Характеристика основных микроскопических методов исследования

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Микроскопия - общее название методов получения сильно увеличенных изображений объектов, не различимых глазом человека. По признаку физической природы сигнала, с помощью которого осуществляют визуализацию малых объектов, различают оптическую, электронную, рентгеновскую, ионную и акустическую микроскопию. Наименьшее расстояние между двумя точками, начиная с которого их изображение сливаются, называют пределом разрешения (линейным или угловым). В табл. 1 приведены пределы разрешения приборов, реализующих разные типы микроскопии.

1. Оптическая микроскопия

В оптическом микроскопе реализовано свойство линзы или системы из двух линз давать увеличенные изображения предметов. Методы световой микроскопии (освещения и наблюдения).Световая микроскопия обеспечивает увеличение до 2-3 тысяч раз, цветное и подвижное изображение живого объекта, возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма.

Простой однолинзовый микроскоп (лупа с сильным увеличением) был известен в середине 15 в. Голландский ученый А. Левенгук (A. Leeuwenhoek) довел (1670-е годы) увеличение простого микроскопа до 300 крат и с его помощью открыл мир микроорганизмов. Изобретение более сложного микроскопа, состоящего из двух собирающих линз (1600 г.), связывают с именем голландца Г. Янсена (H. Janssen), а микроскопа, состоящего из собирательного объектива и рассеивающего окуляра (1610 г.) - Г. Галилея (G. Galilei). Разработка (1873 г.) немецким физиком Э. Аббе (E. Abbe) дифракционной теории образования изображений несамосветящихся объектов способствовала развитию микроскопических исследований.

Современные оптические микроскопы предназначены для рассматривания, изучения и измерения микроструктуры клеток, бактерий, срезов тканей, микрокристаллов, волокон, минералов, микросхем и других объектов, размеры которых (менее 0,1 мм) не позволяют наблюдать их невооруженным глазом. Микроскоп дает возможность различать структуры с расстоянием между элементами до 0,2 мкм. Обычно микроскоп имеет двухступенчатую систему увеличения, образованную объективом и окуляром, которая обеспечивает увеличение до 1500 крат. В оптическую схему микроскопа входит также узел освещения объекта.

Принцип действия микроскопа поясняет рис. 1, на котором представлена схема типичного микроскопа проходящего света. Объект 1 расположен на предметном столике 2 и освещен светом от лампы 3 и линзы-коллектора 4 (осветитель), направляемым на объект с помощью зеркала 5 и конденсора 6. Полевая 7 (ограничивающая распространение света от лампы) и апертурная 8 диафрагмы (апертура - действующее отверстие оптического прибора, определяемое параметрами диафрагмы) служат для ограничения светового пучка и уменьшения рассеянного света. Изображение объекта увеличивается с помощью объектива 9 и окуляра 10. Объектив создает действительное перевернутое и увеличенное изображение 1 объекта. Окуляр образует вторично увеличенное мнимое изображение 2 объекта обычно на расстоянии D = 250 мм от глаза наблюдателя - так называемом расстоянии наилучшего видения. Окуляр можно сдвинуть так, чтобы изображение 1 оказалось в фокальной плоскости - перед передним фокусом Fок окуляра. Тогда действительное изображение, даваемое окуляром, можно воспроизвести на экране или фотопленке. Способ получения такого изображения называют микропроекцией.

Рис. 1. Принципиальная оптическая схема микроскопа

Основные характеристики микроскопа - увеличение, разрешающая способность и светосила.

Увеличение объектива:

,

где - расстояние между задним фокусом объектива (на рисунке не показан) и передним фокусом Fок окуляра (оптическая длина тубуса микроскопа), fоб - фокусное расстояние объектива. Увеличение окуляра Гок = 250/fок, где fок - фокусное расстояние окуляра. Общее увеличение оптического микроскопа .

Увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра. У типичных исследовательских микроскопов увеличение окуляра равно 10, а увеличение объективов - 10, 45 и 100. Соответственно, увеличение такого микроскопа составляет от 100 до 1000. Некоторые из микроскопов имеют увеличение до 2000. Еще более высокое увеличение не имеет смысла, так как при этом разрешающая способность не улучшается. Напротив, качество изображения ухудшается.

Разрешающая способность - величина, обратная предельному разрешению - наименьшему расстоянию, на котором два соседних элемента объекта могут быть видимы раздельно. Разрешающая способность оптического микроскопа ограничена дифракцией света. Для повышения разрешающей способности зазор между объектом 1 и объективом 9 заполняют жидкостью с большим показателем преломления - иммерсионной жидкостью. В качестве последней применяют воду (показатель преломления n = 1,33), водный раствор глицерина (n = 1,44), минеральное масло (n = 1,52), йодистый метилен (n = 1,74). Оптическая характеристика объектива - числовая апертура , где - угол между крайними лучами конического пучка света, выходящего из точки объекта и попадающего в объектив (апертурный угол). Для несамосветящихся объектов предельное разрешение:

,

где - длина волны света, - числовая апертура конденсора 6.

Разрешающая способность - это минимальное расстояние, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно. Разрешение человеческого глаза в режиме наилучшего видения равно 0.2 мм.

Контраст изображения - это различие яркостей изображения и фона. Если это различие составляет менее 3 - 4 %, то его невозможно уловить ни глазом, ни фотопластинкой; тогда изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали. На контраст влияют как свойства объекта, которые изменяют световой поток по сравнению с фоном, так и способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча.

Светосила - отношение освещенности изображения, создаваемого оптической системой, к яркости изображаемого объекта. Без учета потерь световой энергии на поглощение и отражение в оптической системе так называемая геометрическая светосила равна С=(D/f)2, где D - диаметр входного зрачка в полевой диафрагме 7, f - фокусное расстояние микроскопа. Светосила пропорциональна квадрату синуса апертурного угла объектива оптической системы.

Числовая апертура используется для выражения разрешающей способности оптической системы или светосилы объектива.

Светосила объектива - интенсивность света, приходящаяся на единицу площади изображения, приблизительно равна квадрату NA. Величина NA составляет примерно 0,95 для хорошего объектива. Микроскоп обычно рассчитывают таким образом, чтобы его полное увеличение составляло около 1000 NA. Если между объективом и образцом ввести жидкость (масло или, что бывает реже, дистиллированную воду), то получится «иммерсионный» объектив с величиной NA, достигающей 1,4, и с соответствующим улучшением разрешения.

Возможности светового микроскопа ограничены волновой природой света. Физические свойства света - цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плотность и направление распространения волны изменяются в зависимости от свойств объекта. Эти различия и используются в современных микроскопах для создания контраста.

Рис. 2. Бинокулярный стереомикроскоп

Методы микроскопии различают по параметрам световых волн, взаимодействующих с объектом исследования. Методы микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов, так как последние, как отмечалось выше, влияют на контрастность изображения.

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при изучении прозрачных препаратов с включенными в них абсорбирующими (поглощающими свет) частицами и деталями. Это могут быть, например, тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и т. д. В отсутствие препарата пучок света из конденсора, проходя через объектив, даёт вблизи фокальной плоскости окуляра равномерно освещенное поле. При наличии в препарате абсорбирующего элемента происходит частичное поглощение и частичное рассеивание падающего на него света, что и обусловливает появление изображения. Возможно применение метода и при наблюдении неабсорбирующих объектов, но лишь в том случае, если они рассеивают освещающий пучок настолько сильно, что значительная часть его не попадает в объектив. Непрозрачные элементы, содержащиеся в объекте, поглощают и частично рассеивают подающий на них свет, что обусловливает возникновение изображения.

Метод косого освещения - разновидность предыдущего метода. Отличие между ними состоит в том, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. Иногда это помогает выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.

Метод светлого поля в отраженном свете используют для наблюдения непрозрачных объектов, например, шлифов металлов. Освещение объекта осуществляют пучком света, отраженным от полупрозрачного зеркала, которое установлено над объективом. Свет проходит через объектив, служащий одновременно конденсором, попадает на объект, отражается от него и возвращается, снова проходя через объектив и зеркало, в тубусную линзу. Структура объекта видна из-за различия в отражающей способности его элементов: на светлом фоне выделяются неоднородности, рассеивающие свет.

Метод тёмного поля в проходящем свете ( Dark-field microscopy) используется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, которые не могут быть видны, если применить метод светлого поля. Зачастую это биологические объекты. Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции -- т. н. конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса). Изображение в микроскопе формируется при помощи лишь небольшой части лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив.

Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля (Tyndall effect), известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. Используя этот метод, нельзя определить по виду изображения, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.

Предметные стекла должны быть не толще 1,1-1,2 мм, покровные 0,17 мм, без царапин и загрязнений. При приготовлении препарата следует избегать наличия пузырьков и крупных частиц (эти дефекты будут видны ярко святящимися и не позволят наблюдать препарат). Для темнопольной применяют более мощные осветители и максимальный накал лампы.

В основе метода ультрамикроскопии лежит тот же принцип - препараты в ультрамикроскопах освещаются перпендикулярно направлению наблюдения. При этом методе можно обнаружить (но не «наблюдать» в буквальном смысле слова) чрезвычайно мелкие частицы, размеры которых лежат далеко за пределами разрешающей способности наиболее сильных микроскопов. При помощи иммерсионных ультрамикроскопов удаётся зарегистрировать присутствие в препарате частиц сЧчастиц размером до 2Ч10 в -9 степени м. Но форму и точные размеры таких помощью этого метода определить невозможно. Их изображения представляются наблюдателю в виде дифракционных пятен, размеры которых зависят не от размеров и формы самих частиц, а от апертуры объектива и увеличения микроскопа. Так как подобные частицы рассеивают очень мало света, то для их освещения требуются чрезвычайно сильные источники света, например угольная электрическая дуга. Ультрамикроскопы применяются в основном в коллоидной химии.

Ультрамикроскоп создали (1903 г.) немецкий физик Г. Зидентопф (H. Siedentopt) и австрийский физико-химик Р. Зигмонди (R. Zsigmondy). В предложенной ими схеме щелевого ультрамикроскопа исследуемая система неподвижна. В поточном ультрамикроскопе, разработанным в 1940 - 1950-х годах советским физиками Б.В. Дерягиным и Г.Я. Власенко, изучаемые частицы движутся по трубке навстречу глазу наблюдателя. С помощью современного поточного ультрамикроскопа с лазерным источником света и оптико-электронной системой регистрации частиц определяют концентрацию частиц в аэрозолях в пределах от 1 до 109 частиц в 1 см3, а также находят функции распределения частиц по размерам.

Метод темного поля в отраженном свете применим для наблюдения непрозрачных объектов (шлифы металлов). Последние освещают сверху с помощью расположенной вокруг объектива специальной кольцевой оптической системы - эпиконденсора.

Метод наблюдения в поляризованном свете применяют для исследования анизотропных объектов - минералов, зерен в шлифах сплавов, живых тканей и клеток. В оптическую систему поляризационного микроскопа включены анализатор и компенсатор, с помощью которых регистрируют изменения поляризации света, прошедшего через объект.

Метод фазового контраста и его разновидность -- т. н. метод «аноптрального» контраста предназначены для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К таковым относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным.

Благодаря применению этого способа микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст) или светлыми на темном фоне (негативный фазовый контраст).

Фазово-контрастная микроскопия применяется также для изучения клеток культуры ткани, наблюдения действия различных вирусов на клетки и т. п. В этих случаях часто применяют биологические микроскопы с обратным расположением оптики - инвертированные микроскопы. У таких микроскопов объективы расположены снизу, а конденсор - сверху.

Поляризационная микроскопия - это метод наблюдения в поляризованном свете для микроскопического исследования препаратов, включающих оптически анизотропные элементы (или целиком состоящих из таких элементов). Таковыми являются многие минералы, зёрна в шлифах сплавов, некоторые животные и растительные ткани и пр. Оптические свойства анизотропных микрообъектов различны в различных направлениях и проявляются по-разному в зависимости от ориентации этих объектов относительно направления наблюдения и плоскости поляризации света, падающего на них. Наблюдение можно проводить как в проходящем, так и в отражённом свете. Свет, излучаемый осветителем, пропускают через поляризатор. Сообщенная ему при этом поляризация меняется при последующем прохождении света через препарат (или отражении от него). Эти изменения изучаются с помощью анализатора и различных оптических компенсаторов. Анализируя такие изменения, можно судить об основных оптических характеристиках анизотропных микрообъектов: силе двойного лучепреломления, количестве оптических осей и их ориентации, вращении плоскости поляризации, дихроизме.

Метод интерференционного контраста (интерференционная микроскопия) состоит в том, что каждый луч раздваивается, входя в микроскоп. Один из полученных лучей направляется сквозь наблюдаемую частицу, другой -- мимо неё по той же или дополнительной оптической ветви микроскопа. В окулярной части микроскопа оба луча вновь соединяются и интерферируют между собой. Один из лучей, проходя через объект, запаздывает по фазе (приобретает разность хода по сравнению со вторым лучом). Величина этого запаздывания измеряется компенсатором. Можно сказать, что метод интерференционного контраста сходен с методом фазового контраста -- они оба основаны на интерференции лучей, прошедших через микрочастицу и миновавших её. Как и фазово-контрастная микроскопия, этот метод дает возможность наблюдать прозрачные и бесцветные объекты, но их изображения могут быть и разноцветными (интерференционные цвета). Оба метода пригодны для изучения живых тканей и клеток и применяются во многих случаях именно с этой целью. Главное отличие интерференционной микроскопии от метода фазового контраста - это возможность измерять разности хода, вносимые микрообъектами. Метод интерференционного контраста часто применяют совместно с другими методами микроскопии, в частности с наблюдением в поляризованном свете. Его применение в сочетании с микроскопией в ультрафиолетовых лучах позволяет, к примеру, определить содержание нуклеиновых кислот в общей сухой массе объекта. К интерференционной микроскопии относятся также методы использования микроинтерферометров.

Метод исследования в свете люминесценции (люминесцентная микроскопия, или флуоресцентная микроскопия) состоит в наблюдении под микроскопом зелено-оранжевого свечения микрообъектов, которое возникает при их освещении сине-фиолетовым светом или не видимыми глазом ультрафиолетовыми лучами. В оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Один из них помещают перед конденсором. Он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй светофильтр, который установлен после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен -- возбуждение свечения препарата не является простым отражением света). Его часто используют совместно с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Такое многообразие применений объясняется очень высокой цветовой чувствительностью глаза и высокой контрастностью изображения самосветящегося объекта на тёмном нелюминесцирующем фоне. Кроме того, информация о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения, имеет огромную ценность.

Метод наблюдения в УФ-свете позволяет увеличить предельную разрешающую способность микроскопа, пропорциональную 1/л. Частицы многих веществ, прозрачные в видимом свете, сильно поглощают УФ-излучение и легко различимы на УФ изображениях. Последние регистрируют фотографированием, с помощью люминесцирующего экрана или электронно-оптического преобразователя - вакуумного фотоэлектронного прибора для преобразования невидимого глазом изображения объекта (в ИК-, УФ- и рентгеновских лучах) в видимое. Принцип его действия состоит в преобразовании невидимого изображения в электронное с помощью фотокатода, эмитирующего электроны. Электронное изображение преобразуется в видимое на катодолюминесцентном экране.

Метод наблюдения в ИК-лучах позволяет изучать структуру непрозрачных объектов - темных стекол, кристаллов, минералов. Он тоже требует преобразования невидимого изображения объекта в видимое путем фотографирования или с помощью электронно-оптического преобразователя.

Микропроекция - способ получения на экране или на фоточувствительном слое изображения, полученного с помощью микроскопа. Линейное оптическое увеличение при микропроекции равно:

,

где воб и Гок - номинальные значения увеличения объектива и окуляра микроскопа, fок - фокусное расстояние окуляра, К - расстояние от окуляра до экрана.

Лазерный микропроектор (лазерный проекционный микроскоп) - проекционный микроскоп, в котором для увеличения яркости изображения применяют усилитель яркости, действующий на основе стимулированного излучения. Последнее обладает всеми свойствами вынуждающего излучения, поэтому усилитель яркости можно ставить в любое место оптической системы и кардинально решать проблему проекции изображений с большим увеличением, избегая перегрева объекта.

Для визуального наблюдения микроструктуры металлов, сплавов и других непрозрачных объектов в отраженном свете при прямом освещении в светлом и темном поле, а также для исследования объектов в поляризованном свете методом дифференциально-интерференционного контраста (ДИК). предназначен Микроскоп металлографический МЕТАМ РВ-21 агрегатный с верхним расположением столика.

Микроскоп применяется в металлографических лабораториях научно-исследовательских институтов и предприятий металлургической, микроэлектронной, машиностроительной промышленности, а также в учебных заведениях. Возможно применение в других областях науки и техники. Шкалы и сетки, входящие в комплект микроскопа, обеспечивают возможность количественной оценки микроструктуры объекта по балльным шкалам.

Инвертированный микроскоп МЕТАМ РВ-21 с верхним расположением столика базируется на одном унифицированном штативе с агрегатно-модульными узлами. Источник света - лампа накаливания РН8-20-1. Различные варианты комплектации агрегатных узлов обеспечивают потребителю возможность выбора модели микроскопа в зависимости от специфики работы.

На микроскопе МЕТАМ РВ 21 можно фотографировать изображения объектов с помощью фотонасадки (в комплект не входит). Микроскоп металлографический изготавливается для работы в условиях УХЛ 4.2* по ГОСТ 15150 - 69, т.е. для работы в макроклиматических районах с умеренным климатом в лабораторных помещениях при температуре воздуха от 15 до 35° С.

Флюоресцентный наноскоп (греч. мйксьт -- маленький и греч. укпрЭщ -- смотрю) -- специализированный световой (оптический) микроскоп, предназначенный для изучения свойств органических или неорганических веществ с использованием явления флюоресценции с возможностью флюоресцентного исследования только в отражённом или проходящем освещении. Это лабораторная оптическая система для получения увеличенных изображений малых объектов с разрешающей способностью 1-10нм, с использованием различного характера свечения малых структурных элементов объекта под действием возбуждающего лазерного облучения. Микроскоп используется, например, для исследования живых клеток, с выдачей оцифрованных цветных 3D стереизображений на экран монитора.

В основе наноскопии лежит новый метод, впервые сформулированный защищённый авторским свидетельсвом по изобретениям российским физиком Андреем Климовым, позволяющий увеличить разрешение оптических микроскопов на два и выше порядков. Однако, патент, который оспаривается, принадлежит разработчикам и создателям флюоресцентного наноскопа Штефану Хеллу (Stefan Hell) из Института биофизической химии (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry (Karl Friedrich Bonhoeffer Institute)) -- 2006 год. Большинство микроскопов флюоресценции основаны на использовании возбуждения и наблюдение флюоресценции - сверху . Эти микроскопы стали важной частью в области биологии, открывая двери для более передовых направлений микроскопии, типа софокусного лазерного микроскопа просмотра и микроскопа полного внутреннего флюоресцентного отражения. Это микроскопия, объединяющаяся локализации с пространственно смодулированным опорным освещением с использованим стандартных красок флюоресценции и получение оптического изображения за счёт разделения возбуждающего лазерного опорного освещения и фильтрации более слабых образуемых видимых электромагнитных лучей на атомно-молекулярном уровне.

Принцип работы флюоресцентного микроскопа в разрезе (старого образца). светосила оптический микроскоп флюоресцентный

эПроцесс поглощения энергии фотонов органическими и неорганическими веществами с последующим испусканием лучей с другой длиной электромагнитной волны в природе известен как физическое явление под названием флюоресценция или свечение. Электронная эмиссия света в данном процессе флюоресценции по времени является одновременной с началом поглощения-возбуждения. При этом испущенные лучи имеют большую длину волны нежели поглощённые (испущенные фотоны имеют меньшую энергию чем поглощенные). В случае, когда время между поглощением и испусканием составляет более микросекунды, процесс называется фосфоресценцией.

Впервые это явление было открыто англичанином Джорджем Топитом в 1852 году. Он заметил, что минеральный флюорит начинал светиться красным светом, после освещения его ультрафиолетовыми лучами света. Исследования, проведенные в ХIX столетии определили, что много веществ: кристаллы, смолы, сырые наркотики, масло, хлорофилл, витамины, неорганические вещества, полезные ископаемые и др. флюоресцируют при освещении их лучами ультрафиолетового света. Лишь с 1930 годов началось использование явления флюоресценции, которое стали применять в биологических исследованиях. Исследуемые элементы материалов, бактерии, болезнетворные микроорганизмы для выявления их в среде обитания стали красить флюорокрасителями. Некоторые красители использовались в микроскопии и были впоследствии главным двигателем в создании метода флюоресцентной микроскопии с разрешением на нанометрическом уровне (1-10 нм), откуда пошло Флюоресцентная наноскопия.

Применение светящегося множества флюоромолекул, атомов дало возможность распознать микрочастицы и отдельные клеточные элементы вплоть до одного элемента -- молекулы. Несмотря на то, что данный метод не способен передать пространственное изображение всего элемента ниже его предела дифракции, однако метод флюоресцентной наноскопии способен выдать на экран или рассматривать в оптических окулярах микроскопа изображения отдельных молекул в 3D измерении, расположенных в зоне и ниже дифракционного предела. Применение окраски флюорокрасителями молекул, возбуждаемые вместе с самими молекулами, например, ультрафиолетовыми лучами света, вызывает эффект возбуждения молекулы, которая испускают трансформированные кванты энергии излучения, достаточные для получения изображений микроэлементов определённой и нужной яркости. Заранее можно планировать выделение нужных молекул за счёт окраски их флюорокрасителями, которые выделяют их при микроскопии.

Основная задача флюоронаноскопа состоит в том, чтобы осветить исследуемый объект с должным и определенным диапазоном длин волн, после чего отделить более слабую испускаемую флюоресценцию (спектр видимых лучей) от света возбуждения. В нормально формируемом флюоромикроскопе, именно эмиссионные лучи окрашенных молекул должны попадать в поле зрения глаз или фотодатчика. Важно, чтобы возбуждённые флуоресцентные краски при свечении добавили светимость окрашенных частиц, чтобы они отличались высокой яркостью, контрастностью на тёмном (или чёрном) фоне. Светящиеся микроэлементы за счёт отфильтрованных лучей видимого спектра света становятся видимыми при помощи создания низкой яркости (темноты) фона. Свет возбуждения - как правило в несколько сотен тысяч до миллиона раз более яркий, чем свет, испускаемый флюоресценцией (спектр видимых лучей).

Современный флюоронаноскоп рассчитан на применении исследования эпитаксиального слоя методом передачи изображения, созданного и отражённого при флюромикроскопии. Основой конструкции данного микроскопа является возможность применения вертикального потока лучей в диапазоне длин волн ультрафиолетовых, синих или зелёных лучей видимого спектра света, который образуется, передаётся многоспектральными источниками света, например, лампой дуги или другими источником с длиной волны, отфильтрованный фильтром лучей возбуждения. Данный поток лучей, отражаясь от фильтра -- дихроического зеркала или светоделителя, проходит через исследуемый образец (цель), обильно его освещая. При отражении и возврате лучей света эмиссии (возбуждения) он проходит через двуцветное зеркало, фильтруется фильтром, который блокирует нежелательные длины волн возбуждения. В данном случае флюоресценция -- единственный способ в оптической микроскопии, когда исследуемый образец вслед за возбуждением начинает светиться своим собственным светом. Излучаемый им свет повторно исходит сферически во всех указанных направлениях и не зависит уже от действия источника лучей света возбуждения.

В идеальных условиях работы флюоронаноскопа возможно увидеть, зафиксировать одиночные молекулы. Окрашенные, возбуждённые одиночные молекулы при эмисии возможно при низких величинах оптического фона и шума фотодатчика отфильтровать слабые видимые лучи, которые улавливаются фотодатчиком и фокусируются на темном фоне в фокальной плоскости, что позволяет их визуально рассматривать. Единственная молекула способна испустить 300000 фотонов до разрушения, фотоотбеливания, что достаточно для её фиксации.

Современный флюоресцентный наноскоп работает в сочетании эффективности оптического метода микроскопии с элементами компьютеризованного контроля систем микроcкопа и систем создания цифрового изображения АЦП, позволяющего шире использовать визуальное наблюдение изображений с оцифровкой, преобразованием их в стереоизображения в виде файлов с выходом на экраны монитора.

Усовершенствования и достижения оптической микроскопии в сочетании с флюоресцентной привели к возможности управлять подклеточными структурами или частицами благодаря и в силу использования широкого диапазона спектроскопических величин.

Способ флюоронаноскопии получения изображения доступен в габаритах традиционного лабораторного оптического микроскопа и отличается тем, что в разных участках объекта периодически создаются видимые раздельно флуоресцирующие молекулы и наночастицы. Лазер обеспечивает такое их возбуждение, которое достаточно не только для регистрации их неперекрывающихся изображений, но и для обесцвечивания уже зарегистрированных флуоресцирующих молекул. При этом десятки тысяч кадров с зарегистрированными изображениями одиночных молекул и наночастиц (в виде пятен диаметром порядка длины волны света флуоресцении, умноженной на увеличение микроскопа), обрабатываются на компьютере для поиска координат центров пятен и создания изображения объекта по миллионам вычисленных координат центров пятен, соответствующих координатам индивидуальных флуоресцирующих молекул и наночастиц.

Таким образом, флюоресцентная наноскопия:

1. Обеспечивается возможность получения двух- и трехмерного изображения 3D с разрешением 1-10 нм.

2. Имеется возможность регистрации цветного изображения при прокраске различными красителями белков, нуклеиновых кислот, липидов.

2. Электронная микроскопия

Наибольшего увеличения и разрешения на сегодняшний день можно добиться с помощью технологии трансмиссивной, или просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ) высокого разрешения. Она заключается в пропускании сфокусированного электронного пучка сквозь тонкий образец. Этим образцом может быть наноразмерный кристаллит неорганического вещества, углеродные нанотрубки, фуллерены и так далее. С помощью просвечивающего микроскопа и математического аппарата преобразования сигнала можно видеть отдельные атомы, образующие кристаллическую решетку просвечиваемого твердого тела, рассчитывать его параметры и так далее. Казалось бы, о чем еще можно мечтать физикам и химикам? И действительно, ТЭМ до сих остается пределом мечтаний для сотрудников многих отечественных учебно-научных учреждений: цена одного такого аппарата сравнима со стоимостью истребителя. Тем не менее и такой аппарат не всесилен, увидеть в нем даже при разрешении в доли нанометра можно далеко не каждый атом. Дело в том, что легкие атомы, такие как углерод, кислород, азот и уж тем более водород, обладающие небольшим количеством электронов, очень слабо рассеивают поток электронов. На фоне сигнала проводящей подложки, на которой лежит образец, и шума детектора сигнал этих атомов становится совершенно незаметным. Поэтому вплоть до последнего времени просвечивающая электронная микроскопия применялась в подавляющем большинстве случаев для исследования строения неорганических материалов, состоящих из тяжелых и богатых электронами атомов. Между тем азот, водород, кислород и углерод - это биогенные элементы, входящие в состав всех органических соединений, а потому представляют едва ли не больший интерес для ученых, нежели все неорганические материалы вместе взятые. Приспособить ТЭМ под исследование объектов органической природы позволил уже завоевавший славу углеродный материал графен. Тонкий углеродный лист графена атомарной толщины оказался прекрасной подложкой для соединений из легких атомов для изучения их на просвет электронным пучком. Открытие это было сделано во многом случайно. Янник Мейер, входящий в группу профессора Алекса Зеттля из Калифорнийского университета в Беркли, но работающий сейчас в Университете немецкого города Ульм, изучал сами графеновые листы, пытаясь подобрать параметры съемки и настроить соотношение «сигнал-шум» своего микроскопа наилучшим образом. В один прекрасный момент ему пришло в голову, что «шум», от которого никак не удается избавиться, есть не что иное, как легкие углеродные атомы на поверхности графена. Оказалось, что графен, обладая минимально возможной толщиной в сочетании с феноменальной электронной проводимостью, дает очень низкий уровень шума, а прочностные характеристики этого материала позволяют ему выдерживать бомбардировку электронным пучком в течение многих часов. Статья команды ученых вышла в свет в журнале Nature. Случайным ли образом в камере просвечивающего микроскопа Мейера оказались молекулы органических соединений, или они присутствуют там всегда и у всех, - сейчас сказать уже тяжело. Тем не менее Мейер, без сомнения, - первый, кто смог наблюдать динамику их движения по поверхности графена.

Какие перспективы открывает новая методика просвечивающей микроскопии, разработанная специалистами из Беркли? Главное, теперь становится возможным воочию наблюдать простые и сложные органические молекулы напрямую с помощью микроскопа, а не «щупать» их методами ядерного магнитного резонанса и рентгеновской дифракции.

Кроме того, по словам Зеттля, взаимодействие этих молекул на поверхности и с поверхностью отныне можно будет наблюдать в динамике. Если раньше ученым приходилось анализировать состав продуктов и промежуточных веществ в ходе реакции, а затем строить сложные кинетические модели цепных реакций для установления их механизма, то в перспективе они смогут ограничиться простым наблюдением за молекулами взаимодействующих веществ напрямую; благо, ТЭМ позволяет наблюдать, что называется, «живую» картинку. Конечно, такие радужные перспективы не могут пока исключить нескольких очень важных «но».

Во-первых, изучение структуры органических соединений, адсорбированных на поверхности, должно учитывать то обстоятельство, что конформация многих молекул в ходе такого адсорбционного взаимодействия может значительно измениться.

Во-вторых, если предметом изучения становится изучение взаимодействия органики с поверхностью твердого тела - задачи, очень важной в гетерогенном катализе, - графен не слишком-то и интересен, ибо со структурной и химической точки зрения он очень прост, чтобы не сказать примитивен. А синтезировать подложки толщиной в несколько атомов из более интересных соединений с каталитической или структурной точки зрения - задача во многих случаях просто неразрешимая. Наблюдение легких соединений с помощью ТЭМа таит в себе и ряд чисто технических сложностей. Однако, как показывает опыт развития науки техники последних лет, ученые наверняка найдут способ извернуться и в этом случае.

Электронный микроскоп - прибор, в котором для наблюдения и фотографирования многократно (до 106 раз) увеличенного изображения объекта вместо световых лучей используются пучки электронов, ускоренных до больших энергий (30-1000 кэВ) в условиях глубокого вакуума.

Рис. 3. Электронный микроскоп

Физические основы электронно-оптических приборов были заложены почти за сто лет до появления электронного микроскопа, в 1820-е годы ирландским математиком У. Гамильтоном (W. Gamilton).Он установил аналогию между прохождением световых лучей в оптически неоднородных средах и траекториями частиц в силовых полях. Технические предпосылки для разработки электронного микроскопа создал немецкий физик Х. Буш (H. Busch), исследовавший (1926 г.) фокусирующие свойства осесимметричных полей и разработавший магнитную электронную линзу. В 1928 г. немецкие физики М. Кнолль (M. Knoll) и Э. Руска (E. Ruska) приступили к созданию магнитного просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) и через три года получили изображение микрообъекта, сформированное пучками электронов. Первые растровые электронные микроскопы (РЭМ) были построены в Германии (1938 г.) М. фон Арденне (M. von Ardenne) и в США (1942 г.) В.К. Зворыкиным.

Изображение поверхности графена (красный цвет), полученное с помощью ТЭМ. Видны адсорбированые атомы водорода (фиолетовые пики) и единичный атомом углерода в центре площадки (одиночный желтый пик).

Рис. 4. Электронно-оптическая схема ПЭМ

РЭМ работают по принципу сканирования - управляемого (по определенному закону) пространственного перемещения пучка электронов (зонда) по объекту. Изображение последнего воссоздается по точкам в виде растра - совокупности однотипных элементов экрана, различным образом отражающих и поглощающих (или рассеивающих) излучение. К середине 1960-х годов РЭМ достигли высокого технического совершенства и с тех пор широко применяются в науке и технике. В 1980-х годах были разработаны модификации РЭМ - туннельный и атомно-силовой микроскопы, сыгравшие решающую роль в развитии нанотехнологии.

Принцип действия электронного микроскопа поясняет схема, представленная на рис. 4. В электронно-оптической колонне микроскопа с помощью вакуумной системы создают глубокий вакуум (давление до 10-5 Па). Электронный пучок - направленный поток ускоренных электронов, движущихся по близким траекториям в одном направлении и имеющий размеры, значительно большие в направлении движения, чем в поперечном сечении. Он формируется в электронной пушке - электронно-оптической системе, состоящей из термокатода 1 и фокусирующего цилиндра 2, а также в высоковольтном ускорителе 3. Затем пучок электронов дважды фокусируется конденсорами 4 и 5. Первый из них (короткофокусный) создает уменьшенное изображение источника электронов, второй (длиннофокусный) переносит его на объект 6. В результате на объекте создается электронное «пятно», диаметр которого при регулировке меняется от 1 до 20 мкм. После прохождения объекта часть электронов рассеивается и задерживается апертурной диафрагмой 7. Нерассеянные электроны проходят через отверстие диафрагмы и фокусируются объективом 8 в так называемой предметной плоскости электронной линзы 9, формируя первое увеличенное изображение объекта. Линзы 9 и 10 создают второе и третье изображения. Проекционная линза 11 формирует изображение на катодолюминесцентном экране 12, светящемся под воздействием электронов.

Параметры рассеяния электронов неодинаковы в точках объекта, отличающихся структурой и химическим составом. Соответственно изменяются число электронов, прошедших через диафрагму 7, и плотность тока в разных точках экрана 12. Снижение скорости электронов после просвечивания объекта (хроматическая аберрация) приводит к ухудшению разрешения, усиливается с увеличением толщины объекта и уменьшением ускоряющего напряжения.

Методы электронной микроскопии соответствуют объектам исследования, которыми чаще всего бывают твердые тела.

В ПЭМ электроны с энергиями от 1 кэВ до 5 МэВ проходят сквозь объекты, имеющие вид тонких пленок, фольги, срезов толщиной от 1 нм до 10 мкм, в том числе, пленок с нанесенными частицами (порошки, микрокристаллы, аэрозоли).

Структуру поверхностного слоя массивных образцов (толщина больше 1 мкм) изучают с помощью отражательных и зеркальных РЭМ. Для изучения поверхностей часто применяют метод реплик: с поверхности образца снимают копию-отпечаток в виде тонкой пленки углерода, коллодия (раствор пихтовой смолы) и др., которую рассматривают в ПЭМ вместо самого объекта. Метод декорирования состоит в том, что на поверхность образца напыляют тонкий слой декорирующих частиц (атомы тяжелого металла с большим коэффициентом поверхностной диффузии, молекулы полупроводников или диэлектриков). Они осаждаются преимущественно на участках сосредоточения микрополей. Затем снимают реплику с включениями декорирующих частиц. Ее рассмотрение с помощью электронного микроскопа позволяет зарегистрировать дислокации, скопления точечных дефектов, ступени роста кристаллических граней, доменную структуру.

Жидкие и влажные биологические объекты, неустойчивые к действию высокого вакуума, изучают с помощью так называемых газовых микрокамер - приставок к ПЭМ и РЭМ.

Совокупность специальных методов электронной микроскопии включает:

· амплитудный метод, предназначен для изучения рассеивающих электроны образцов диффузно аморфных тел, размеры частиц которых меньше предела разрешения микроскопа;

· фазовый метод, позволяет рассчитать контраст изображений образцов кристаллических тел и по нему - параметры их структуры, используя представления о волнах де Бройля и дифракции электронов на кристаллической решетке;

· интерференционный метод, разновидность фазового метода, аналогичен оптической интерферометрии;

· метод Лоренцевой микроскопии, создан для изучения явлений, обусловленных силой Лоренца, прежде всего, собственных электрических и магнитных полей твердых тел.

Новые методы электронной микроскопии реализуются с помощью оригинальных конструкциий микроскопов.

РЭМ с термоэмиссионной пушкой - самый распространенный тип приборов в электронной микроскопии. Линейное разрешение РЭМ зависит от электронной яркости пушки и составляет 1-5 нм. При помощи нескольких электронных линз на поверхность образца фокусируют узкий электронный зонд. Магнитные отклоняющие катушки обусловливают сканирование зонда по заданной площади на объекте. При взаимодействии зонда и объекта возникает несколько видов излучения (рис. 5). Любое из них, а также потоки электронов, прошедших сквозь объект и поглощенных им, или напряжение, наведенное на объекте, можно регистрировать и с помощью соответствующих детекторов преобразовывать в электрические сигналы. Последние после усиления подают на электронно-лучевую трубку и развертывают ее электронный пучок синхронно с разверткой электронного зонда в РЭМ, получая на экране трубки увеличенное изображение объекта.

Рис. 5. Схема регистрации информации в РЭМ. 1 - первичный пучок электронов; 2-7 - детекторы: 2 - вторичных электронов, 3 - рентгеновского излучения, 4 - отраженных электронов, 5 - оже-электронов, 6 - светового излучения, 7 - прошедших через объект электронов; 8-10 - системы регистрации: 8 - тока прошедших электронов, 9 - поглощенных в объективе электронов, 10 - наведенного на объекте электрического потенциала

Высокая разрешающая способность РЭМ реализуется при формировании изображения с помощью вторичных электронов. Величина этого сигнала зависит от топографии образца, наличия в нем локальных электрических и магнитных микрополей и величины вторичной электронной эмиссии, которая зависит от химического состава образца.

Контраст изображения, получаемого с помощью отраженных электронов, зависит от угла падения первичного пучка на плоскость объекта и от атомной природы его вещества.

Рентгеновское характеристическое излучение регистрируют кристаллическим или полупроводниковым спектрометрами, которые дополняют друг друга. С помощью РЭМ, оснащенного рентгеновскими спектрометрами, можно проводить локальный количественный химический анализ объекта.

Растровый оже-электронный микроскоп позволяет при сканировании электронного зонда детектировать оже-электроны из поверхностного слоя (0,1-2,0 нм) объекта. Прибор работает при сверхвысоком вакууме (10-7-10-8 Па). Для исследования глубинной структуры объекта он оснащен ионной пушкой, с помощью которой верхние слои объекта удаляют методом ионно-лучевого травления.

Эмиссионный электронный микроскоп создает изображение объекта электронами, которые эмитируются из него при нагревании, бомбардировке первичным пучком электронов, при воздействии электромагнитного излучения или сильного электрического поля. Этот микроскоп имеет узкое целевое назначение.

Зеркальный электронный микроскоп разработан для визуализации электростатических «потенциальных рельефов» и магнитных микрополей на поверхности объекта. Основным элементом прибора является электронное зеркало - электрическая или магнитная система, отражающая пучки электронов с целью изменения направления их движения и получения электронно-оптического изображения объекта «в отраженных лучах».

Первыми устройствами, с помощью которых стало возможным наблюдать за нанообъектами и передвигать их, стали сканирующие зондовые микроскопы - атомно-силовой микроскоп и работающий по аналогичному принципу сканирующий туннельный микроскоп. Создание атомно-силового микроскопа, способного чувствовать силы притяжения и отталкивания, возникающие между отдельными атомами, дало возможность, наконец, «пощупать и увидеть» нанообъекты.

Сканирующий зондовый микроскоп.

Рис. 6. Принцип работы сканирующего зондового микроскопа (Пунктиром показан ход луча лазера)

Основой АСМ (см. рис. 6) служит зонд, обычно сделанный из кремния и представляющий собой тонкую пластинку-консоль (ее называют кантилевером, от английского слова "cantilever" - консоль, балка). На конце кантилевера (длина 500 мкм, ширина 50 мкм, толщина 1 мкм) расположен очень острый шип (длина 10 мкм, радиус закругления от 1 до 10 нм), оканчивающийся группой из одного или нескольких атомов (см. рис. 7).

Рис. 7. Электронные микрофото одного и того же зонда, сделанные с большим увеличением

При перемещении микрозонда вдоль поверхности образца острие шипа приподнимается и опускается, очерчивая микрорельеф поверхности, подобно тому, как скользит по грампластинке патефонная игла. На выступающем конце кантилевера (над шипом, см. рис. 6) расположена зеркальная площадка, на которую падает и от которой отражается луч лазера. Когда шип опускается и поднимается на неровностях поверхности, отраженный луч отклоняется, и это отклонение регистрируется фотодетектором, а сила, с которой шип притягивается к близлежащим атомам - пьезодатчиком.

Данные фотодетектора и пьезодатчика используются в системе обратной связи, которая может обеспечивать, например, постоянную величину силу взаимодействия между микрозондом и поверхностью образца. В результате, можно строить объёмный рельеф поверхности образца в режиме реального времени. Разрешающая способность АСМ метода составляет примерно 0,1-1 нм по горизонтали и 0,01 нм по вертикали. Изображение бактерии кишечной палочки, полученное с помощью сканирующего зондового микроскопа, показано на рис. 8.

Рис. 8. Бактерия кишечной палочки (Escherichia coli). Изображение получено с помощью сканирующего зондового микроскопа. Длина бактерии - 1,9 мкм, ширина - 1 мкм. Толщина жгутиков и ресничек - 30 нм и 20 нм, соответственно. Автор: Ang Li, National University of Singapore

Сканирующий туннельный микроскоп предназначен для изучения поверхности твердых электропроводящих тел путем сканирования острия металлической иглы над поверхностью образца на расстоянии 0,3-1,0 нм. Между иглой и образцом создают разность потенциалов V (от мВ до В), что обусловливает туннелирование электронов и протекание через зазор туннельного тока (i 1-10 нА). Прибор оснащен системой обратной связи, которая поддерживает ток постоянным путем регулирования величины зазора. Синхронная со сканированием запись сигнала обратной связи позволяет воспроизвести увеличенное изображение профиля поверхности, если работа выхода электронов одинакова по всей поверхности образца. Система с обратной связью позволяет регистрировать также распределение работы выхода по площади участка сканирования.

Сканирующий туннельный микроскоп изобрели (1982 г.) Нобелевские лауреаты (1986 г.) немецкий физик Г. Биннинг (G. Binning) и швейцарский - Х. Рорер (H. Rohrer). Размеры сканируемого участка поверхности можно выбирать от 0,1 нм до 10 мкм. Разрешение микроскопа по осям x, y достигает 0,1 нм, а по оси z - 0,01 нм. Малая величина i и низкая энергия туннелирующих электронов исключает опасность повреждения образца током.

Суть туннельного эффекта состоит в том, что электрический ток между острой металлической иглой и поверхностью, расположенной на расстоянии около 1 нм, начинает зависеть от этого расстояния - чем меньше расстояние, тем больше ток. Если между иглой и поверхностью прикладывать напряжение 10 В, то этот «туннельный» ток может составить от 10 рА до 10 нА. Измеряя этот ток и поддерживая его постоянным, можно сохранять постоянным и расстояние между иглой и поверхностью. Это позволяет строить объёмный профиль поверхности (см. рис. 9).

Рис. 9 Игла сканирующего туннельного микроскопа, находящаяся на постоянном расстоянии над слоями атомов исследуемой поверхности

Сканирующий туннельный микроскоп можно использовать и для перемещения какого-либо атома в точку, выбранную оператором. Например, если напряжение между иглой микроскопа и поверхностью образца сделать в несколько больше, чем надо для изучения этой поверхности, то ближайший к ней атом образца превращается в ион и "перескакивает" на иглу. После этого слегка переместив иглу и изменив напряжение, можно заставить сбежавший атом "спрыгнуть" обратно на поверхность образца. Таким образом, можно манипулировать атомами и создавать наноструктуры, т.е. структуры на поверхности, имеющие размеры порядка нанометра. Ещё в 1990 году сотрудники IBM показали, что это возможно, сложив из 35 атомов ксенона название своей компании на пластинке из никеля (см. рис. 10).

Рис. 10. Сложенное из 35 атомов ксенона на пластинке из никеля название компании IBM, сделанное сотрудниками этой компании с помощью сканирующей зондового микроскопа в 1990 году