Размещено на http://www.allbest.ru

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ И.М. СЕЧЕНОВА

Кафедра Биотехнология

Направление подготовки: 240700 - Биотехнология

Факультет фармацевтический

Дисциплина Промышленная биотехнология

Реферат

«Биотехнологическое получение фермента «Пектиназа»

Студента 3 курса, группы 1001

Сабитовой Наили

.

Москва 2015

Введение

Пектолитические ферменты широко используются в различных областях. Процесс гидролиза пектиновых веществ имеет большое значение для переработки плодов, ягод и овощей. Использование пектолитических ферментов позволяет резко повысить сокоотделение (на 5-25 %) при производстве осветленных соков, особенно из тех плодов и ягод, которые не имеют собственных пектолитических ферментов и содержат повышенные количества пектина (слива, алыча, абрикосы, персики, груши и др.). При изготовлении фруктово-ягодных напитков с мякотью ферменты позволяют снять нежелательный желирующий эффект.

Наиболее важными источниками пектолитических ферментов являются микроскопические грибы, особенно различные виды рода Aspergillus: A. awamori, A. foetidus, A. niger, A. terreus и др. Среди бактерий найдены активные продуценты пектиназ, относящиеся к роду Clostridium; среди дрожжей культура Saccharomyces fragilis образует пектолитические ферменты.

Свойства пектолитических ферментов

Условно все пектолитические ферменты (пектиназы) можно разделить на пектолитические ферменты, гидролизующие пектиновые вещества с участием воды (гидролазы), и негидролитические ферменты, осуществляющие расщепление пектиновых веществ с образованием двойной связи в продуктах расщепления (лиазы -- пектинтрансэлиминазы).

К гидролазам относятся пектинэстераза (ПЭ) и полигалактуроназы (ПГ). пектолитический фермент пектиназа аэробный

Пектилгидролаза пектинов (КФ 3.1.1.11) представляет собой гидролазу эфиров карбоновых кислот. Микробная ПЭ имеет оптимальный рН от 4,5 до 5,5. Ионы Са и Mg активируют ПЭ. Фермент расщепляет сложноэфирные связи, причем только в том случае, когда в непосредственной близости к омыляемой связи находится СООН-группа (рис.1).

Рис. 1 Схема действия пектинэстеразы

Наибольшее сродство ПЭ проявляет к метильному остатку в 5-м положении (I), т. к. в положениях 4 и 6 имеются свободные СООН-группы. Омыление эфирной связи в положениях 3 и 7 происходит во вторую очередь (II). В результате действия ПЭ накапливаются частично или полностью деметоксилированная полигалактуроновая кислота и метанол.

Полигалактуроназа (ПГ), или полигалактуронидгликаногидролаза (КФ 3.2.1.15), осуществляет гидролитическое расщепление б -1,4-гликозидных связей в пектиновых веществах. ПГ является многокомпонентной системой и проявляет большую специфичность к субстрату. По субстратной специфичности ферментов различают следующие типы полигалактуроназ.

· Полиметилгалактуроназы (ПМГ) -- ферменты, действующие на метоксилированную полигалактуроновую кислоту (пектин); ПМГ представлены двумя типами: эндо-ПМГ-I и экзо-ПМГ-III.

· Эндо-ПМГ-I является разжижающим ферментом, гидролизующим нативный этерифицированный пектин тем быстрее и эффективнее, чем выше степень его этерификации. Присутствие ПЭ в растворе снижает активность эндо-ПМГ-I. Этот тип фермента широко распространен среди грибов (A. niger, Botrytis cinerea, Neurospora crassa, A. awamori и др.).

· Экзо-ПМГ-III является осахаривающим ферментом концевого действия, отщепляющим по одному остатку галактуроновой кислоты от пектиновой кислоты или пектина. Фермент проявляет сродство к метоксилированному остатку элементарного звена, гидролизуя концевую б-1,4-связь между двумя остатками галактуроновых кислот, имеющих СООСН₃-группы.

· Полигалактуроназы (ПГ) -- ферменты, действующие на пектовую или пектиновую кислоту; они также разделены на два типа: эндо-ПГ-II и экзо-ПГ-IV.

· Эндо-ПГ-II -- разжижающая ПГ, которая гидролизует пектиновую или пектовую кислоту. Она действует только при наличии в звеньях свободных СООН-групп. Активность эндо-ПГ-II значительно возрастает в присутствии ПЭ. Фермент синтезируется грибами и бактериями.

· Экзо-ПГ-IV проявляет сродство к концевой гликозидной связи, которая не примыкает к этерифицированному звену.

Пектинтрансэлиминазы осуществляют негидролитическое расщепление пектиновых веществ с образованием двойной связи в галактуроновом остатке между 4 и 5 углеродными атомами (рис.2).

Рис. 2 Схема действия пектинтрансэлиминаз

Пектинтрансэлиминазы действуют как на пектин, так и на пектовые кислоты. В номенклатуру ферментов вошли два фермента этой группы:

· экзополигалактуронатлиаза -- поли(1,4-б-D-галактуронид)экзолиаза (КФ 4.2.2.9) -- фермент элиминирует д-4,5-D-галактуронозо-D-галактуронатные остатки с редуцирующего конца деэтерифицированного пектина;

· пектинлиаза -- поли(метоксигалактуронид)лиаза (КФ 4.2.2.10) -- фермент деполимеризует пектин путем элиминирования остатков 6-метил-Д-4,5-D-галактуроната; не действует на деэтерифицированный пектин.

Таким образом, первый фермент проявляет сродство к неметоксилированным, а второй -- к метоксилированным звеньям.

Биотехнологическое производство Пектиназ

Получение препаратов пектинтрансэлиминаз. Продуцентами пекталиазных ферментов, проявляющих активность в щелочной среде, в основном являются некоторые виды бактерий родов Bacillus, Clostridium, Erwinia, Aeromonas и др. Многие из этих организмов являются фитопатогенными, вызывающими поражение растительной ткани, ее мацерацию. Большинство их являются строгими или факультативными анаэробами.

Получение комплексных препаратов. Clostridium pectinofermentas обладает способностью синтезировать ферменты, способные к гидролитическому (при рН = 4) и негидролитическому (при рН = 8) расщеплению б-1,4-связи, т. е. образующие ферменты полигалактуроназного и пектинтрансэлиминазного комплекса.

В промышленном масштабе пектолитические препараты получают в основном из A. foetidus и A. awamori при поверхностном и из A. awamori, A. niger, Zygofabospora marxiana и Cl. pectinofermentans при глубинном способах культивирования.

Условия культивирования. В качестве посевного материала можно использовать поверхностную культуру продуцента, споровый материал или молодую глубинную культуру. В нашей стране чаще всего используют заспоровавшуюся поверхностную культуру, либо ту же культуру, но активированную путем подращивания спор глубинным способом.

Суть обработки заключается в следующем. Поверхностная посевная культура выращивается в течение 7-9 сут до обильного спороношения на твердой питательной среде. Такая культура, содержащая (4-7) Ч 108 спор/1 г культуры, в течение 12 ч активируется в солевом растворе, содержащем ионы кобальта и марганца, и используется в количестве 0,2-0,3 % для засева производственной среды. Эта обработка позволяет на 10-20 % сократить время выращивания культуры и на 20-30 % повысить биосинтетическую активность продуцента по пектиназе.

Получение препаратов пектиназ из поверхностных культур

При поверхностном способе культивирования процесс проводят с введением до 60-70 % свекловичного жома, содержащего до 4-4,5 % водорастворимого пектина и 16-18 % протопектина. Остальную часть среды составляют пшеничные отруби. Обогащение среды азотом производят, добавляя около 1% (NH₄)₂SO₄ либо NH₄Cl или около 2 % (NH₄)₂HPO₄. Влажность среды должна быть в пределах 55-60 %, температура культивирования в течение первых 40 ч -- 30 °С с последующим понижением до 24 °С. Общая продолжительность культивирования -- 48-52 ч. Очищенные пектолитические препараты получают из водных экстрактов путем осаждения (табл.1) этанолом (73,5-75 об. %), изопропанолом (55-57 об. %) или высаливанием сульфатом аммония (в количестве 0,8 от полного насыщения). Пектиназы чувствительны к температуре, поэтому она не должна превышать 2-5 °С при максимальном контакте с растворителем.

Таблица 1

Характеристика пектолитических препаратов, полученных из культуры A.awamori 16

Получение препаратов из глубинных аэробных культур. Для получения пектолитических ферментов в составе среды необходимо присутствие тех или иных пектиновых веществ или продуктов их частичного гидролиза. Они могут быть введены в виде различных отваров пектинсодержащих растительных масс или же добавлены непосредственно в питательную среду. Источниками пектиновых веществ могут быть свекловичный жом, яблочные выжимки, выжимки плодов, винограда, различных овощей, стебли хлопчатника и другие отходы переработки растительного сырья. Лучшие результаты при культивировании Aspergillus niger Ch485211 получены при использовании порошка кожуры цитрусовых [87]. Кроме пектиновых веществ желательно наличие небольшого количества легкометаболизируемых углеводов, вносимых, например, с солодовыми ростками или гидролизатами пектиновых веществ.

В качестве источников азота чаще всего вводят (NH₄)₂SO₄ и (NH₄)₂HPO₄ в количестве 0,2 % по азоту, при этом имеются отличия в потребности к источнику азота у разных продуцентов (табл.2).

Таблица 2

Влияние природы азотсодержащих солей на биосинтез ферментов культурами A. niger и A. awamori

Повышенное содержание в среде фосфора (от 0,2 до 0,4 %) в виде (NH₄)₂HPO₄ или KH₂PO₄ способствует возрастанию количества пектолитических ферментов. Если в составе среды есть природные источники минеральных солей (свекловичный жом, выжимки плодов и овощей и т. д.), то такие среды содержат практически все необходимые микроэлементы. Некоторый недостаток испытывают микроорганизмы в ионах марганца, магния и особенно кобальта, внесение которых повышает биосинтетическую способность грибных продуцентов. Для многих продуцентов необходимо наличие биотина, тиамина, никотинамида, способствующих увеличению выхода пектиназ на 40-50 %.

Технологическая схема получения очищенных ферментных препаратов

Схемы получения ферментных препаратов зависят от свойств выделяемого фермента и методов очистки, примененных для получения препарата нужной степени чистоты. В качестве примера рассмотрим технологическую схему получения препаратов из поверхностной и глубинной культур в виде жидких концентратов, сухих технических препаратов, получаемых сушкой распылением, и препаратов, осажденных органическими растворителями (рис. 3,4).

Фильтрат охлажденной культуральной жидкости собирается в основном сборнике и по мере надобности передается в сборник небольшой вместимости перед поступлением в подогреватель вакуум-выпарной установки пленочного типа. Концентрат культуральной жидкости с содержанием сухого вещества 6 - 10 % поступает в сборник концентрата. Для получения сухого технического препарата концентрат направляют в башню распылительной сушилки 8. Сухой препарат через циклон 10, бункер 11 и шнек 12 попадает на стадию стандартизации, фасования и упаковывания.

Рис. 4. Принципиальная технологическая схема получения очищенных препаратов из культур микроорганизмов, выращенных глубинным способом

1 - теплообменники; 2 - осадитель; 3 - дозаторы; 4 - сепаратор; 5 - насос для спирта; 6 - мерник для спирта; 7 - смеситель промывки осадка спиртом: 8 - центрифуга; 9 - вакуум-сушилка роторная; 10 - бункер для высушенного осадка; 11, 12 - бункера для наполнителей; 13 - бункер для сухого препарата; 14 - установки дисмембраторов; 15, 16 - весы; 17 - смесители непрерывного действия; 18 - бункера для стандартизированного препарата; 19 - установки для фасования и упаковывания препаратов;

Для получения более очищенного препарата концентрат из сборника подается на осаждение органическим растворителем. Предварительно концентрат охлаждают в теплообменнике до температуры 2 - 3 °С и подают через дозатор в осадитель. Одновременно в осадитель дозируется охлажденный растворитель. Образовавшийся осадок отделяют на сепараторе 4. Надосадочную жидкость направляют на регенерацию, а осадок - на промывку спиртом и повторное сепарирование. Промытый осадок высушивают в вакууме, измельчают, взвешивают, смешивают с наполнителем и направляют на фасование и упаковывание.

При получении ферментных препаратов из культур микроорганизмов, выращенных поверхностным способом, процесс очистки начинается с экстракции ферментов водой. Нерастворимый осадок высушивают и в виде сухого биошрота утилизируют на корм скоту.

Экстракт с содержанием сухого вещества 7 - 14 % при получении из него сухих препаратов не нуждается в дополнительном концентрировании и поэтому может быть сразу направлен на распылительную сушку с целью получения технического препарата, или же экстракт направляется в охладитель, а затем на осаждение органическими растворителями или солевыми растворами. Из экстракта можно получать стабильный жидкий концентрат с содержанием сухого вещества 50%, для чего экстракт направляют в сборник, затем в подогреватель и на вакуум-выпарную установку. Готовый жидкий концентрат фасуют в специальные емкости и направляют на склад готовой продукции. Из глубинной культуры можно также получать жидкие концентраты, например, методом ультрафильтрации.

Существуют многочисленные схемы получения ферментных препаратов различной степени очистки, вплоть до кристаллических и гомогенных препаратов. Такие схемы, созданные в различных странах мира, в большинстве своём очень сложны и сочетают в себе самые различные комбинации технологических приёмов. Поэтому давать какие-то общие рекомендации крайне трудно, и в каждом конкретном случае необходимо проводить кропотливые исследования на всех стадиях выделения фермента из данной культуры продуцента. Только в результате такой работы можно придти к практическим рекомендациям, которые будут справедливы только для данного фермента, данной культуры микроорганизма и для данной среды.

Получение неочищенных ферментных препаратов

Неочищенные ферментные препараты представляют собой культуру микроорганизма вместе с остатками питательной среды, высушенную при мягком режиме до влажности не более 8 - 12 %. Неочищенный ферментный препарат может быть получен на основе поверхностной или глубинной культуры. Глубинная культура может быть перед сушкой очищена от нерастворимой части (твердая взвесь среды и биомассы продуцента) или высушена вместе с ней.

Большинство продуцентов накапливает основную часть синтезируемых ими ферментов в питательной среде. При получении очищенных ферментных препаратов нерастворимую часть среды вместе с биомассой продуцента отделяют на фильтрах, центрифугах или сепараторах. На этой стадии стерильность процесса чаще всего нарушается.

Эффективность отделения биомассы во многом зависит не только от типов используемых аппаратов, но и от состава среды, размеров отделяемых частиц, количества нерастворимой фракции, физико-химических характеристик фильтрующих материалов, температурных режимов и т. д. Для улучшения процесса фильтрования проводят предварительную химическую обработку культуральной жидкости. Для этого культуральную жидкость подщелачивают до рН 8 - 8,5 и вводят 0,1 %-ный раствор хлористого кальция, в результате образуется гель фосфата кальция, который способствует наиболее полному отделению осадка при наименьших потерях. Но предварительная химическая обработка не всегда дает хорошие результаты, поэтому для повышения эффективности процесса часто используют различные кизельгуры, например, диатомит и радиолит (Япония), микрозил (Франция), диатомит (Бельгия), кларгель (Великобритания) и т. д. Использование этих наполнителей может резко повысить скорость фильтрования, но вместе с этим увеличиваются потери активности на этой технологической стадии.

Полученную биомассу продуцента вместе с нерастворимыми частицами среды (биошрот) при необходимости стерилизуют, высушивают и используют на корм животным. Фильтрат культуральной жидкости нестабилен, он не может храниться и должен немедленно направляться на дальнейшую обработку для получения очищенных ферментных препаратов.

Концентрирование ферментных растворов методом вакуум-выпаривания. Экстракты из поверхностных культур микроорганизмов и фильтраты глубинной культуры являются нестабильными при хранении. Для получения готовых форм технических препаратов (П2х и Г2х) их необходимо сконцентрировать. Чаще всего для этих целей в технологии ферментных препаратов используются методы вакуум-выпаривания. Вакуум-выпаривание также применяется как один из этапов получения сухих технических или очищенных ферментных препаратов. Ферменты очень чувствительны к температуре выпаривания, поэтому основным условием концентрирования ферментных растворов является кратковременное ведение процесса при низких температурах кипения, чтобы выпариваемая жидкость не перегрелась, а ферменты не инактивировались. Следует учитывать, что чем чище раствор, чем меньше он содержит сопутствующих веществ, тем ферменты более чувствительны к воздействию высоких температур. При концентрировании экстрактов из поверхностных культур инактивация ферментов значительно меньше, так как в экстракте содержится очень большое количество защитных соединений, которые препятствуют инактивации ферментов. При концентрировании фильтратов культуральной жидкости наблюдаются несколько большие потери, поэтому ферменты культуральной жидкости стабилизируют различными соединениями. В процессе концентрирования ферментных растворов происходят изменение растворимости многих соединений и выпадение их осадков, и суммарное содержание сухого вещества в концентрате снижается на 11 - 20 %, изменяется рН концентрата. В осадок выпадают минеральные соли, некоторые органические вещества и продукты их распада, наблюдается потеря азота в результате уноса аммиака.

При концентрировании культуральной жидкости В. mesentericus значительно изменяется минеральный состав концентрата. Наиболее резко снижается содержание кальция, меди и магния, заметно уменьшается содержание цинка и марганца. Такое изменение минерального состава культуральной жидкости сказывается на стабильности ферментов в процессе концентрирования. При сгущении культуральной жидкости до содержания сухого вещества 10 % количество кальция снижается всего на 5 %, а меди - на 75 %. Известно, например, что медь оказывает на ферменты ингибирующее действие, а кальций - стабилизирующее. Поэтому на первых стадиях концентрирования наблюдается повышение активности ферментов, особенно протеиназ. При более глубоком концентрировании вместе с резким снижением содержания кальция снижается активность ферментов.

Большинство ферментов очень чувствительно к термической обработке и нуждается в мягких режимах концентрирования. На рисунке были приведены данные по инактивации нейтральной протеиназы В. subtilis 103 в зависимости от температуры кипения раствора от 20 до 50 °С и температуры греющего пара от 90 до 120 °С. Из рисунка видно, что очень большое влияние оказывает температура теплоносителя. При низких температурах кипения (25 - 30 °С) происходит заметная инактивация ферментов (до 12 %), если температура греющего пара равна 120 °С. При температуре теплоносителя 90 - 100 °С и температуре кипения 35 - 40 °С потери активности не превышают 10 %. В зависимости от вида продуцента культуральная жидкость имеет различный химический состав и содержит различный комплекс ферментов, поэтому тепловые режимы вакуум-выпаривания уточняются экспериментальным путем.

Суммарные потери активности при вакуум-выпаривании в значительной степени зависят не только от режима концентрирования, но и от конструкции аппарата. Аппараты для стадии вакуум-выпаривания в последние годы значительно усовершенствованы, в десятки раз сокращена длительность процесса, что привело к значительному уменьшению потерь активности ферментов, а также позволило несколько ужесточить температурные режимы концентрирования ферментных растворов. Помимо трубчатых вакуум-выпарных установок с различным расположением трубой (горизонтальным, вертикальным и наклонным), со встроенной и выносной поверхностью нагрева, с использованием принудительной циркуляции созданы новые конструкции пленочных выпарных аппаратов, ультрацентробежных вакуум-выпарных установок и пластинчатых испарителей. Особый интерес представляют ротационные пленочные выпарные аппараты, где упариваемая жидкость в виде пленки движется по внутренней стенке аппарата. Лопатки, смонтированные на вращающемся роторе, непрерывно направляют движение ее сверху вниз. Время прохождения жидкости через аппарат составляет несколько секунд. В настоящее время фирма «Альфа-Лаваль» изготовляет вакуум-выпарные центробежные аппараты типа «Центритерм». Они очень компактны, время контакта ферментного раствора с обогревающей поверхностью предельно сокращено (не более 1 с), потери не превышают 10 %, производительность этих установок от 800 до 4800 л/ч.

Создана центробежная вакуум-выпарная установка пленочного типа производительностью 800 л/ч по испаренной влаге. Время контакта культуральной жидкости с теплоносителем не более 1 с, температура греющего пара 60 - 80 °С. Для увеличения производительности можно монтировать установку из трех модулей, каждый из которых работает либо автономно, либо последовательно, либо первые два модуля работают параллельно и соединены с третьим модулем последовательно. Представляет интерес для ферментной промышленности центробежная пленочного типа вакуум-выпарная установка «Единство» (Югославия) производительностью до 200 л/ч и с температурой упаривания 30 - 40 °С. Хорошие технологические показатели имеют роторные выпарные аппараты фирмы «Люва» (Швейцария), имеющие производительность по испаренной влаге от 50 до 200 л/(м2·ч). Французская фирма APV изготовляет пластинчатые вакуум-выпарные установки производительностью до 20 000 л/ч.

Несмотря на наличие высокопроизводительных вакуум-выпарных аппаратов полностью устранить недостатки метода вакуум-выпаривания не удается (потери активности, выпадение осадков и т. д.), и этот метод все больше заменяется методом ультрафильтрации.

Применение

Пектиназы применяют в следующих областях пищевой промышленности: 1) виноделии; 2) производстве плодоягодных соков и безалкогольных напитков; 3) изделий из фруктов - желе, концентрированных соков, пюре, фруктовых и овощных консервов Ферменты используются на следующих основных стадиях переработки фруктов: 1. Обработка мезги: разрушение мякоти при выработке фруктовой кашицы или нектаров; увеличение выхода сока; лучшее отделение веществ, ответственных за цвет и вкус. 2. Обработка сока: уменьшение вязкости; облегчение изготовления концентратов; упрощение процедур осветления, фильтрования и стабилизации сока.; 4) ликеро-водочном производстве; 5) производстве кофе и кофейных концентратов; 6) получении пектина с низким содержанием метоксила. Наиболее широким и значительным по объему является использование в первых трех областях.

Пектиназы применяются для решения трех главных задач: 1) увеличения выхода готового продукта; 2) осветления растворов; 3) ускорения их фильтрования. Следует сказать, что производство соков и их потребление имеют очень большой масштаб в большинстве развитых стран ввиду их особой витаминной, пищевой и вкусовой ценности. Соки получают из винограда, яблок, слив, алычи, абрикосов, малины, вишни, черной и красной смородины, земляники, шиповника, хурмы и других ягод и плодов.

Литература:

http://olmix-east.ru/производство-и-промышленное-использ/

http://www.abercade.ru/research/analysis/5724.html

Г.А. Гореликова ОСНОВЫ СОВРЕМЕННОЙ ПИЩЕВОЙ БИОТЕХНОЛОГИИ Учебное пособие Кемерово 2004

http://chemanalytica.com/book/novyy_spravochnik_khimika_i_tekhnologa/06_syre_i_produkty_promyshlennosti_organicheskikh_i_neorganicheskikh_veshchestv_chast_II/5427

http://biofile.ru/bio/19231.html

Размещено на Allbest.ru