Хроматографические методы анализа

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

Хроматография - это физико-химический метод разделения и анализа смесей газов, паров, жидкостей или растворенных веществ сорбционными методами в динамических условиях.

Хроматографический метод анализа разработан русским ботаником М.С. Цветом в 1903 г. С помощью этого метода ему удалось разделить хлорофилл на составляющие окрашенные вещества. При пропускании экстракта хлорофилла через колонку, заполненную порошком мела, и промывании петролейным эфиром он получил несколько окрашенных зон и назвал эти зоны хроматограммой (от греческого “хроматос” -- цвет), а метод - хроматографией. Н.А. Измайлов и М.С. Шрайбер в 1938 г. разработали новый вид хроматографии, получивший название тонкослойной. Ими были разделены алкалоиды, экстрагированные из лекарственных растений на оксиде алюминия, нанесенном на стекло.

Отправной точкой бурного развития многих методов хроматографического анализа является работа лауреатов Нобелевской премии A. Мартина и Р. Синджа, ими был предложен и разработан метод распределительной хроматографии (1941г.). В 1952 г. А. Мартином и Л. Джеймсом были получены первые результаты в области газожидкостной хроматографии. Эти работы вызвали огромное число исследований, направленных на развитие метода газовой хроматографии [2,c.26].

1. Классификация хроматографических и электрофоретических методов по способу разделения

Хроматографический метод основан на распределении исследуемого вещества между двумя фазами - неподвижной и подвижной (элюент).

Неподвижная фаза главным образом представляет собой сорбент с развитой поверхностью, а подвижная - поток газа или жидкости. Поток подвижной фазы фильтруется через слой сорбента или перемещается вдоль слоя сорбента.

Принцип хроматографии, основан на способности пигментов (или любых других окрашенных и неокрашенных веществ) специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонке. В результате происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие элюенты, которые ослабляют силы адсорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества. Последние последовательно собирают в коллекторе фракций [2,c.48].

В зависимости от агрегатного состояния подвижной фазы различают газовую, флюидную (или сверхкритичную хроматографию с флюидом в качестве элюента) и жидкостную хроматографию. В качестве неподвижной фазы используют твердые (или твердообразные) тела и жидкости. В соответствии с агрегатным состоянием подвижной и неподвижной фаз различают следующие виды хроматографии:

1) газо-твердофазную хроматографию, или газоадсорбционную хроматографию;

2) газо-жидкостную хроматографию (газо-жидко-твердофазную);

3) жидко-твердофазную хроматографию;

4) жидко-жидкофазную хроматографию;

5) флюидно-твердофазную хроматографию;

6) флюидно-жидко-твердофазную хроматографию

Строго говоря, газо-жидкостная хроматография пока не реализована, на практике используют только газо-жидко-твердо-фазную хроматографию. Жидко-жидкофазная хроматография реализована, однако преим. используют жидко-жидко-твердо-фазную хроматографию (неподвижной фазой служит твердый носитель с нанесенной на его пов-сть жидкостью; см. Жидкостная хроматография) [3, c.78].

По механизму разделения различают несколько видов хроматографических методов анализа.

1) Адсорбционная жидкостная хроматография основана на избирательной адсорбции (поглощении) отдельных компонентов анализируемой смеси в жидкой среде. Она обусловлена различной адсорбируемостью растворенных компонентов.

2) Адсорбционная газовая хроматография основана на использовании различия в адсорбируемости газов и паров. В зависимости от основного фактора, определяющего разделение, различают следующие виды газовой хроматографии: газо-жидкостную и газо-адсорбционную.

Эти виды хроматографии приобрели очень важное значение в тех областях промышленности, где требуется разделение сложных смесей газов и жидкостей.

3) Распределительная хроматография основана на использовании различия в распределении (сорбируемости) отдельных компонентов анализируемой смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами -- подвижным и неподвижным растворителями.

4) Тонкослойная хроматография представляет собой разновидность распределительной хроматографии, осуществляемой на пластинках, покрытых тонким слоем носителя (окись алюминия, кизельгур, силикагель и др.), который удерживает неподвижный растворитель.

5) Бумажная хроматография -разновидность распределительной хроматографии, в которой носителем для неподвижного растворителя являются полоски или листы фильтровальной бумаги, не содержащей минеральных примесей.

6) Ионообменная хроматография основана на использовании ионообменных процессов, протекающих между подвижными ионами адсорбента и ионами электролита, содержащимися в анализируемом растворе. По способам выполнения ионообменную хроматографию делят на фронтальную, вытеснительную и элюентную.

7) Осадочная хроматография основана на использовании химических реакций, сопровождающихся образованием малорастворимых веществ (осадков). Эти реакции протекают между отдельными компонентами анализируемого раствора со специальными реагентами, нанесенными на поверхность носителя.

8) Окислительно-восстановительная хроматография основана на использовании разных скоростей окислительно-восстановительных реакций между реагентом, находящимся в колонке, и ионами, содержащимися в анализируемом растворе. Разделение веществ определяется величинами соответствующих окислительно-восстановительных потенциалов взаимодействующих систем.

9) Адсорбционно-комплексообразовательная хроматография основана на использовании реакций комплексообразования, протекающих между комплексообразующими и хроматографируемыми компонентами. Разделение обусловлено различием констант нестойкости образуемых комплексных соединений [2, c.55].

По геометрии сорбционного слоя неподвижной фазы различают колоночную и плоскослойную хроматографию. К плоскослойной относятся тонкослойная хроматография и бумажная хроматография. В колоночной хроматографии обычно выделяют капиллярную хроматографию, в которой сорбент расположен на внутренних стенках колонки, а центр, часть колонки остается незаполненной сорбентом, т.е. открытой для потока элюента (хроматография на открытых капиллярных колонках).

В зависимости от способа ввода пробы и способа перемещения хроматографических зон по слою сорбента различают следующие варианты хроматографии:

· проявительный (или элюентный),

· фронтальный

· вытеснительный.

В наиболее часто используемом проявительном варианте анализируемую смесь периодически импульсно вводят в поток подвижной фазы; в колонке анализируемая смесь разделяется на отдельные компоненты, между которыми находятся зоны подвижной фазы.

Во фронтальном варианте хроматографии пробу, содержащую разделяемые вещества, непрерывно подают в колонку. Можно также подавать в колонку одновременно пробу и подвижную фазу. Во фронтальной хроматографии только первый, наименее сорбируемый компонент можно получить в чистом виде на выходе из колонки, вторая и последующая зоны содержат по два и более компонентов разделяемой смеси.

В вытеснительном варианте хроматографии в колонку после подачи разделяемой смеси вводят спец. в-во (т. наз. вытеснитель), к-рое сорбируется лучше любого из разделяемых компонентов. В вытеснительной хроматографии образуются примыкающие друг к другу зоны разделяемых в-в. Во фронтальном и вытеснительном вариантах хроматографии необходима регенерация колонки перед след. опытом.

Для проведения хроматографического разделения веществ или определения их физико-химических характеристик обычно используют специальные приборы - хроматографы. Основные узлы хроматографа - хроматографическая колонка, детектор, а также устройство для ввода пробы. Колонка, содержащая сорбент, выполняет функцию разделения анализируемой смеси на составные компоненты, а детектор - функцию их количественного определения. Детектор, расположенный на выходе из колонки, автоматически непрерывно определяет концентрацию разделяемых соед. в потоке подвижной фазы.

После ввода анализируемой смеси с потоком подвижной фазы в колонку зоны всех в-в расположены в начале хроматографические колонки. Под действием потока подвижной фазы компоненты смеси начинают перемещаться вдоль колонки с различными скоростями, величины которых обратно пропорциональны коэффициентам распределения К (или константам распределения) хроматографируемых компонентов. Хорошо сорбируемые вещества, значения констант распределения для которых велики, передвигаются вдоль слоя сорбента по колонке медленнее, чем плохо сорбируемые. Поэтому быстрее всех из колонки выходит компонент А, затем компонент Б и последним покидает колонку компонент В (КА<КБ<КВ). Сигнал детектора, величина которого пропорциональна концентрации определяемого вещества в потоке элюента, автоматически непрерывно записывается и регистрируется (напр., на диаграммной ленте). Полученная хроматограмма отражает расположение хроматографических зон на слое сорбента или в потоке подвижной фазы во времени [2 ,c.93].

Электрофоретический метод основан на процессах коагуляции металлополимерных частиц и структурообразования под действием электрического поля. При этом предусматривается приготовление высокодисперсного порошка металлополимера, суспензии на его основе с использованием неводных сред (ацетона, высших спиртов, предельных и ароматических углеводородов) с обеспечением ее устойчивости, наведение электрического заряда на частицах дисперсной фазы и формирование на электродах металлополимерного осадка с последующей его термообработкой. При электро-осаждении образование металлополимерных покрытий происходит в результате двух одновременно протекающих процессов - электрофоретического осаждения полимера и электролитического выделения металла из коллоидных растворов полимера в электролите. Регулируя с помощью поверхностно-активных веществ заряд частиц и изменяя условия электрохимического осаждения полимера и выделения металла, можно получать покрытия определенного состава [4].

Электрофоретический метод дает возможность получать покрытия, обладающие практически одинаковыми свойствами (определяемыми составом покрытий) на различных подложках.

Электрофоретический метод, основанный на транспорте заряженных частиц в электрическом поле, может быть применен во многих случаях для концентрирования примесей, но особенно целесообразен для агрегативных устойчивых коллоидных загрязнений, имеющих высокое значение электрокинетического потенциала, когда обработка воды другими способами (например, коагуляцией) не дает хороших результатов.

Электрофоретический метод нанесения уже давно с успехом применяется в электро- и радиотехнической промышленности для получения электроизоляционных, эмиссионных и антиэмиссионных покрытий.

Описанный электрофоретический метод был применен как метод контроля при электродиализном делении белковых гидролизатов желатина, казеина, жмыха поджелудочной железы на аминокислотные фракции (кислую, нейтральную и основную) и при получении индивидуальных аминокислот из этих фракций.

Электрофоретический метод контроля качества арсеназо III и его аналогов четко разделяет примеси моноазосоединений и бис-азосоединений, а также изомеров, вследствие различной их подвижности, и позволяет сравнивать чистоту различных образцов реагента. Электрофоретический метод получения покрытий может быть осуществлен и из неводных сред, например, осаждение металлополимеров из углеводородов.

Разработан удобный и быстрый электрофоретический метод количественного определения L-глутаминовой и L-aспaрагиновой кислот в гидролизатах белкового сырья.

Чувствительность электрофоретического метода наиболее эффективно можно продемонстрировать на примере его использования для разделения белков крови.

Применение электрофоретических методов позволяет наносить на поверхность электродов (как катодов, так и анодов) различные электрофоретические покрытия. Этот метод оказывается экономичнее электролиза и, кроме того, позволяет наносить покрытия сложного состава, а также проводить осаждение в неводных средах.

Существует много электрофоретических методов. Наиболее эффективным из них является зональный электрофорез. При зональном электрофорезе смесь исследуемых веществ помещают в виде узкого слоя (зоны) на твердую поддерживающую пористую среду. В течение некоторого времени вещества с - различной подвижностью разделяются на отдельные зоны и могут быть по отдельности извлечены или идентифицированы без извлечения.

Применение хроматографических и электрофоретических методов для разделения белков в последние двадцать лет оказало огромное влияние на развитие современной биохимии. Поскольку белки обладают различными биологически важными функциями (такими, как ферментативные, гормональные, регуляторные, иммунохимические и др.), хроматография и электрофорез с успехом применяются в исследовательских и клинических целях в самых различных областях биологии и медицины [1, c.126].

хроматографический электрофорез метод ион

2. Капиллярный электрофорез

Метод капиллярного электрофореза основан на разделении компонентов сложной смеси в кварцевом капилляре под действием приложенного электрического поля. Микрообъем анализируемого раствора (около 2 нл) вводят в капилляр, предварительно заполненный подходящим буфером - электролитом. После подачи к концам капилляра высокого напряжения (до 30 кВ), компоненты смеси начинают двигаться по капилляру с разной скоростью, зависящей в первую очередь от заряда и массы (точнее - величины ионного радиуса) и, соответственно, в разное время достигают зоны детектирования. Полученная при детектировании последовательность пиков называется электрофореграммой, при этом качественной характеристикой вещества является параметр удерживания (время миграции), а количественной (после построения градуировочной зависимости) - высота или площадь пика, пропорциональная концентрации вещества [1, c.15].

Основные закономерности электрофореза (как движения заряженных частиц в электрическом поле в среде электролита) были известны уже в конце 19 века. Но метод капиллярного электрофореза появился сравнительно недавно. Первые упоминания о нем относятся к середине семидесятых годов ХХ века. Затем в восьмидесятые годы были созданы и запущены в серийное производство первые приборы. В девяностые годы резко расширилось практическое использование этого метода в аналитических лабораториях мира.

Столь позднее появление метода капиллярного электрофореза связано с тем, что лишь спустя столетие технологии позволили изготавливать кварцевые капилляры очень малых и, главное, равномерных внутренних диаметров (на уровне десятков микрон), прозрачных в ультрафиолетовой области. Кроме того, к этому моменту был накоплен также значительный опыт по возможностям детектирования аналитических сигналов в потоке [4].

3. Практическое использование капиллярного электрофореза

К основным областям применения метода капиллярного электрофореза относятся:

* экологический и технологический контроль водных объектов (катионный и анионный состав, пестициды и другие экотоксиканты);

* пищевая промышленность (определение консервантов и подсластителей, пищевых красителей и витаминов в напитках и соках; контроль качества бутилированных вод и напитков, оценка подлинности вин и виноматериалов; контроль за содержанием биогенных аминов (аминокислот, гистамина и др.);

* фармацевтика, биохимия и клиническая медицина (анализ лекарственных препаратов и биологических жидкостей);

* производственный контроль (анализ следовых количеств основного (сопутствующего) компонента на фоне матрицы);

* судебная экспертиза и криминалистика (анализ наркотических средств, следов взрывчатых веществ и т.д.);

* научные исследования.

Метод начинает проникать сегодня даже в те области, о которых еще вчера говорили, что они лежат вне зоны возможностей капиллярного электрофореза. Так, например, принципы неводного капиллярного электрофореза позволили снять ограничения по физико-химическим свойствам анализируемых веществ (должны быть 9 растворимы в воде или водно-органических смесях), а новые аппаратурные возможности привели к повышению чувствительности определения. Высокая разделяющая способность капиллярного электрофореза позволяет максимально упростить пробоподготовку. В подавляющем большинстве случаев подготовка пробы к анализу заключается в фильтровании образца через мембранный фильтр и дегазации пробы. По данным ГУП ЦИКВ (г. Санкт- Петербург), уже несколько лет работающего на приборе «Капель», при определении анионов в сточных водах и серийном выполнении анализов трудозатраты составляют не более 20 минут на пробу, включая все стадии, кроме пробоотбора. Это позволит за один рабочий день выполнять до 20 анализов по одной методике. В случае определения в течение одного дня и катионов и анионов необходимо менять кассеты с капилляром (для экономии времени подготовки поверхности капилляра к разделению). В качестве примеров электрофоретических разделений можно привести определение катионного и анионного состава водных объектов по методикам, изложенным в нормативных документах.

Таким образом, представленный метод капиллярного электрофореза является экспрессным высокоточным инструментальным методом и находит широкое применение в аналитической практике для целей разделения и количественного определения компонентов сложных смесей [4].

4. Детектирование заряженных ионов

В системах капиллярного электрофореза наиболее часто применяется фотометрическое детектирование, в котором используется одна ила несколько длин волн, обычно лежащих в ультрафиолетовой области спектра. Соответственно отклик детектора будет наблюдаться только в том случае, когда определяемый компонент имеет заметное поглощение на длине волны детектирования. Это - прямое детектирование. Электрофореграмма будет представлять собой набор положительных пиков, возвышающихся над базовой линией.

Однако, анионы, растворенные в воде, зарегистрировать таким простым способом не удается, т.к. они не обладают собственным поглощением в указанном спектральном диапазоне. В этом случае применяется косвенное детектирование, суть которого состоит в том, что ведущий электролит готовится с добавкой вещества, поглощающего свет на длине волны детектирования. В случае определения анионов добавка также должна быть анионом, например, это может быть хромат-ион. Вследствие того, что ионная сила ведущего электролита в процессе разделения остается постоянной, в зоне, где находится непоглощающий ион, эквивалентно уменьшается концентрация поглощающего иона. В этом случае на электрофореграмме будут наблюдаться обратные (отрицательные) пики, площади которых пропорциональны концентрациям определяемых ионов. В дальнейшем, при компьютерной обработке результатов измерений, график "переворачивается" и приобретает вид, удобный для рассмотрения, с положительно расположенными пиками [1, c.102].

Таким образом, вариант зонного капиллярного электрофореза с модификацией поверхности капилляра и непрямым детектированием позволяет анализировать компоненты, которые в условиях проведения анализа находятся в форме анионов.

Заключение

Хроматографический метод является исключительно мощным средством контроля загрязнения различных объектов окружающей среды, позволяющие анализировать сложные смеси компонентов. Наибольшее значение приобрели тонкослойная, газожидкостная и высокоэффективная жидкостная и ионная хроматография.

Будучи несложной по технике выполнения, тонкослойная хроматография хороша при определении пестицидов и других органических соединений-загрязнителей.

Газожидкостная хроматография эффективна при анализе многокомпонентных смесей летучих органических веществ. Применение различных детекторов, например малоизбирательного детектора по теплопроводности - катарометра и избирательных - пламенно-ионизационного, электронного захвата, атомно-эмиссионного, позволяет достигать высокой чувствительности при определении высокотоксичных соединений.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию применяют при анализе смесей многих загрязняющих веществ, прежде всего нелетучих.

Ионная хроматография удобна при анализе катионного и анионного составов вод.

Таким образом, методы хроматографии обладают большой аналитической емкостью. Простота, эффективность и универсальность хроматографического метода дала возможность широко использовать его в различных областях науки, промышленности, техники.

Использованная литература

1. Каменцев Я.С., Н.В. Комарова «Основы метода капиллярного электрофореза», Научно-производственная фирма аналитического приборостроения «Люмэкс», Санкт-Петербург, 2001, 198с.

2. Новикова Н.П. «Хроматографические методы анализа», Учебное пособие для студентов заочной формы, Темплан 2014, с.163с.

3. Шаповалова Е.Н., Пирогов А.В. «Хроматографические методы анализа» Методическое пособие для специального курса, Москва,2007, с.110.

4. Капиллярный электрофорез [Электронный ресурс]: режим доступа: www.chem.msu.su/rus/teaching/analyt/chrom/part3.pdf

Размещено на Allbest.ru