000.

Встановлено, що олігопептиди, утворені при протеолізі казеїну коров'ячого молока бактеріями Lactococcus lactis subsp. lactis володіють антигіпертензивними і кардіопротекторними властивостями, а за механізмом дії вони відносяться до інгібіторів ангіотензин-перетворюючого ферменту (АПФ). Для процесу протеолізу розроблено систему для виділення гомогенного препарату казеїну та систему для нарощування біомаси бактерій. Створено модельну систему для протеолізу казеїну біомасою лактококів та у поєднанні бактерій з молочно-коагулянтними ферментами. казеїнові пептиди пригнічували активність АПФ. Для вивчення впливу олігопептидів in vivo, у білих щурів було змодельовано артеріальну гіпертензію. Встановлено, що пептидні препарати після хронічного введення гіпертензивним тваринам суттєво знижують показники артеріального тиску, покращують показники центральної гемодинаміки та електричної активності серця, зменшують ступінь гіпертрофії частин серця та нормалізують їх просторові характеристики.

Ключові слова: артеріальна гіпертензія, інгібітори АПФ, пептиди, казеїн, протеоліз, лактококи.

Luhovyy B.L. The antihypertensive properties of peptides are generating after proteolysis of casein by lactic acid bacteria. - Manuscript.

This thesis is subjected for the granting of a degree for a candidate of biological sciences with specialty 03.00.13 - human and animal physiology. - The Lviv National University, Lviv, 2000.

It have been developed the antihypertensive and cardioprotective values of the peptides that were generated after proteolysis of casein from cow milk by lactococci. It was elaborated the method of differential fractionation by urea and over-purification by ion-exchange chromatography for obtain the homogeneous casein. The systems for the harvesting of bacterial cells and for the proteolysis of casein by lactococci and milk-clotting enzymes were developed. The arterial renovascular hypertension was created on the rats for the studying of casopeptides influence on hemodynamic, electrocardiography and morphologic rates of cardiovascular system. Oligopeptides derived after proteolysis of casein by strain l12 of Lactococcus lactis subsp. lactis decreases the arterial blood pressure and reduce of cardiac hypertrophy after chronic administration into hypertensive rats. These peptides have shown the effect asinhibitors of angiotensin-converting enzyme (ACE).

Key words: arterial hypertension, ACE inhibitors, peptides, casein, proteolysis, and lactococci.

Луговый Б.Л. Антигипертензивные свойства пептидов, образуемых в процессе протеолиза казеина ферментами молочнокислых бактерий. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. - Львовский национальный университет имени Ивана Франко, Львов, 2000.

Диссертация изучает актуальный вопрос современной физиологии - поиск антигипертензивных средств естественного происхождения. В диссертационной работе изучаются антигипертензивные свойства низкомолекулярных пептидов, образованных в процессе модельного протеолиза казеина коровьего молока молочнокислыми бактериями Lactococcus lactis subsp. lactis. Для процесса протеолиза разработана система для препаративного выделения гомогенного препарата казеина с помощью комбинации дифференцированного фракционирования мочевиной и хроматографии на колонке с ДЭАЭ - целлюлозой. Изучено протеолитическую активность у 27 штаммов молочнокислых бактерий рода Lactococcus, их физиологические характеристики. В частности, определялась кислотообразующая активность, фагорезистентность, стойкость к разным концентрациям хлорида натрия и антибиотиков (тетрациклина, пенициллина и стрептомицина), что позволило отобрать штамм l12 подвида Lactococcus lactis subsp. lactis как наиболее сильный по протеолитической активности и физиологические свойства которого позволяют использовать его в составе заквасок для производства сыров и кисломолочных продуктов. С целью воспроизведения процесса протеолиза, который имеет место при производстве твёрдых сычужных сыров, разработано модельную систему для протеолиза казеина биомассой лактококков и при совместном воздействии на казеин лактококков и молокосвёртывающих ферментов - пепсина и фромазы. Протеолиз 1% казеина в ацетатном буфере с рН 5,5 проводили добавлением 7% (v/v) биомассы лактококков при их концентрации 1010 клеток/мл в течении 54 час при температуре 30?С. Через 3 часа с начала инкубации в среду добавляли лизоцим для выхода интрацеллюлярныхпротеиназ лактококков в реакционную среду. Затем, через 2 часа реакционную среду асептически разделяли на три образца, равные за объемом. К одному из них добавляли 0,02% (w/v) пепсина, к другому 0,02% (w/v) фромазы, в третьем образце продолжался бактериальный протеолиз казеинов. Для осаждения клеточных фракций лактококков образцы центрифугировали, супернатант замораживали и лиофильно сушили. Для получения низкомолекулярных пептидных фракций продуктов протеолиза казеина лиофилизированный препарат разделяли гель-фильтрацией на колонке с сефадексом G-25. Полученные олигопептидные фракции замораживали и лиофилизировали. Результаты показывают, что наиболее интенсивно протеолиз казеина совершается при синергическом действии лактококков и пепсина. Тестирование олигопептидов, полученных после протеолиза казеина лактококками без коагулянтов, при концентрации 0,01% (w/v) показало ингибиторное влияние пептидов на активность ангиотензин-превращающего фермента. Для подтверждения физиологической активности пептидов in vivo на крысах-самцах было смоделировано состояние артериальной почечной гипертензии. После того как у крыс развивалась стойкая гипертензия животных разделили на три группы - нормотензивные, гипертензивные без коррекции состояния, гипертензивные с коррекцией казеиновыми олигопептидами, которые хронически в течении двух недель вводились животным внутрижелудочно. Результаты исследований показали, что артериальное давление в хвостовой артерии у крыс, которые получали казеиновые пептиды снижается почти чем на 22.5% по сравнению с гипертензивными крысами, состояние которых не корригировалось и соответствующий показатель которых превышал таковой у нормотензивных животных на 45,0 %. Установлено, что казеиновые низкомолекулярные пептиды уменьшают степень гипертрофии частей сердца и корригируют их пространственные характеристики после хронического назначения гипертензивным крысам. Кроме того, казеиновые пептиды оказывают положительное влияние на электрическую активность сердца, о чем свидетельствует изучение и сравнение электрокардиограмм. О кардиопротекторном эффекте казеиновых пептидов свидетельствует изменение показателей центральной гемодинамики, в частности уменьшение общего периферического сопротивления сосудов по сравнению с соответственным показателем крыс, у которых коррекциягипертонического состояния не проводилась. Всё вышеизложенное разрешает рассматривать низкомолекулярные пептиды, образованные в процессе протеолиза казеина протеолитическими системами молочнокислых бактерий Lactococcus lactis subsp. lactis как антигипертензивные и кардиопротекторные средства, которые за механизмом своего действия относятся к ингибиторам АПФ.

Ключевые слова: артериальная гипертензия, ингибиторы АПФ, пептиды, казеин, протеолиз, лактококки.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Серцево-судинні захворювання, за даними ВООЗ, є найбільш розповсюджені серед населення і найчастіше призводять до інвалідності та смерті переважно людей працездатного віку. Слід підкреслити, що найвищий рівень смертності від цих захворювань серед країн Європи є в Україні [Жарінов, 1998; Sans et al., 1997 ]. Велике значення для профілактики та лікування цих патологій мають інгібітори ангіотензин-перетворюючого ферменту (АПФ) [Francis, 2000]. Особливо актуальним є пошук речовин природного походження - інгібіторів АПФ, які при хронічному споживанні здатні корегувати патологічні процеси та запобігати розвитку серцево-судинних захворювань. Саме до таких засобів відносяться антигіпертензивні пептиди, які утворюються з казеїну у процесі протеолізу ферментами молочнокислих бактерій.

Традиційно білки казеїнового комплексу молока розглядають як джерело легкозасвоюваних амінокислот в харчуванні людини і тварин. Результати сучасних досліджень дозволяють вважати казеїнові білки попередниками низькомолекулярних біологічно-активних пептидних регуляторів, які здатні впливати на роботу різних фізіологічних систем організму ссавців [Meisel, Bockelmann, 1999; Yamamoto, Takano, 1999; Shimizu, 1999]. Казеїнові фізіологічно-активні пептиди утворюються in vivo в процесі травлення протеазами шлунково-кишкового тракту. Ці пептиди володіють певними фізіологічними властивостями, зокрема антигіпертензивним ефектом, за що їх було названо “казокініни” [Maruyama, 1987; Kohmura, 1989; Meisel, 1993], опіоїдною активністю - “казоморфіни” [Brantl,1979; Chang, 1981; Yoshikawa et al., 1986], мінерал-зв'язуючими властивостями - “казофосфопептиди” [Hirayama et al., 1992; Hansen et al., 1997], імуномодуляторними - “казоімунопептиди” [Migliore-Samour et al., 1989; Kayser et al., 1996; Hata et al., 1998], антитромботичними - “казоплателіни” [Jollиs et al., 1986; Fiat et al., 1993; Bouhallab et al., 1995], бактерицидними - “казоцидини” [Zucht et al., 1995; Lahov et al., 1996], та іншими ефектами [Стан, Черников, 1982; Asano et al., 1991; Macdonald et al., 1994]. Вивчення протеолітичних систем молочнокислих бактерій дало можливість протестувати протеїнази молочнокислих паличок Lactobacillus helveticus на їх здатність in vitro розщеплювати казеїнові білки до казокінінів [Yamamoto et al., 1994; Maeno et al., 1996 ] Було виділено казеїнові пептиди - інгібітори АПФ з японського кисломолочного напою Calpis?, при приготуванні якого використовується симбіотична закваска Lactobacillus helveticus і Saccharomyces cerevisiae, при цьому антигіпертензивна дія цього напою встановлена після його перорального введення гіпертензивним щурам [Nakamura et al., 1995]. Показано, що казокініни є стійкими до травлення та ефективно всмоктуються у кишечнику [Nakamura et al, 1996; Masuda et al., 1996; Hata et al., 1996]. Проте відсутні дані про казокініни, утворені при протеолізі казеїнів лактококами. Було припущено, що фізіологічно-активні пептиди можуть утворюватися при протеолізі білків казеїнового комплексу під дією ферментних систем лактококів і молочно-коагулянтних препаратів, тобто у кисломолочних продуктах ще до моменту їх попадання у шлунково-кишковий тракт [Юкало і співавт, 1991]. Крім цього, недостатньо вивчено вплив казокінінів на функціональні та морфологічні зміни у серцево-судинній системі організму з гіпертензивним статусом, ускладненим гіпертрофією серця.

Тема дисертаційного дослідження присвячена вивченню антигіпертензивних властивостей фізіологічно-активних пептидів з казеїну, які утворюються під дією протеаз лактококів, що використовуються в Україні та у країнах СНД. В роботі встановленно, що ці пептиди за механізмом дії відносяться до інгібіторів ангіотензин-перетворюючого ферменту.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертація виконана у відповідності з науковими планами Тернопільського державного технічного університету імені Івана Пулюя і є частиною науково-дослідної роботи кафедри харчової біотехнології і хімії названого вузу, де працює дисертант та є частиною науково-дослідної роботи кафедри фізіології людини і тварин Львівського національного університету імені Івана Франка, у якій дисертант навчався в аспірантурі (без відриву від виробництва) протягом 1996 - 2000 років. Дослідження, відображені у розділі 3 “Виділення гомогенного препарату казеїну” і у розділі 4 “Протеоліз казеїну молочнокислими бактеріями” є частинами державних науково-дослідних робіт “Дослідження процесів одержання білкових фракцій молока методами безмембранного осмосу та електроосмосу” (Державний реєстраційний номер: 0199U003999) та “Дослідження та оптимізація біохімічних та фізико-хімічних процесів в молочно-білкових системах” (Державний реєстраційний номер: 0196U012986), у виконанні яких брав участь дисертант як молодший науковий співробітник.

Мета та задачі дослідження: Виділення фізіологічно-активних продуктів протеолізу -казеїну та вивчення впливу виділених пептидів на показники серцево-судинної системи білих щурів з експериментальною артеріальною гіпертензією.

Для досягнення поставленої мети були сформульовані такі задачі:

1. Виділити гомогенний препарат казеїну з коров'ячого молока.

2. Відібрати штам лактококів з високою протеолітичною активністю та з такими фізіологічними показниками, які б дозволили застосовувати цей штам для виробництва кисломолочних продуктів та сирів.

3. Провести модельний протеоліз казеїну біомасою клітин лактококів та у поєднанні лактококів з молочно-коагулянтними ферментами.

4. Отримати низькомолекулярні пептидні фракції казеїну та перевірити їх вплив на активність ангіотензин-перетворюючого ферменту.

5. Змоделювати на білих щурах артеріальну реноваскулярну гіпертензію.

6. Перевірити дію низькомолекулярних казеїнових пептидних препаратів при хронічному введенні на функціональні показники роботи серцево-судинної системи гіпертензивних щурів.

7. Вивчити морфологічні зміни серця після моделювання у них стану артеріальної гіпертензії та після корекції пептидними препаратами з казеїну.

Об'єкт дослідження:

Фізіологічно-активні продукти протеолізу білків казеїнового комплексу.

Предмет дослідження:

Антигіпертензивні властивості пептидів, утворених у процесі протеолізу казеїну коров'ячого молока ферментами молочнокислих бактерій Lactococcus lactis.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено фізіологічну активність пептидних препаратів, отриманих в процесі протеолізу казеїну молочнокислими бактеріями підвиду Lactococcus lactis subsp. lactis та у пептидних препаратах, отриманих при модельному протеолізі казеїну лактококами та молочно-коагулянтними ферментами. Вивчено антигіпертензивні властивості та встановлено корегуючий ефект казеїнових олігопептидів при їх хронічному введенні на показники серцево-судинної діяльності у гіпертензивних тварин. На основі аналізу отриманих результатів показано позитивні зміни функціональних та морфологічних показників серця білих щурів після корекції артеріальної гіпертензії низькомолекулярними пептидними препаратами з казеїну.

Практичне значення одержаних результатів: Результати дисертаційного дослідження дозволяють комплексно оцінювати антигіпертензивні властивості продуктів протеолізу білків казеїнового комплексу, - зокрема їх вплив на активність АПФ in vitro та на морфофункціональні показники роботи серцево-судинної системи гіпертензивних щурів in vivo. Запропонований метод виділення гомогенного препарату казеїну може бути використаний для отримання препаративних (великих) кількостей цього білку, а система електрофорезу у пластинках в поліакриламідному гелі для оцінки протеолітичної активності та спорідненості протеїназ до білків казеїнового комплексу. Пропонується система модельного протеолізу для препаративного одержання пептидних фракцій, різних за молекулярною масою. Ця система дозволяє тестувати молочнокислі бактерії та ферментні препарати на можливість утворення фізіологічно-активних пептидів при протеолізі казеїнів. Отримані низькомолекулярні пептидні фракції казеїну можуть бути використані у складі препаратів для парентерального живлення у хворих-гіпертоніків після операцій.

Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача полягає у постановці та проведені експериментів, узагальненні та аналізі одержаних даних. Науковим керівником В.Г.Юкалом сформульовано мету та завдання дослідження і разом із здобувачем проведено розробку основних теоретичних та практичних положень роботи. Науковим керівником І.В.Шостаковською сплановано фізіологічні експерименти та підібрано відповідні методики для їх проведення. Здобувачем проведено аналіз досліджуваного матеріалу, статистична обробка отриманих даних, сформульовані висновки та практичні рекомендації, підготовлені матеріали до опублікування.

Апробація результатів дисертації. Результати дослідження апробувалися на III і IV-му міжнародних медичних конгресах молодих науковців і студентів (Тернопіль, 1999, 2000), на міжнародній науково-технічній конференції (Київ, УДУХТ, 1997), на міжнародній конференції, присвяченій 100-річчю А.М.Несмеянова (Москва, 1999), на міжнародній конференції “Химия и биотехнология пищевых веществ” присвячена пам'яті М.Н.Манакова (Москва, 2000), на науковій конференції біологічного факультету Львівського національного університету ім.І.Франка (Львів, 2000), на наукових конференціях Тернопільського державного технічного університету ім. І.Пулюя (Тернопіль, 1998, 2000).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 5 наукових статей у фахових виданнях з біологічних наук, результати дисертаційної роботи, апробовані на конференціях і конгресах опубліковані у 5-ти тезах доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, розділу “матеріали та методи досліджень”, трьох розділів власних досліджень, обговорення результатів дослідження, висновків, практичних рекомендацій, списку використаної літератури та додатків. Дисертація написана на 152 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 33 рисунками, 9 таблицями, містить 8 додатків. Список літератури включає 406 джерел.

2. Основний зміст роботи

Матеріали і методи досліджень

В експериментах використано 53 білих щурів-самців однакового віку та маси, які були розділені на три групи. Перша група включала 16 інтактних практично здорових тварин, які знаходились у звичайних умовах віварію, друга - 18 щурів з експериментальною гіпертензією, третя - 19 тварин з гіпертензією, яку корегували щоденним внутрішньо-шлунковим введенням олігопептидних препаратів в дозі 10 мг/кг на протязі 2-х тижнів. Введення пептидних препаратів розпочинали через 2 тижні після операції. Протягом цього часу у тварин розвивалася стійка артеріальна гіпертензія. Всі оперативні втручання у тварин здійснювалися із дотриманням правил асептики і антисептики в умовах тіопенталового наркозу.

Артеріальну гіпертензію моделювали шляхом звуження ниркової артерії над місцем її відходження від черевної аорти і додатковим введенням субкапсулярно в передню поверхню нирок 0,05 мл концентрованої оцтової кислоти, що пролонгує процес артеріальної гіпертензії [Гнатюк і співавт., 1991].

При вивченні функціонального стану серцево-судинної системи у досліджуваних груп тварин артеріальний тиск вимірювався неінвазивно, за допомогою плетизмометричного апарату, проводився запис електрокардіограм (ЕКГ-апарат ЕК 2Т-02), вивчалися показники центральної гемодинаміки методом реографії за допомогою реографа РПГ2-02. Розрахунок ударного об'єму (УО) проводили за спеціальними формулами [Пушкарь и соавт., 1977; Kubicek et al., 1970; Карпицкий и соавт., 1986]. При цьому визначали ударний індекс (УІ), хвилинний об'єм крові - (ХОК), загальний периферичний опір (ЗПО).

При морфологічному дослідженні серця використовували окреме зважування його частин, ендокардіальні поверхні вивчализа допомогою планіметрії, проводили гістостереометрію, яку здійснювали на ізольованих кардіоміоцитах частин серця.

Антигіпертензивний ефект in vitro пептидних препаратів визначали за їх впливом на активність ангіотензин-перетворюючого ферменту (АПФ) за методом [Cushman, Cheung, 1971] у модифікації [Nakamura і співавт., 1995]. Для реакції використовували АПФ (ЕС 3.4.15.1. Sigma, США) та синтетичний субстрат гіпурил-L-гістидил-L-лейцин (Sigma, США).

Застосування біотехнологічних та аналітичних методів досліджень дозволило виділити препарати загального казеїну та казеїну із знежиреного молока, відібрати протеолітично-активні штами бактерій та провести модельний протеоліз казеїну, внаслідок чого було отримано низькомолекулярні фракції пептидів.

При цьому використовували диск-електрофорез у трубочках поліакриламідного гелю (ПААГ) за методом [Davies, Law, 1987] та електрофорез у пластинках ПААГ, який проводили у апараті Стадієра (реактиви “Reanal”, Угорщина).

Іонообмінну хроматографію на колонках і фракціювання казеїнів в об'ємі проводили з використанням ДЕАЕ-целюлози (ДЕАЕ-52, “Serva”, ФРН) і колонки (“Reanal”, 2 30 см). Гель-фільтрацію продуктів протеолізу проводили на сефадексі G-25 (Fine, Pharmacia, Швеція) за допомогою хроматографічної системи для рідинної хроматографії (“Reanal”, Угорщина).

Концентрацію білків у препаратах казеїнів і сироватки молока та хроматографічних пробах визначали по методу Лоурі [Lowry et al., 1951] або спектрофотометрично при 280 нм на спектрофотометрі СФ-46.

Для тривалого збереження властивостей та нативності білкових та пептидних препаратів їх ліофільно висушували за допомогою апарату сублімаційного висушування ТG-5 (Німеччина) з корисною площею 1,63 м2 та вологісттю вихідного продукту не більше 1%.

Всі кількісні показники піддавались статистичній обробці на персональному комп'ютері. Достовірність різниці порівнювальних показників встановлювали за допомогою критерія Стьюдента.

3. Результати досліджень та їх обговорення

Виділення гомогенного препарату казеїну. Підібрано умови для отримання препарату загального казеїну із знежиреного коров'ячого молока і з отриманого препарату загального казеїну було відділено казеїнову фракцію, за допомогою методики, яка максимально забезпечила гомогенність цієї фракції та дозволяє отримати CN у препаративній кількості. Кислотне осадження загального казеїну дозволяє отримати препарат, у якому відсутні домішки білків сироватки молока (рис.1,1) і який може бути використаний для препаративного виділення гомогенного препарату казеїну. Батч-процедура з ДЕАЕ-целюлозою дозволяє швидко отримати препарат казеїну з домішками s- i казеїнів. Комбінація диференційного фракціювання сечовиною і хроматографії на колонці з ДЕАЕ-целюлозою забезпечила виділення електрофоретично-чистого препарату казеїну (рис.1,2), з максимальним збереженням його нативної структури, що дозволяє використовувати його як субстрат протеолізу ферментами молочнокислих бактерій при виділенні фізіологічно-активних пептидів.

Протеоліз казеїну молочнокислими бактеріями Lactococcus lactis. Відібрано штами з високою протеолітичною активністю та охарактеризовано їх фізіологічні властивості , зокрема, стійкість до різних концентрацій хлориду натрію, присутності антибіотиків, кислотоутворююча активність та фагорезистентність, оскільки такі характеристики штамів необхідно враховувати при їх подальшому використанні у харчових технологіях. Підібрано систему для нарощування біомаси лактококів та отримання їх інтактних клітин, відмитих від білків поживного середовища. Визначено динаміку протеолізу казеїну залежно від часу інкубації казеїну з клітинами лактококів. Розроблено систему для препаративного отримання продуктів протеолізу казеїну лактококами і виділено з отриманого препарату низькомолекулярні пептидні фракції. Дослідження протеолітичної активності та фізіологічних властивостей 27 штамів лактококів дозволили відібрати штам l12 підвиду Lactococcus lactis subsp. lactis. Для нарощування біомаси лактококів було використано знежирене молоко, в яке додавали гліцерофосфат натрію (0,073М). При цьому вдалося досягнути концентрації біомаси лактококів 1010 клітин/мл без суттєвого закислення середовища і уникнути коагуляції казеїнів. Біомасу лактококів, відмиту від компонентів поживного сердовища (в т.ч. і казеїнів) використовували для протеолізу казеїну. Розроблена система (рис.2) для препаративного виділення пептидів з казеїну враховує особливості протеолітичної системи лактококів підвиду L.lactis subsp. lactis - протеолітичний процес проходить як за участю приклітинних протеїназ так і ферментів, які мають внутрішньоклітинну локалізацію. Крім цього, для інтенсифікації протеолітичних процесів було застосовано молочно-коагулянтні препарати - фромазу та пепсин. Запропонована схема відтворює умови (рН, температура), які мають місце при виробництві твердих сичужних сирів. Коагульований казеїн, нерозчинні продукти протеолізу і клітини мікроорганізмів осаджували центрифугуванням і супернатант ліофільно висушували. Отримані ліофілізовані препарати, крім пептидів казеїну, містять розчинені ферменти, білки мікроорганізмів та інші високомолекулярні продукти. Для виділення фракцій низькомолекулярних пептидів, ліофілізовані препарати розчиняли в 0,01 М фосфатному буфері (рН 7,2) і наносили на колонку з сефадексом G-25. Перші піки на хроматограмах включають нерозщеплений казеїн, білки ферментних препаратів і лактококів, які виходять з вільним об'ємом колонки. Піки 2а і 2б містять проміжні продукти розщеплення казеїну з молекулярними масами від 1000 до 5000 Да. Олігопептиди з молекулярною масою до 1000 Да виходять об'ємом, близьким до повного об'єму колонки у складі третього піку. При електрофоретичному аналізі ці пептиди не фіксуються у ПААГ. Для визначення фізіологічної активності було використано пептидні препарати хроматографічної фракції 3.

Фізіологічна активність пептидних препаратів, отриманих при протеолізі казеїну лактококами. Дослідження дії олігопептидних препаратів з казеїну на активність ангіотензин-перетворюючого ферменту показало, що олігопептидні препарати, отримані в процесі модельного протеолізу казеїну володіють антигіпертензивною активністю in vitro, гальмуючи активність АПФ.

Найвищий інгібіторний ефект був досягнутий при використанні олігопептидного препарату, одержаного при комбінованій дії протеазних систем біомаси штаму l12 L. lactis subsp. lactis та пепсину, який входить до складу багатьох молочно-коагулянтних препаратів. При цьому рН середовища, у якому відбувався протеоліз відповідало діапазону активності пепсину і складало 5,5, тоді коли відомо, що втрата активності свинячого пепсину спостерігається при рН 6,6. Інший молочно-коагулянтний препарат - фромаза, при синергічній дії з біомасою лактококів на казеїн, дозволив отримати низькомолекулярний препарат пептидів, дія яких має інгібіторний ефект на активність АПФ. Фромаза є мікробним препаратом, продуцентом якого є Rhizmucor miehei і на сьогодні використовується у молочній промисловості багатьох країн, а також України, зокрема фромаза типу TL, яка була використана для модельного протеолізу, призначена для всіх видів сирів. Застосування протеолітичних препаратів у поєднанні з біомасою лактококів стимулювало високу продукцію антигіпертензивних пептидів. Результати наведені у табл. 1.

Інгібіторний ефект на активність АПФ не був виявлений у пептидних препаратах, отриманих без участі біомаси лактококів при протеолізі казеїну пепсином і фромазою, відповідно. Цей факт вказує на те, що інгібітори АПФ утворюються у протеолітичній системі, де є присутні молочнокислі бактерії, і зокрема бактерії підвиду L.lactis subsp. lactis. Використання для протеолізу казеїну лише біомаси штаму l12 L.lactis subsp. lactis дозволило отримати низькомолекулярний пептидний препарат, який вже при концентрації 0,01% (w/v) пригнічував активність ангіотензин-перетворюючого ферменту більш ніж наполовину.

Відомо, що ангіотензин-перетворюючий фермент є важливим компонентом ренін-ангіотензинової системи організму, порушення діяльності якої призводить до розвитку артеріальної гіпертензії. Тому для верифікації фізіологічної активності олігопептидних препаратів, отриманих при модельному протеолізі казеїну ферментами молочнокислих бактерій L.lactis subsp. lactis та молочно-коагулянтними протеазами необхідно було вивчити їх вплив in situ.

З цією метою, на білих щурах було змодельовано стан експериментальної артеріальної гіпертензії по реноваскулярному типу. Гіпертензією корегували щоденним внутрішньо-шлунковим введенням олігопептидних препаратів в дозі 10 мг/кг на протязі 2-х тижнів. Введення пептидних препаратів розпочинали через 2 тижні після операції. Протягом цього часу у тварин розвивалася стійка артеріальна гіпертензія. Евтаназію білих щурів здійснювали швидкою декапітацією через місяць від початку експерименту.

Отримані результати показали, що артеріальний тиск у хвостовій артерії інтактних білих щурів становив (98,1 - 2,1) мм рт. ст., а при змодельованій артеріальній гіпертензії (142,0 - 2,7) мм рт. ст. Наведені величини між собою статистично достовірно відрізнялися (р ? 0,01) і останній цифровий показник перевищував попередній на 45,0 %. При корекції артеріальної гіпертензії казеїновими пептидами величина артеріального тиску знижувалася до (116,2 - 2,4) мм рт. ст., тобто майже на 22,5 %.

Слід зауважити, що змодельована артеріальна гіпертензія супроводжувалася гіперфункцією та гіпертрофією частин серця (табл.2). При цьому спостерігалося збільшення маси всіх відділів серцевого м'яза з переважаючим зростанням маси лівого шлуночка. Останнє підтверджувалося динамікою змін шлуночкового індексу (відношення маси правого шлуночка до лівого та відсотком мас шлуночків). Так, при змодельованій артеріальній гіпертензії шлуночковий індекс знижувався з (0,462 - 0,003) до (0,354 - 0,002, р 0,01), а відсоток маси лівого шлуночка зростав з (61,6 - 0,9) до (68,1 - 1,4) %, тобто майже на 6,5 %. Виявлене зниження артеріального тиску у тварин з корегованою гіпертензією супроводжувалося суттєвим покращенням структури міокарда. Так, при некоригованій артеріальній гіпертензії маса серця зростала з (1040,1 - 15.0) до (1646,0 - 37,2) мг, тобто майже на 57,7 %, то при корекції даного стану - лише на 25,5 % (табл.2). У групі тварин з корегованою гіпертензією зменшувалась також маса лівого шлуночка. Вказаний масометричний параметр зменшувався з (1121,6 - 15,0) до (841,9 - 12,6) мг, тобто майже на 24,9 %. Аналогічна тенденція спостерігалась при аналізі масометричних показників правого шлуночка, лівого та правого передсердь. При цьому також покращувався шлуночковий індекс. Останній підвищувався з (0,353 - 0,002) до (0,410 - 0,003). Слід зауважити, що даний показник ще суттєво відрізнявся від контрольного, але його зростання свідчило про покращення масометричного співвідношення між лівим та правим шлуночками серця. Просторові характеристики частин серця у спостереженнях тварин групи з корегованою гіпертонією істотно покращувалися. При цьому вони суттєво не відрізнялися від контрольних величин (табл.2).

Після корекції артеріальної гіпертензії казеїновими олігопептидами нормалізувалися також співвідношення між просторовими характеристиками камер серця, про що свідчили зміни планіметричного індексу (відношення між площами стінок лівого таправого шлуночків) та планіметричного індексу передсердь (відношення між площами лівого та правого передсердь). Аналіз діаметрів кардіоміоцитів частин серця показав, що вони у групі щурів з корегованою гіпертензією ще суттєво відрізнялися від контрольних величин, але в значній мірі були зниженими в порівнянні із аналогічними показниками у тварин, у яких гіпертензія не корегувалась (табл.2). Це вказує на те, що гіпертрофія серця у корегованій групі тварин ще зберігалася, але ступінь її був значно нижчим у порівнянні із щурами, де гіпертензія не корегувалася досліджуваними пептидами.

Після моделювання у тварин експериментальної гіпертензії, електрокардіографічне дослідження виявило погіршення функціонального стану серцево-судинної системи. Це проявлялося у зниженні зубців електрокардіограми, зглаженністю та інверсією зубця Т, депресією сегменту S - T, погіршенням провідності та порушеннями ритму. Частота серцевих скорочень у групі тварин з некорегованою гіпертензією зростала (510,7-8,6), а у групі тварин після корекції гіпертензії дещо знижувалася (478,5-10,5, р?0,001), порівняно з некорегованими гіпертоніками, і наближалася до такої у інтактних тварин (440,73-11,62). Зниження ударного об'єму, ударного і серцевого індексів, хвилинного об'єму крові, зростання загального периферичного опору свідчили (табл.3) про суттєве погіршення роботи гіпертрофованого серцевого м'язу тварин з експериментальною артеріальною гіпертензією.

При артеріальній гіпертензії у тварин відмічалися наступні морфологічні зміни. Найбільший ступінь гіпертрофії кардіоміоцитів виявлений у лівому шлуночку і лівому передсерді. Встановлені суттєві порушення ядерно-цитоплазматичних співвідношень у лівому шлуночку вказували на тяжкість функціонально-структурного стану. Загальна кількість кардіоміоцитів у частинах серця змінювалась мало, недивлячись на значне зростання їх маси. З цього можна зробити висновок, що головна роль у гіпертрофії відділів серця щурів з експериментальною гіпертензією відводиться росту товщини і довжини кардіоміоцитів. Мікроскопічно у частинах серця відмічається нерівномірна гіпертрофія кардіоміоцитів. Деякі кардіоміоцити знаходяться у стані зернистої чи вакуольної дистрофії. Місцями у серцевих м'язових клітинах не виявлялася посмугованість. При цьому зростає кількість кардіоміоцитів, пошкоджених по контрактурному типу. Зустрічаються також некрози кардіоміоцитів. В частинах серця спостерігалися вогнища кардіосклерозу. Відмічалась гіпертрофія і гіперплазія гладком'язових клітин артеріальних стінок, що призводило до звуження просвіту судин. В частинах серця зустрічалася жирова дистрофія міокарда. Таким чином, на основі отриманих результатів дослідження можна зробити висновок, що при тривалій реноваскулярній гіпертензії виникає гіпертрофія серця, при якій в гіпертрофічний процес втягнуто всі відділи серцевого м'яза з переважаючою гіпертрофією лівого шлуночка і лівого передсерддя. Цей процес чітко спостерігається на всіх рівнях структурної організації серця.

Після корекції артеріальної гіпертензії олігопептидними препаратами казеїну у тварин спостерігалось суттєве зниження артеріального тиску та нормалізація показників центральної гемодинаміки, електрокардіограми, покращення морфологічної структури відділів серця, які після артеріальної гіпертензії зазнали гіпертрофії, зокрема зменшення ступеня гіпертрофії кардіоміоцитів, зниження в них деструктивних процесів, наявність залишкових явищ набряку строми у правому і лівому шлуночках серця. Це дозволяє вважати олігопептидні казеїнові препарати ефективними антигіпертензивними і кардіопротекторними засобами.

Висновки

1. При розщепленні казеїну протеолітичними ферментами молочнокислих бактерій Lactococcus lactis subsp. lactis виділені низькомолекулярні фракції фізіологічно-активних пептидів, які мають антигіпертензивні властивості. Встановлено їх гальмівний вплив на активність ангіотензин-перетворюючого ферменту. У фізіологічних експериментах показано позитивний вплив цієї фракції на серцево-судинну систему щурів з артеріальною гіпертензією.

2. Запропонований метод виділення гомогенного препарату казеїну може бути застосований для одержання цього білку у лабораторних умовах. Показано, що система модельного протеолізу з використанням біомаси протеолітично-активних штамів бактерій та протеолітичних ферментів даєможливість отримати пептидні фракції, різні за молекулярною масою. Вона дозволяє проводити тестування молочнокислих бактерій та ферментних препаратів на їх здатність розщеплювати казеїнові білки до пептидних фракцій з фізіологічною активністю.

3. Отримані низькомолекулярні фракції казеїнових пептидів гальмують активність ангіотензин-перетворюючого ферменту, що лежить в основі їх антигіпертензивної дії.

4. При тривалій реноваскулярній гіпертензії відмічені гіперфункція і гіпертрофія серця, підвищення рівня системного артеріального тиску, зниження ударного і хвилинного об'ємів крові та зростання опору крові у периферичних судинах.

5. Введення виділених низькомолекулярних пептидних препаратів у шлунок тварин з експериментальною гіпертензією призводить до суттєвого зниження артеріального тиску, покращення показників центральної гемодинаміки, істотного зменшення ступеня гіпертрофії камер серця та нормалізації їхніх просторових характеристик.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1.Юкало В.Г., Луговий Б.Л. Характеристика методів препаративного виділення казеїну//Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія.-1998.-№3/4.-С.26-29.

2.Юкало В.Г., Луговий Б.Л., Дольна М.М. Характеристика фізіологічних властивостей штамів Lactococcus lactis ssp. lactis // Наукові записки Тернопільського державного педагогічного університету. Серія: Біологія. - 2000. - №2 (9). - С.70 - 73.

3.Юкало В.Г., Луговий Б.Л. Протеоліз казеїну протеолітично-активними штамами лактококів //Експериментальна та клінічна фізіологія і біохімія.-2000.-№ 2(10) .-С. 45-50.

4.Юкало В.Г., Б.Л.Луговий. Утворення антигіпертензивних пептидів при модельному протеолізі казеїну // Фізіологічний журнал.-2000. - Т.46. - №3. - С.78-83.

5.Луговий Б.Л., В.Г.Юкало, М.С.Гнатюк. Антигіпертензивнаактивність олігопептидних препаратів, отриманих при протеолізі казеїну лактококами у щурів з артеріальною гіпертензією //Медична хімія. - 2000. - №3. - С.16-19.

6.Юкало В.Г., Луговий Б.Л. Розщеплення білків казеїнового комплексу протеолітично-активними штамами Lactococcus lactis ssp. lactis // Тези доповідей Міжнародної науково-технічної конференції “Розроблення та впровадження прогресивних ресурсоощадних технологій в харчову та переробну промисловість”.- Київ:УДУХТ.-1997.-С.56.

7.Юкало В.Г., Луговий Б.Л. Вплив азиду натрію на протеолітичну активність лактококів. //Тези доповідей третьої науково-технічної конференції ТДТУ 24-26 листопада 1998 р.- Тернопіль: ТДТУ.-1998.- С.96.

8.Luhovyy B., Omelchenko O. Electrophoretic control of washing efficiency for removal of milk proteins from starter Lactococcus sp. cells //Тези доповідей 3-го Міжнародного медичного конгресу студентів і молодих вчених 10-12 травня 1999 р. Тернопіль: Укрмедкнига.-С.311.

9.Luhovyy B., Dolna M. The peptide inhibitors of angiotensin-converting enzyme derived from casein after proteolysis by Lactococcus lactis ssp. lactis // ІV Міжнародний медичний конгрес студентів і молодих вчених: Тези доп. - Тернопіль, 2000. - С.285-286.

10.Луговый Б.Л., Дольная М.М., Юкало В.В. Получение низкомолекулярных пептидных препаратов при модельном протеолизе ?s1- и казеинов // Тезисы докладов международной конференции “Химия и биотехнология пищевых веществ”. - Москва: ИБХФ РАН. - 2000. - С.96-97.

Размещено на Allbest.ru