Промышленная микробиология

Размещено на http://www.allbest.ru/

Промышленная микробиология



Содержание

1. Промышленная микробиология. Общие подходы

1.1 Микроорганизмы, их свойства, принципы использования в промышленной микробиологии

1.2 Свойства микроорганизмов, используемые в биотехнологии, методы получения «полезных микроорганизмов», улучшения их свойств

2. Промышленная микробиология. Получение антибиотиков, аминокислот, органических кислот и других продуктов

2.1 Природные и синтетические антибиотики. Основные группы антибиотиков, используемых в современной медицине. Первичные и вторичные метаболиты. Проблема «множественной» устойчивости болезнетворных микробов к антибиотикам Механизм действия на болезнетворные микробы

2.2 Важнейшие классы антибиотиков терапевтического назначения

2.3 Об устойчивости и путях преодоления резистентности

2.4 Синтез органических кислот, гормонов, ферментов, биологически активных веществ

2.5 Наиболее важные продукты микробиологического синтеза

3. Проектное задание

Литература



1. Промышленная микробиология. Общие подходы

1.1 Микроорганизмы, их свойства, принципы использования в промышленной микробиологии

Главным звеном биотехнологического процесса, определяющим его сущность, является клетка. Именно в ней синтезируется целевой продукт.

Клетка представляет собой миниатюрный химический завод, работающий с колоссальной производительностью, с предельной согласованностью и по заданной программе.

Ежеминутно синтезируются сотни сложнейших соединений, включая белки. микробиология антибиотик гормон фермент

Основа современного биотехнологического производства - микробиологический синтез, т.е. синтез различных веществ с помощью микроорганизмов. Тогда как объекты растительного и животного происхождения не нашли широкого применения из-за их высокой требовательности к условиям культивирования.

Для осуществления биотехнологического процесса микробного синтеза необходима культура микроорганизмов, питательная среда, аппаратура для выращивания и проведения вспомогательных операций, средства контроля и управления.

Начальным этапом микробного синтеза является получение чистых культур клеток.

Велик и многообразен мир микробов. В настоящее время известно более 100 тыс. видов микроорганизмов. К ним относятся прокариоты (бактерии, синезеленые водоросли) и эукариоты (дрожжи, простейшие и водоросли).

Для их успешного развития, размножения, необходимы определенные условия, в первую очередь наличие питательных веществ, из которых микробы синтезируют составные части своего тела и получают энергию.

По типам питания организмы подразделяют на автотрофные и гетеротрофные.

Автотрофные микроорганизмы обладают способностью создавать органические вещества из неорганических, они не нуждаются в органических соединениях углерода. К ним относятся нитрифицирующие и азотфиксирующие бактерии. Некоторые организмы содержат хлорофилл и используют солнечную энергию для фотосинтеза.

Гетеротрофные бактерии нуждаются для своего питания в органическом углероде, различных азотистых соединениях, неорганических веществах, микроэлементах и витаминах.

Гетеротрофные организмы подразделяются на сапрофитов и паразитов. Сапрофиты - живут за счет органических веществ, находящихся во внешней среде. К ним относ. б-во видов бактерий, населяющих нашу планету. Иначе их называют метатрофными. Паразиты живут на поверхности или внутри другого организма, и питаются за его счет. Подразделение на паразитов и сапрофитов не является абсолютным, поскольку невозможно установить четкую грань между этими подгруппами.

Возникает вопрос, как провести правильный выбор именно тех форм микроорганизмов, которые будут полезны для определенных биотехнологических целей.

1. Проводится выделение микроорганизмов. Отбираются пробы из тех мест, где обитание того или иного продуцента наиболее вероятно. Образцы проб вносят в жидкие питательные среды специального состава. Эти среды называют элективными.

В элективных средах создаются избирательные условия для преимущественного развития того или иного интересующего нас организма-продуцента путем варьирования различных факторов: источники энергии, азота, углерода, величины РН, температуры и осмотического давления. Например, Для накопления продуцента холестериноксидазы - среды с холестерином в качества единственного источника углерода; углеводородокисляющих микроорганизмов - среды с парафином; протеолитических продуцентов - среды, содержащие белки или липиды. Так получают накопительные культуры микроорганизмов.

2 Выделение чистых культур. Используют плотные питательные среды, на которые засевают образцы из проб накопительных культур. Отдельные клетки микроорганизмов на плотных питательных средах образуют изолированные колонии, при их последующем пересеве получается чистая культура, состоящая из популяций клеток одного вида.

Главный критерий при отборе продуцентов - способность синтезировать целевой продукт.

Требования к организмам-продуцентам с точки зрения микробиологической промышленности.

Микроорганизмы должны обладать:

1. Высокой скоростью роста;

2. Использовать для жизнедеятельности дешевые непищевые субстраты;

3. Устойчивостью к заражению посторонней микрофлорой.

Одноклеточные организмы характеризуются более высокой скоростью синтетических процессов, чем высшие формы живого. Например, корова 500 кг и дрожжи 5 г за одни сутки синтезируют 0,5 кг белка.

Немного более подробно рассмотрим такие группы как фотосинтезирующие микроорганизмы и термофильные микроорганизмы.

Фотосинтезирующие микроорганизмы - используют в процессе жизнедеятельности энергию света, способны к усвоению атмосферного азота, т.е. обходятся самыми дешевыми источниками энергии углерода, азота. Перспективны как продуценты аммиака, водорода, белка и различных биопрепаратов.

Термофильные микроорганизмы - оптимально растут при высоких температурах (60-80 градусов), что затрудняет развитие посторонней микрофлоры. Продуценты спиртов, аминокислот, ферментов. Их скорость роста и метаболическая активность выше в 1,5-2 раза, чем у мезофиллов (20-45). Их ферменты имеют высокую устойчивость к нагреванию, действию окислителей, органических растворителей и к другим неблагоприятным условиям.

1.2 Свойства микроорганизмов, используемые в биотехнологии, методы получения «полезных микроорганизмов», улучшения их свойств

Выделение и подбор объекта - важный этап биотехнологического процесса. Иногда путем простого отбора не удается получить высокоактивных продуцентов, поэтому возникает задача изменения природы организма в нужном направлении.

Для этого используют методы селекции. С их помощью получены промышленные штаммы микроорганизмов, синтетическая активность которых превышает активность природных штаммов в десятки и сотни раз.

Селекция - направленный отбор мутантов, т.е. организмов, наследственность которых претерпела скачкообразное изменение вследствие структурной модификации в нуклеотидной последовательности ДНК. Генеральные пути селекции -от слепого, спонтанного отбора продуцентов к сознательному конструированию их генома.

Методы, основанные на отборе спонтанных мутаций сыграли важную роль в развитии различных технологий с использованием микроорганизмов. Были отобраны штаммы пивных, винных, пекарских дрожжей, уксуснокислых бактерий. Может идти речь о ступенчатом отборе. Его суть - на каждом из этапов из популяции микроорганизмов отбираются наиболее высокоэффективные клоны. Ограниченность метода - низкая частота спонтанных мутаций, Изменения в структуре ДНК происходят редко 10⁶-10⁸ раз ген должен удвоиться, чтобы возникла мутация. Возможности метода неисчерпаемы. Высокая плотность микробных популяций (до 10⁹ кл на 1 мл) плюс непрерывное культивирование в больших объемах на протяжении многих поколений позволяют получить довольно большое количество мутантов. Например, дрожжи и устойчивость к этанолу, 650 часов.

Значительное ускорение селекции - индуцированный мутагенез. Индуцированный мутагенез - резкое увеличение частоты мутаций биообъекта при искусственном повреждении генома. Мутагенное действие вызывают:ультрафиолетовое, рентгеновское и гамма-излучение, химические соединения, вызывающие изменения первичной структуры ДНК (азотистая кислота, бромурацил, акридиновые красители и др.). Проводят тотальную проверку клонов (скрининг). Далее, отобрав наиболее продуктивные, опять воздействуют на геном и т.д. Здесь также идет речь о ступенчатом отборе по интересующему признаку. Недостатки: - трудоемкость, отсутствие сведений о характере мутаций, отбор проходит по конечному результату. Например, штаммы бактерий, устойчивых к тяжелым металлам:

- подавление бактериальной клеткой систем поглощения катионов тяжелых металлов;

- активация выброса тяжелых металлов из клетки;

- перестройка систем, чувствительных к ингибирующему действию тяжелых металлов.

Целенаправленные методы отбора продуцентов - по их устойчивости к структурным аналогам целевого продукта.

Если необходимо добиться накопления не конечного, а промежуточного продукта биосинтетического пути, то это может быть достигнуто с помощью мутанта, у которого блокирован следующий за интермедиатором этап синтеза.

Такой мутант ауксотрофен, т.е. растет только при добавлении в среду вещества, служащего продуктом блокируемой реакции.

Этот путь основан на переходе от прототрофных к ауксотрофным по определенному соединению штаммам.

Рассмотрели как выделяются из окружающей среды микроорганизмы, какие требования к ним предъявляются, как происходит улучшение их качеств.Теперь более подробно рассмотрим сам процесс культивирования.

Культивирование - это основная стадия технологического процесса микробного синтеза.

На данной стадии происходит: как накопление биомассы организма, так и накопление продуктов метаболизма.

Иногда конечный продукт - биомасса (бактериальные препараты). Иногда продукты, синтезируемые клеткой (антибиотики, аминокислоты, ферменты). При этом продукт может выделяться как в культуральную жидкость, так и накапливаться внутри клеток.

Культивирование микроорганизмов осуществляется следующими основными способами:

· поверхностное (жидкофазное - поверхность жидкой культуральной среды, твердофазное - плотной среды);

· глубинное, периодическое, отъемно-доливное, непрерывное.

В состав питательных сред для культивирования микроорганизмов входят:

· вода;

· источники углеродного питания: сахара (трисахариды, полисахариды, пентозы, гексозы) и многоатомные спирты. Во время их расщепления - выделяется энергия (АТФ), которая используется микроорганизмами;

· источники азотного питания (соли аммония, белки, аминокислоты, пептон, пептиды). Синтез белковых соединений, построение протоплазмы;

· источники фосфорного питания. Для протоплазмы - определяющие ее структуру и функции (фосфаты Na и K);

· факторы роста. Необходимы в малых дозах. Участвуют в процессах обмена веществ.

Характеристика основных питательных сред

В зависимости от состава и назначения, питательные среды подразделяют на ряд групп:

· по консистенции: жидкие, полужидкие, твердые (агаризированные среды, свернутая сыворотка, свернутый яичный белок), сыпучие;

· по строению и сложности подразделяют на простые (обычные, универсальные (пептонная вода, питательная желатина и др.) и сложные (кровяной агар, асцитический агар);

· по назначению, питательные среды подразделяют на дифференциально-диагностические, элективные, накопительные, консервирующие;

· по составу: натуральные, синтетические (строго определенные пропорции химических. соединений и воды) и полусинтетические (среда из картофельного крахмала с глюкозой);

· по количеству питательных веществ:минимальная среда - лишь источники питания; богатая среда - содержит дополнительные вещества (аминокислоты, витамины, и т.п.) Приводит к увеличению скорости роста и изменению ферментного состава биомассы.

Выше мы рассмотрели клеточные организмы. Условия их существования, питания, размножения.

Теперь о вирусах.

Вирус - это облигатный внутриклеточный паразит, геном которого представлен одним видом нуклениовой кислоты - ДНК или РНК. Тогда как для рассмотренных выше типов микроорганизмов характерно наличие в геноме как РНК так и ДНК.

Вирион - инертные формы, в которые превращается вирус при переходе из одной клетки хозяина в другую; они не участвуют в обменных реакциях и сами по себе не размножаются. Репродукция (размножение) вирусов происходит внутри клеток.

Как это происходит:

- прикрепление (адсорбция) вируса на поверхности клетки

-проникновение вируса в клетку

- освобождение вируса от белковой оболочки (раздевание), что приводит к эклипсу, при котором происходит транскрипция специфических последовательностей родительской вирусной ДНК или РНК с обр-м мРНК;

- трансляция мРНК и появление кодируемых вирусом ферментов;

-репликация вирусной РНК или ДНК;

- дальнейшая транскрипция дочерней и родительской нуклеиновой кислоты;

- накопление структурных и других кодируемых вирусом белков, часть из которых обладает регуляторными функциями;

- самосборка вирусных белков вокруг генома вируса;

- выход вирионов из клетки.



2. Промышленная микробиология. Получение антибиотиков, аминокислот, органических кислот и других продуктов

2.1 Природные и синтетические антибиотики. Основные группы антибиотиков, используемых в современной медицине. Первичные и вторичные метаболиты. Проблема «множественной» устойчивости болезнетворных микробов к антибиотикам Механизм действия на болезнетворные микробы

Современную медицину невозможно представить без множества лекарств, о которых мы даже не задумываемся, - они для нас всегда были, есть и будут. В первую очередь, это касается антибиотиков. Пожалуй, трудно встретить в цивилизованном мире того, кто ни разу в жизни ими не лечился. И хотя мир узнал об антибиотиках чуть более 70 лет назад, их открытие имело огромное значение. Например, считается, что именно эта группа препаратов позволила продлить жизнь человека в среднем на 20 лет.

Антибиотики - химиотерапевтические вещества биологического (микробного, растительного, животного) , полусинтетического или синтетического происхождения, которые в малых концентрациях вызывают торможение размножения или гибель чувствительных к ним микробов и опухолевых клеток во внутренней среде (эндосоматически) животного организма.

Антибиотики существовали всегда - столько же, сколько существуют микроорганизмы. Дело в том, что микроорганизмы - бактерии и грибы - вырабатывают специальные вещества - антибиотики для защиты своей территории обитания от конкурентов. Эти вещества смертельно опасны для врагов, но абсолютно безвредны для хозяина. Они помогают микробам выжить в борьбе за существование, а в последние десятилетия - после внедрения антибиотиков в медицинскую практику - помогают людям, страдающим бактериальными инфекциями. Но идея применить антибиотики для подавления болезнетворных бактерий возникла в науке не сразу.

Самый первый известный нам антибиотик появился в Китае две с половиной тысячи лет назад. В то время, китайцы обнаружили, что если прикладывать створожившееся соевое молочко к месту поражения инфекцией, то такой компресс оказывает определенное терапевтическое действие. Средство было настолько эффективным, что стало стандартным выходом из ситуации.

Исторические свидетельства гласят о том, что и в других культурах использовались вещества наподобие антибиотиков. В Судано-Нубийской цивилизации тип тетрациклина использовался уже в 350 году. В Европе в Средние века экстракты растений и сырная сыворотка использовались для лечения инфекций. Невзирая на то, что эти культуры уже использовали антибиотики, научные основы их деятельности были выведены только в двадцатом веке.

Одним из первых пионеров науки стал Луи Пастер. В 1877 году он и его сотрудник обнаружили, что рост болезнетворной бактерии можно остановить, если запустить к ней другую бактерию. Они показали, что огромные количество бацилл сибирской язвы не причинят никакого вреда животным, если их давать вместе с бактериями сапрофитами. Исследования, проведенные другими учеными в последующие годы окончательно подтвердили вердикт: материалы на основе бактерий могут убивать болезнетворные микроорганизмы.

Еще до открытия антибиотиков (веществ естественного происхождения) врачи пытались искусственно создать антибактериальные препараты. Сначала немецкий микробиолог Роберт Кох выделил так называемый туберкулин - стерильную жидкость, содержащую вещества, вырабатываемые бациллой туберкулеза в ходе роста. Но данный препарат оказалось невозможным применить для лечения туберкулеза в силу его токсичности. Вместе с тем туберкулин стали использовать для диагностики этого заболевания.

Несколько позднее также немецкий ученый Пауль Эрлих, много лет работая над проблемой лечения инфекционных заболеваний, получил вещество, избирательно действовавшее на возбудителя сонной болезни - трипаносому. Оно представляло собой соединение мышьяка и получило название «сальварсан» (от лат. salvare - спасать и arsenicum - мышьяк). В 1906 году, после открытия возбудителя сифилиса - бледной спирохеты, сальварсан стал использоваться как лекарство против этого заболевания. Так, еще до появления антибиотиков были созданы вещества для борьбы с инфекциями.

Антибиотики обладают мощным действием на многие микробы, но, конечно, не на все. Антибиотиков универсального действия пока нет. Ученые стремятся к получению антибиотиков так называемого широкого спектра действия. Это значит, что такие антибиотики должны действовать на большое количество различных микробов, и такие антибиотики созданы. К их числу относятся стрептомицин, тетрациклин, хлорамфеникол и др. Но именно потому, что они вызывают гибель массы разнообразных микробов (но не всех), оставшиеся становятся агрессивными и могут причинить вред. В то же время за ними большое будущее.

В настоящее время антибиотики стали применяться и для лечения животных и птиц. Так многие инфекционные заболевания птиц благодаря антибиотикам перестали быть бичом в птицеводстве. В животноводстве и птицеводстве антибиотики стали применяться как стимуляторы роста. В сочетании с некоторыми витаминами, прибавленными к корму цыплят, индюшат, поросят и других животных, антибиотики способствуют усилению роста и увеличению их веса.

Среди антибиотиков имеются вещества ациклической, гетероциклической, ароматической, тетрациклиновой структуры, а также макролиды, хинолоны, аминогликозиды, ?-лактамные, полипептиды и др.

В 1980 г. мировое производство антибиотиков составляло примерно 25000 т, из них 17000 т. - пенициллины, 5000 т. - тетрациклины, 1200 т. - цефалоспорины и 800 т. -эритромицины.

2.2 Важнейшие классы антибиотиков терапевтического назначения

По направленности ингибирующего действия различают противобактериальные, противогрибковые, противовирусные, противопротозойные, противоопухолевые антибиотики. Они могут обладать узким (например, бензилпенициллин), умеренным (например, ампициллин) или широким (например, аминогликозиды, тетрациклины) спектром действия.

Природная чувствительность микробов к антибиотикам связана с наличием в их составе мишеней, структур, на которые антибиотики оказывают повреждающее действие, или звеньев метаболизма, которые они блокируют, а природная устойчивость - с отсутствием у микроба таких мишеней, малой доступностью таких мишеней для антибиотика. или слабым сродством антибиотика к мишени.

Мишенями действия антибиотика чаще всего бывают клеточная стенка, особенно ее пептидогликан, цитоплазматическая мембрана, обычно пермеазы или другие расположенные в ней ферменты, рибосомы, митохондрии, генетические структуры или отдельные этапы синтеза белка, НК, липидов. В зависимости от важности мишеней для жизненных функций микроорганизма, обратимости повреждения, а также от концентрации и условий действия, антибиотики оказывают микробоцидное, оканчивающееся гибелью объекта, либо микробостатическое действие. В последнем случае происходит приостановка роста и размножения микроба в присутствии антибиотика. После удаления антибиотика из среды обитания микроба или утраты им антимикробных свойств, рост и размножение микроба возобновляются.

Изменение мишеней действия антибиотика приводит к развитию устойчивости микробов к антибиотикам, которая может распространяться и на др. антибиотики с аналогичным механизмом действия (перекрестная устойчивость). Возможны и иные механизмы приобретенной устойчивости к антибиотикам - синтез ферментов, разрушающих антибиотики (например, ?-лактамаза, разрушая?-лактамное кольцо пенициллинов, превращает их в безвредные для микроба вещества), а также ограничение доступа антибиотика к мишени, снижение метаболической ценности мишени, выброс антибиотика из бактериальной клетки эфлюс-системой, сверхпродукция молекул мишени.

Приобретенная устойчивость может быть связана с изменением фенотипа или генотипа микроба. При фенотипической устойчивости происходит повышение устойчивости к антибиотику у большинства особей популяции, устойчивость носит адаптивный, временный характер и вызвана феноменом репрессии-депрессии генов хромосомы или плазмид.

Генотипическая устойчивость возникает в результате одно- или многоступенчатой мутации в хромосоме или R-плазмидах, а также путем передачи R-плазмиды или участка хромосомы, ответственного за устойчивость, путем конъюгации, трансдукции или трансформации от устойчивой особи к чувствительной, транслокация генов устойчивости транспозонами. Мутация и перенос генетического материала, как правило, обусловливают развитие устойчивости к одному-двум А., передача R-плазмиды часто сопровождается формированием устойчивости ко многим антимикробным веществам, к появлению т.н. множественно-устойчивых штаммов.

В чувствительной к антибиотикам популяции первоначально возникают единичные устойчивые мутанты или рекомбинанты. В неселективной среде обитания они обычно элиминируются, а в селективной, т.е. в среде, содержащей соответствующий атибиотик, они быстро приобретают доминирующее положение. Появление устойчивых к антибиотику. популяций микробов может быть также обусловлено заносом в популяцию и селекцию в ней устойчивых иммигрантов из других популяций. Это явление часто наблюдается в больничных условиях.

Совместное влияние двух или трех антибиотиков в зависимости от механизмов их действия может оказать суммарный (аддитивный), ниже суммарного (антагонистический) или выше суммарного (синергидный) эффект

Антимикробная активность одного и того же антибиотика не всегда совпадает при испытании его в пробирочных опытах и при лечении больного, что вызвано активацией или инактивацией его в результате метаболических реакций микроорганизма, неадекватности условий, в которых проявляется действие антибиотика, и гетерогенностью микробных популяций по признаку устойчивости к антибиотику.

Клиническое применение антибиотика нередко осложняется их токсическим действием, развитием лекарственной аллергии, супер- и вторичной инфекцией, дисбактериозом, угнетением иммунного ответа, переходом болезни в хроническую форму, лекарственной инфекцией. Указывается на вероятность тератогенного и онкогенного действия некоторых антибиотиков. Достижение терапевтического эффекта без развития осложнений возможно при соблюдении научных принципов рациональной терапии.

2.3 Об устойчивости и путях преодоления резистентности

Чтобы контролировать антибиотикорезистентность необходимо знать, какие микробы к каким антибиотикам приобретают устойчивость. Это важно и в амбулаторной практике популяции. Это особенно важно в госпитальной практике. Потому что именно в XX веке мы столкнулись с проблемой внутрибольничных инфекций. Раньше их не было. И особо остро строит проблема антибиотикорезистентности именно среди возбудителей инфекций у пациентов, которые находятся в стационаре.

Дело в том, что скученность пациентов в стационаре - это неизбежное явление. Широкое применение антибиотиков ведет к тому, что происходит постоянный отбор, так называемая селекция устойчивых штаммов микроорганизмов, которые приобретают устойчивость к антибактериальным препаратам. И эти микробы делятся факторами резистентности с другими микробами. И постепенно внутри стационара создается такая благоприятная среда, где циркулируют особые штаммы микроорганизмов, с которыми очень сложно бороться, которые характеризуются устойчивостью к некоторым антибиотикам, а иногда и к многим антибиотикам.

Так называемая полирезистентность. Столкнулись с проблемой так называемой панрезистентности. Уже есть микроорганизмы, которые устойчивы абсолютно ко всем применяемым антибиотиком.

Были ли какие-то попытки международного сообщества выработать общие рекомендации, как поступать в случае появления действительно панрезистентных микроорганизмов?

Пути преодоления резистентности.

1. Создание новых антибиотиков

Причины редкого появления новых антибиотиков: во-первых -дороговизна ; во-вторых, для того, чтобы внедрить в клиническую практику новые антибактериальные препараты, нужно пройти все этапы доклинического и клинического исследования, которые занимают несколько лет, иногда до десяти лет.

2. Разработка "быстрых тестов", показывающих, является ли эта инфекция, например, бактериальной, то есть той, при которой необходимо применять антибиотики, или эта инфекция вызвана, например, не бактериями, а вирусами, и ее лечение не должно сопровождаться применением бактерицидных препаратов. Потому что именно избыточное применение антибиотиков является одной из основных движущих сил, которые стимулируют развитие резистентности у микроорганизмов.

Что касается важности определения, бактериальная или вирусная эта инфекция, необходимо помнить, что антибиотики - это уникальный класс лекарственных средств. И они не действуют на вирусы. Антибиотики действуют только на бактерии. Ну, несколько антибиотиков действуют и на грибы. И это необходимо очень четко представлять.

3. Не использовать антибиотики в пищевой промышленности. Часто у микроорганизмов вырабатывается устойчивость к препаратам, находящимся в пищевых продуктах (Тетрациклин), почему это происходит? Традиционно в сельском хозяйстве они используются не только для лечения, а как стимуляторы роста.(КРС, птицы, добавляют в корм рыб, креветки, устриц, опрыскивание плодовых деревьев для того, чтобы защитить от бактерий). Это прямой фактор развития антибиотикорезистентности. И доказано, что происхождение антибиотикорезистентности у многих бактерий - это из-за использования антибиотиков в сельском хозяйстве. К сожалению, те продукты питания, которые поступают в нашу страну по импорту, они не проверяются на содержание антибиотиков. Они проверяются на многие другие компоненты токсические, но вот на содержание антибиотиков они не проверяются, к сожалению.

4, Строгий контроль над расходованием антибиотиков.

У людей, которые меньше принимают антибиотиков, безусловно, меньше риск возникновения устойчивых микроорганизмов - это факт.

2.4 Синтез органических кислот, гормонов, ферментов, биологически активных веществ

Микробиологический синтез - промышленный способ получения химических соединений и продуктов (напр., дрожжей кормовых), осуществляемый благодаря жизнедеятельности микробных клеток. Иногда к микробиологическому синтезу относят также промышленные процессы, основанные на использовании иммобилизованных клеток.

Некоторые продукты микробиологического синтеза, например, пекарские дрожжи, давно использовались человеком, однако широкое применение микробиологического синтеза началось в 40-50-х гг. 20 века в связи с освоением производства пенициллина. К этому же времени относится возникновение новой отрасли народного хозяйства - микробиологической промышленности.

В микробиологическом синтезе. сложные вещества образуются из более простых в результате функционирования ферментных систем микробной клетки. Этим он отличается от брожения, в результате которого также образуются различные продукты обмена веществ микроорганизмов (спирты, органические кислоты и др.), но преимущественно в результате ферментативного распада орг. веществ.

Микробиологический синтез. использует способность некоторых организмов размножаться с большой скоростью (выделены бактерии и дрожжи, биомасса которых увеличивается в 500 раз быстрее, чем у самых урожайных сельскохозяйственных культур) и к "сверхсинтезу" - избыточному образованию продуктов обмена веществ (аминокислот, витаминов и др.), превышающему потребности микробной клетки. Такие микроорганизмы выделяют из природных источников или получают их мутантные штаммы (например, мутантные штаммы плесневых грибов продуцируют пенициллин в 100-150 раз быстрее, чем природные). В качестве продуцентов находят применение культуры, полученные методами генетической. инженерии, в которых функционирует чужеродный для них ген, например, в бактерии кишечной палочки (Escherichia соli)-ген гормона роста человека.

Для микробиологического синтеза органических соединений в качестве сырья применяют наиболее дешевые источники азота (например, нитраты или соли аммония) и углерода (например, углеводы, оргаические кислотыты, спирты, жиры, углеводороды, в т.ч. газообразные). Микробиологический синтез включает ряд последовательных стадий. Главные из них:

· подготовка необходимой культуры микроорганизма-продуцента;

· выращивание продуцента;

· культивирование продуцента в заданных условиях, в ходе которогорого и осуществляется микробиологический синтез (эту стадию часто называют ферментацией);

· фильтрация и отделение биомассы;

· выделение и очистка требуемого продукта (если это необходимо);

· сушка.

Рис. 1. Рост бактериальной культуры

Развитие микроорганизмов в статических условиях ограничено определенным объемом питательной среды. Закономерности характерны для периодического культивирования и могут быть отражены на графике зависимости логарифма количества клеток от времени культивирования. Выделяют 4 фазы роста:

1. Начальная фаза (лаг-фаза) - время приспособления (адаптации) микроорганизма к питательной среде, размножения клеток не наблюдается. Начинается синтез необходимых ферментов (механизм регуляции синтеза белка). Продолжительность фазы зависит от видовых особенностей, количества и возраста (активности ферментных систем) клеток, состава питательной среды, условий культивирования. Если активная культура попадает в такую же среду, лаг-фаза минимальная. Клетки обладают повышенной чувствительностью к внешним воздействиям.

2 Фаза логарифмического роста. Характерна максимальная скорость роста и размножения клеток; в культуре много молодых, биологически активных мко. Продолжительность зависит от количества питательных веществ, скорости накопления и токсичности продуктов метаболизма, аэрации для дрожжей. Устойчивость к неблагоприятным условиям внешней среды повышается.

Постепенно среда истощается, уменьшается количество доступных источников питания, накапливаются продукты обмена веществ. Для увеличения продолжительности этой фазы при непрерывном культивировании вводят новые порции питательной среды и удаляют часть клеток и продукты метаболизма.

3. Стационарная фаза - равновесие между числом образовавшихся и погибших клеток. Устойчивость клеток высокая. Скорость размножения снижается. При культивировании заквасок - фаза урожая. В дрожжевом производстве - дозревание клеток. Растет концентрация токсичных продуктов обмена.

4. Фаза отмирания - прекращение роста и размножения, уменьшение количества живых клеток, появление деградированных (больных) форм, формируются споры, накапливаются вторичные продукты метаболизма. Фаза может длиться несколько недель или месяцев, культура погибает.

Продукты метаболизма. После внесения культуры в питательную среду наблюдается лаг-фаза, когда видимого роста микроорганизмов не происходит; этот период можно рассматривать как время адаптации. Затем скорость роста постепенно увеличивается, достигая постоянной, максимальной для данных условий величины; такой период максимального роста называется экспоненциальной, или логарифмической, фазой. Постепенно рост замедляется, и наступает т.н. стационарная фаза. Далее число жизнеспособных клеток уменьшается, и рост останавливается.

Следуя описанной выше кинетике, можно проследить за образованием метаболитов на разных этапах. В логарифмической фазе образуются продукты, жизненно важные для роста микроорганизмов: аминокислоты, нуклеотиды, белки, нуклеиновые кислоты, углеводы и т.д. Их называют первичными метаболитами.

Первичные метаболиты -- это продукты метаболизма, необходимые для роста и выживания.

Многие первичные метаболиты представляют значительную ценность. Так, глутаминовая кислота (точнее, ее натриевая соль) входит в состав многих пищевых продуктов; лизин используется как пищевая добавка; фенилаланин является предшественником заменителя сахара аспартама. Первичные метаболиты синтезируются природными микроорганизмами в количествах, необходимых лишь для удовлетворения их потребностей.

В фазе замедления роста и в стационарной фазе некоторые микроорганизмы синтезируют вещества, не образующиеся в логарифмической фазе и не играющие явной роли в метаболизме. Эти вещества называют вторичными метаболитами.

Вторичные метаболиты -- продукты метаболизма, которые не требуются для роста и не существенны для выживания. Тем не менее, они выполняют полезные функции и часто защищают от действия других конкурирующих микроорганизмов либо подавляют их рост.

Их синтезируют не все микроорганизмы, а в основном нитчатые бактерии, грибы и спорообразующие бактерии. Таким образом, продуценты первичных и вторичных метаболитов относятся к разным таксономическим группам.

В качестве вторичных метаболитов. микроорганизмы образуют некоторые пигменты, антибиотики, витамины.

Если вопрос о физиологической роли вторичных метаболитов в клетках-продуцентах был предметом серьезных дискуссий, то их промышленное получение представляет несомненный интерес, так как эти метаболиты являются биологически активными веществами: одни из них обладают антимикробной активностью, другие являются специфическими ингибиторами ферментов, третьи - ростовыми факторами, многие обладают фармакологической активностью. Получение такого рода веществ послужило основой для создания целого ряда отраслей микробиологической промышленности. Первым в этом ряду стало производство пенициллина; микробиологический способ получения пенициллина был разработан в 1940-х годах и заложил фундамент современной промышленной биотехнологии.

2.5 Наиболее важные продукты микробиологического синтеза

Антибиотики. Большинство антибиотиков накапливается вне клеток микроорганизма-продуцента, которыми в основном являются актиномицеты, некоторые грибы и бактерии (главным образом их мутантные формы). Антибиотики, употребляемые преимущественно в медицине, подвергаются высокой степени очистки. Антибиотики для лечения сельскохозяйственных. животных имеют специфическую активность относительно наиболее распространенных для них заболеваний, например, гельминтозов, кокцидиозов и других. Для добавки в корма обычно выпускают концентрат среды после выращивания в ней продуцента, иногда вместе с биомассой, содержащей значит. количество других продуктов обмена веществ продуцента, в том числе витамины, аминокислоты, нуклеотиды и др.

Аминокислоты. Существенное преимущество микробиологического синтеза. аминокислот - возможность их получения в виде природных изомеров (L-форм). Продуцентами аминокислот служат, главным образом, мутанты, лишенные ряда ферментных систем, благодаря чему происходит сверхсинтез необходимого продукта. Обычно используют бактерии, относящиеся к роду Brevibacterium. Наибольший удельный вес среди аминокислот, вырабатываемых мировой промышленостью, занимают лизин и глутаминовая кислота. Получены мутанты микроорганизмов, способные к сверхсинтезу всех кодируемых аминокислот.

Нуклеозидфосфаты. Развитие микробиологического синтеза нуклеотидов (ино-зиновой, гуаниловой и других кислот) связано с перспективами получения искусственной пищи, где их используют в качестве вкусовых добавок. При введении в состав среды для культивирования микроорганизмов метаболических предшественников продуктов синтеза можно получать практически все известные нуклеозидфосфаты, в том числе АТФ. Накопление нуклеозидфосфатов происходит преимущественно вне клеток микроорганизмов.

Витамины, провитамины, коферменты. Методом микробиологического синтеза. производят в основном витамин В₁₂ и его коферментную форму. Продуцентами в этом процессе служат пропионовокислые бактерии. Для получения кормовых концентратов, содержащих витамин В₁₂, на отходах бродильной промышленности (послеспиртовые, ацетоно-бутиловые барды и др.) применяют комплекс метанообразующих бактерий. Разработаны способы получения витамина В₂, р-каротина и дрожжей, обогащенных эргостеринами. При использовании соответствующих метаболических предшественников возможен также микробиологический синтез никотинамидных коферментов, например, никотинамидаде-ниндинуклеотида.

Алкалоиды. Грибы рода спорыньи (Claviceps)-продуценты эргоалкалоидов, в основе строения молекул которых лежит гетероциклический эрголин. Некотоые из этих алкалоидов (например, эргометрин и эрготамин) используют как маточные средства. Описаны также многочисленные продуценты других алкалоидов.

Гиббереллины. Их микробиологический синтез. осуществляют при культивировании грибов, относящихся к классу аскомицетов (Ascomycetes), напр. Gibberella fujikuroi. Выделяют гиббереллины из фильтрата культуральной жидкости. По химической природе все они являются тетрациклическими. карбоновыми кислотами, относящимися к дитерпенам.

Ферменты. Продуцентами ферментов служат многочисленные представители микроскопических грибов, некоторыерые актиномицеты и другие бактерии. Технология получения ферментных препаратов упрощается, если фермент продуцируется в питательную среду. При выделении внутриклеточных ферментов необходимо предварительно разрушить клетки микроорганизмов. Для исследовательских работ, аналитических целей и т. п. обычно получают ферменты в виде гомогенных (индивидуальных) белков. При промышленной переработке сельскохозяйственного. сырья в пищевой промышленности иногда применяют комплексные ферментные препараты. Так, при переработке растительноо сырья ферментный комплекс должен содержать целлюлазы, гемицеллюлазы, пектиназы, протеазы и некоторые другие ферменты. Один из важнейших ферментов, получаемый с помощью микробиологического синтеза -глюкоизомераза, катализирующая изомеризацию глюкозы во фруктозу. Образующийся глюкозо-фруктозный сироп используют в пищевой промышленности вместо сахарозы.

Белково-витаминные препараты. Особое внимание как источник белка привлекает микробная биомасса. Производство такой биомассы на дешевом сырье рассматривают как одно из средств устранения растущего белкового дефицита в питании животных. Наибобее интенсивное развитие получили промышленные методы микробиологического синтеза. кормовых дрожжей, применяемых в виде сухой биомассы как источник белка и витаминов в животноводстве. Для выращивания кормовых дрожжей используют углеводороды, гидролизаты различных отходов деревообрабатывающей промышленности, непищевых растительные материалов (подсолнечная лузга, стержни кукурузных початков и т.п.). Для получения кормовых микробных препаратов в качестве компонентов среды могут быть также использованы этанол, метанол, уксусная кислота. Культивирование дрожжей на углеводородах требует высокой культуры производства. В частности, необходима надежная герметизация аппаратуры, исключающая вынос микробных клеток в окружающую среду.

К числу продуктов микробиологического синтеза относятся также некоторые средства защиты растений, например бактериальные энтомопатогенные препараты, вызывающие гибель вредных насекомых и предотвращающие их массовое размножение, и многие бактериальные удобрения.

Синтез аминокислот. Аминокислоты играют большую роль в здравоохранении, животноводстве и легкой промышленности. По значению для макроорганизма аминокислоты подразделяют на заменимые и незаменимые. К незаменимым относятся те аминокислоты, которые не синтезируются в животном или человеческом организме, они должны быть привнесены с пищей или кормом для животным (табл. 1 ).

Таблица1. Заменимые и незаменимые аминокислоты.

Незаменимые	Заменимые
Валин	Аланин
Изолейцин	Аспарагин
Лейцин	Апарагиновая кислота
Лизин	Глицин
Метионин	Глутамин
Треонин	Глутаминовая кислота
Триптофан	Пролин
Фенилаланин	Серии
	Тирозин
	Цистеин
	Аргинин
	Гистидин



Заменимые синтезируются in vivo из аммиака и различных источников углерода. Микроорганизмы сами синтезируют все необходимые им аминокислоты из аммиака и нитратов, а углеродные « скелеты » - из соответствующих интермедиаторов.

Исходя из оценки аминокислот, ученые давно стремятся использовать способности микроорганизмов продуцировать заменимые и незаменимые аминокислоты в ощутимых количествах.

Потребность людей в аминокислотах достаточно велика и этим определяется уровень их производства в мире (порядка 500 тыс. тонн в год).

Большинство микроорганизмов и зеленые растения способны синтезировать de novo все двадцать аминокислот. Углеродные скелеты аминокислот образуются из промежуточных продуктов обмена

В любом живом организме аминокислоты расходуются прежде всего на биосинтез первичных метаболитов - ферментных и неферментных белков. Следовательно, кроме биосинтеза аминокислот de novo, возможен другой путь их получения, а именно - из гидролизатов соответствующих белков (триптофан разрушается при кислотном гидролизе ), в том числе из нативной биомассы микробных клеток.

Продуценты аминокислот. Специфические ферменты, регулирующие биосинтез аминокислот, широко распространены у бактерий; они с определенной глубиной изучены у Escherichia coli. Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis и прочие. У грибов, на аминокислотное лимитирование, отмечается некоординированное, параллельное возрастания уровня ферментов, катализирующих реакции биосинтеза различных аминокислот. Этот «общий контроль биосинтеза аминокислот » был также назван « метаболическим интерблоком », или « перекрестнопутевой регуляцией », впервые выявленной у Neurospora crassa в 1965 году М. Карсиотисом и сотрудниками, а позднее - у Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus nidulas и других грибов.

В гиперпродукции отдельных аминокислот культурами Escherichia coli, Serratia marcescens и другие важную роль играют Feedak - репрессия, например, при биосинтезе ароматических аминокислот на последних стадиях.

Природные аминокислоты являются, как правило, оптически активными L - и D - формами, которые трудно разделить. Вот почему микробный синтез с помощью коринебактерий и некоторых других микробов является ныне основным и экономически выгодным. Первое место здесь по праву занимает Япония, где лишь глутаминовой кислоты изготавливается свыше 100 тысяч тонн в год; большинство природных незаменимых аминокислот производит фирма «Такеда».

Получены микробы - суперпродуценты из родов Brevibacterium, Corynebacterium, Micrococcus и другие, с помощью которых освоено крупнотоннажное производство не только глутамата, но и L - лизина, L - валина, L - гистидина и других.

В настоящее время имеются продуценты, у которых количество синтезируемого специфического белка достигает 10-15% (здесь важнейшую роль играют многокопийные плазмиды, несущее встроенный гены).

Генно - инженерными методами во ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов ( Москва ) был получен штамм Escherichia coli, обладающий сверхпродукцией L - треонина (30 г / л за 40 часов ферментации ).

С любым штаммом, продуцентом какой - либо аминокислоты, необходимо внимательное и бережное обращение в целях поддерживания ее в активном состоянии в течении длительного времени.

Получен штамм Escherichia coli, продуцирующий за 48 часов 27 г / л L - пролина, и штамм, продуцирующий до 22,4 г / л L - фениланина.

С помощью Corynebacterium sp. можно получигь алкапосодержащих средах L - тирозин (до 19 г/л ); с помощью Corynebacterium glutamicum на глюкозной среде - L - валин (до 11 г / л; L - аргинин, L - гистидин, L - изолейцин - 15 - 20,8 г / л.

Получение аминокислот с помощью иммобилизованных ферментов и клеток. Экономически целесообразным являются способы получения аминокислот с помощью иммобилизованных ферментов и клеток. Сравнительно давно реализован процесс получения L - аспаргиновой кислоты из фумаровой и аммиака в одну стадию с помощью иммобилизованных клеток Е. coli или Pseudomonas aeruginosa

Промышленный синтез аминокислот. Промышленное производство аминокислот осуществляется двумя способами: микробиологическим и химическим.

Микробиологический синтез. Микробиологический синтез основан на выращивании определенных видов микроорганизмов на питательных средах, имеющих подходящий источник углерода (чаще всего это сахара, содержащиеся, например, в патоке). Мутированные микроорганизмы с нарушенным азотным обменом выделяют в раствор большое количество какой-либо одной аминокислоты. После окончания процесса ферментации аминокислоту выделяют из раствора химическими методами

Путем микробиологической ферментации получают основное количество глутаминовой кислоты и весь лизин. У этого процесса свои преимущества и свои недостатки. С одной стороны, в нем мало стадий и требуется относительно простая и универсальная аппаратура. С другой стороны, живые микроорганизмы, с которыми приходится работать, очень чувствительны к малейшему изменению условий, а концентрация целевого продукта получается низкой, что ведет к увеличению размеров аппаратуры.

Существует способ микробиологического получения фенилаланина при помощи тирозин - и метиониндефицитного мутанта Brevibacterium lactofermentum. В периодическом процессе ферментации достигнута концентрация продукта 24,8 г/л. Однако для данного процесса требуются сложные и дорогие среды. Определенный интерес представляют биосинтез фенилаланина ауксотрофным мутантом Е. coli, который можно культивировать в глюкозной среде с фосфатами. Процесс ферментации осуществляют доливным методом с рециркуляцией биомассы. Биомасса в реакторе 60 - му часу достигает 45 - 50 г/л, а концентрация фенилаланина - 22,4 - 22,8 г/л. Продуктивность системы 0,72-0,86 г/( лч ); выход продукта 0,11г.

Химический синтез. Химический синтез более универсален, чем микробиологический, и позволяет получать соединения любой возможной структуры. Здесь используется непищевое минеральное сырье, достигается любая концентрация продукта, однако, как правило, процесс многостадиен и требует более сложной аппаратуры.

Оба способа обеспечивают получение природных аминокислот необходимой степени химической и оптической чистоты. Так что, в конечном счете, когда речь идет о промышленном производстве, последнее слово остается за экономикой: по данным зарубежных специалистов, при больших масштабах химические методы становятся более рентабельными.



3. Проектное задание

1. На основе анализа литературных источников охарактеризуйте основные типы микроорганизмов, применяемые в промышленной биологии и методы улучшения их свойств

2. Выявите преимущества биотехнологической техники производства органических кислот, гормонов, ферментов, биологически активных веществ перед химической.

3. Обоснуйте механизм действия антибиотиков на болезнетворные микробы.



Литература

1. Баев А.А., Быков В.А.. Биотехнология - союз науки и производства. М.: Советская Россия, 1987.

2. Баранов В. Медицина на пороге революции /Наука и жизнь. 2000, №9.

3. Безбородов A.M. и др. Основы биотехнологии микробных синтезов. Ростов н/Д, Изд-во РГУ, 1989.

4. Зеленый мир. Российская экологическая газета. Устойчивость к антибиотикам. 1998, №5. - С. 15

5. Сэссон А. Биотехнология: свершения и надежды. М.: Мир, 1987. - С. 196-242.

Размещено на Allbest.ru

...