Изучение способности молочнокислых бактерий утилизировать побочный продукт пивоваренного производства

Размещено на http://www.allbest.ru/

Статья по теме:

Изучение способности молочнокислых бактерий утилизировать побочный продукт пивоваренного производства

Химическая индустрия на основе нефти выпускает гигантский ассортимент продукции, в том числе и бытового назначения. В частности, невозобновляемые запасы нефти расходуются на производство таких изделий, как пластиковая пленка, пластмассовые бутылки и пакеты, которые практически не поддаются биологическому разложению. В качестве конкурента пластику, произведенному из нефтепродуктов, выступает восстанавливаемый и биодеградируемый пластик, производимый из полилактата (polylactic acid -- PLA) -- продукта конденсации молочной кислоты [1].

Основной рынок использования молочной кислоты (МК) -- это пищевая, фармацевтическая и косметическая промышленность, однако в связи с множеством перспектив в применении полилактата ожидается значительное увеличение его потребления. Так, в 2008 г. производственный объем составил 260 тыс. тонн 100 %-ной молочной кислоты для традиционного рынка использования (включая PLA), в 2010 г. сделан прогноз на более чем 1 млн тонн его ежегодного производства [2].

В большинстве случаев для производства полимолочной кислоты (PLA) более пригоден L(+)-изомер молочной кислоты (L-МК), более чем 95 % промышленного производства которой основывается на процессе микробной ферментации. Молочнокислые бактерии имеют преимущества в целях селективного получения D(-)- и L(+)-изомеров МК из-за их высокой кислотоустойчивости и возможности проведения генетических манипуляций, но обладают такой отрицательной чертой, как требование богатой питательной среды, что усложняет получение кислоты при неполной или незначительной утилизации пентоз [3].

Для уменьшения затрат, связанных с производством молочной кислоты, разработан штамм Escherichia coli SZ85, продуцирующий L-МК на минеральной среде и имеющий замену части кодирующего хромосомального участка ldhA на ген ldhL, кодирующий L-лактат дегидрогеназу [4, 5]. Кроме молочнокислых бактерий для промышленного производства лактата используются и другие бактерии (Bacillus coagulans), а также мицелиальные грибы (Rhizopus spp.), метаболически реконструированные дрожжи и цианобактерии [6, 7].

На себестоимость производства молочной кислоты в значительной степени влияет стоимость сырого продукта. Для биологического производства молочной кислоты дорогостоящим является использование моносахаров, таких как глюкозы, сахарозы и т.д., хотя это обеспечивает ее высокую чистоту. Использование же отходов и вторичных ресурсов перерабатывающих отраслей промышленности позволяет удешевить производство молочной кислоты в сравнении с определенными сахарами.

При ферментации на питательной среде, содержащей молочную сыворотку, высокопродуктивный продуцент L(+)-молочной кислоты штамм Enterococcus faecium В-2240 D позволяет получать целевой продукт с весьма низкой себестоимостью, выходом до 95 % и оптической чистотой до 99,8 % [8]. Известно, что использование кокковых форм молочнокислых бактерий [9-13] для производства молочной кислоты представляется предпочтительным в связи с тем, что они обладают большей скоростью роста, обеспечивающей, следовательно, ускорение накопления молочной кислоты в культуральной жидкости и сокращение производственного цикла.

В целом высокая стоимость и ограниченные запасы ископаемого топлива вызывают большой интерес к использованию восстанавливаемых источников для производства этанола, молочной кислоты и других химических веществ. Производство МК имеет огромное значение в различных отраслях промышленности, например, для получения биодеградируемого растворителя этиллактата, который применяется при производстве электротехники, лаков и красок, текстиля, смазок, клеев и т.д. Производные молочной кислоты являются нетоксичными и не оказывают негативного влияния на окружающую среду в сравнении с нефтепродуктами. Среди европейских стран рынок молочной кислоты наиболее развит в Германии (29,3 % по оценкам 2008 г.), далее следуют Франция и Италия. Самый крупный производитель биоразлагаемого L-PLA -- американская компания NatureWorks LLC (140 000 тонн/год) [14]. Кроме того, PLA производится компанией Toyota (Япония), Hitachi (Япония), Dupont (США), Galactic (Бельгия), Hisun Biomaterials (Китай), а основной производитель LD-полилактата -- компания PURAC (Нидерланды) [15]. В настоящее время единственным в России предприятием по производству молочной кислоты (lactic acid) является ООО «Сухой крахмал и молочная кислота» (ООО «СКИМК») [16], в Республике Казахстан таких предприятий нет.

Таким образом, для обеспечения отечественного рынка молочной кислотой, используемой не только при производстве косметики, пищевых продуктов, в фармацевтической отрасли, но и в сельскохозяйственной промышленности, актуальным и перспективным является разработка технологий получения молочной кислоты на основе возобновляемого сырья.

Цель данных исследований -- изучение способности штаммов молочнокислых бактерий расти на среде, основанной на водной вытяжке побочных продуктов пищевого производства, а также определение концентрации молочной кислоты, продуцируемой различными штаммами.

Объекты и методы исследований

Объектами исследования были депонированные в РГП «Республиканская коллекция микроорганизмов» штаммы молочнокислых бактерий, а также пробы пивной дробины, любезно предоставленные частной пивоварней «Пивоварофф» (г. Астана).

Оценку чистоты бактериальных штаммов осуществляли согласно методам классической микробиологии [17, 18]. Общеизвестный метод идентификации бактерий в основном ориентирован на использовании определителя «Bergey Manual of Systematic Bacteriology» [19].

Активность кислотообразования бактериальных штаммов определяли титриметрическим методом [20]. Количественное определение содержания L-молочной кислоты проведено с использованием коммерческого набора фирмы Абкам (США) и спектрофотометра фирмы Биорад (США).

Для выделения ДНК бактериальных культур использован коммерчески доступный набор Wizard Genomic DNA Purification Kit 500 (Promega, USA). Выделение ДНК, агарозный гель-электрофорез, ПЦР-метод выполнены согласно общеизвестным методам [21]. Для определения нуклеотидной последовательности гена 16S rDNA проводили ПЦР с использованием праймеров 8f (5-AGAGT-TTGATCCTGGCTCAG-3') и 806r (5'-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3'), которые являются универсальными для бактерий.

В целях получения достоверных данных все эксперименты проводили в 2-4-кратной повторности, результаты обрабатывались общепринятыми статистическими методами [22].

Результаты исследований

Проведен отбор штаммов, относящихся к различным видам молочнокислых бактерий, и изучена их способность расти на среде, основа которой состоит из побочного продукта пивоваренного производства, в частности, из водной вытяжки зерновой дробины. Так, в таблице представлены результаты изменения количества КОЕ (колониеобразующих единиц) штаммов молочнокислых бактерий при их культивировании на среде с побочными продуктами пивного производства. При этом для определения оптимальных условий роста молочнокислых бактерий на водной вытяжке зерноотхода была использована среда с двукратно разведенным экстрактом (50 %) и без разведения (100 %). Учитывая, что исходная вытяжка пивной дробины содержит незначительное количество (до 0,115 %) восстанавливающих сахаров, то дополнительно в среду добавлен 1 % глюкозы. Установлено, что штаммы молочнокислых бактерий хорошо растут на среде с водной вытяжкой зерноотходов, причем титр клеток бактерий был выше в два и более раза при использовании неразведенной 100 %-ной вытяжки побочного продукта.

Как известно, активное кислотообразование бактерий рассматривается как один из важных факторов их антагонизма в отношении других видов микроорганизмов. Поэтому наиболее известным биологическим свойством молочнокислых бактерий, в том числе лактобацилл, является их способность продуцировать молочную кислоту.

При изучении кислотообразующей активности по методу Тернера молочнокислые бактерии условно подразделяют на три группы: 1 группа -- с низкой кислотообразующей активностью до 40 °Т (градусов по Тернеру), 2 группа -- со средней кислотообразующей активностью 40-79 °Т, 3 группа -- с высокой активностью -- от 80 °Т и выше [17, 18]. Результаты определения титруемой кислотности у исследуемых молочнокислых бактерий показали, что все исследуемые штаммы молочнокислых бактерий обладают высокой кислотообразующей активностью и уровень кислотообразования был в пределах 130-270 °Т.

В связи с тем, что метод Тернера позволяет определять накопление не только молочной кислоты в среде, но и других органических кислот, продуцируемых бактериями, проведено количественное определение молочной кислоты с помощью коммерчески доступного набора фирмы Абкам (США). Для определения уровня содержания молочной кислоты был построен калибровочный график (рис. 1) с использованием стандарта молочной кислоты фирмы Абкам (США).

Рис. 1 Рис. 2

После двухсуточного культивирования исследуемых штаммов молочнокислых бактерий на MRS бульоне проведено определение концентрации молочной кислоты в культуральной жидкости согласно протоколу фирмы-производителя Абкам.

На рисунке 2 показано изменение показателя оптической плотности реакционной смеси с добавлением супернатанта, полученного с различными культурами молочнокислых бактерий. При перерасчете в соответствии с калибровочной кривой установлено, что штаммы 0008 RKM, 0016 RKM, 0021 RKM и 0025 RKM способны продуцировать L-молочную кислоту в концентрации 10 и более наномоль/лунку, в сравнении со штаммами 0012 RKM, 0014 RKM, 0015 RKM, 0023 RKM и 0024 RKM. При этом контрольный вариант неинокулированной питательной среды (К) показал незначи тельное изменение уровня адсорбции, что обусловлено бэкграундом самой питательной среды. Поэтому согласно инструкции фирмы-производителя данного колориметрического набора (Абкам, США) проведен вычет показаний контрольного варианта. В результате проведенных расчетов выявлена способность штаммов 0008 RKM, 0016 RKM, 0021 RKM продуцировать L-молочную кислоту в концентрации 4,7-5,0 мМ, тогда как высокую активность показал штамм 0025 RKM (5,5 мМ). У остальных исследованных штаммов молочнокислых бактерий выход молочной кислоты был в пределах от 4,3 до 4,6 мМ, а штамм 0024 RKM характеризовался низкой продуцирующей активностью с выходом молочной кислоты 2,5 мМ на литр питательной среды, что обусловлено слабым ростом данной культуры на жидкой питательной среде MRS.

Анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S rDNA исследуемых штаммов молочнокислых бактерий показал 99-100 %-ную идентичность с нуклеотидными последовательностями штаммов, относящихся к роду Lactobacillus spp., депонированными в международной базе данных GenBank.

Таким образом, в данной серии экспериментов установлено, что различные штаммы молочнокислых бактерий, являющихся известными продуцентами молочной кислоты, могут утилизировать отходы пивоваренного производства. Дальнейшая оптимизация условий культивирования позволит повысить активность исследуемых штаммов-продуцентов, способных вырабатывать молочную кислоту в пределах 2,5-5,5 мМ на стандартной питательной среде MRS. Как известно, использование органических отходов, повсеместно образующихся в пищевой и перерабатывающей промышленности Казахстана, позволит не только обеспечить удаление источников загрязнения окружающей среды, но и обусловит превращение этих отходов в полезные целевые продукты, в частности для получения молочной кислоты.

Список литературы

штамм бактерия ген продуцент

1. Abdel-Rahmana M.A., Tashiroc Y., Sonomoto K. Lactic acid production from lignocellulose-derived sugars using lactic acid bacteria: Overview and limits // Journal of Biotechnology. -- 2011. -- 156. -- P. 286- 301.

2. Taskila S., Ojamo H. The current status and future expectations in industrial production of lactic acid by lactic acid bacteria // Lactic acid bacteria -- R & D for food, health and livestock purposes / Ed. by M.Kongo. -- Rijeka, Croatia: InTech, --615-632.

3. de Vos W.M. Systems solutions by lactic acid bacteria: from paradigms to practice // Microb. Cell Fact. -- 2011. -- 10, No. 1-2. -- P. 1-13.

4. Zhou S., Causey T.B., Hasona A., Shanmugam K.T., Ingram L.O. Production of Optically Pure D-Lactic Acid in Mineral Salts Medium by Metabolically Engineered Escherichia coli W3110 // Appl. and environ. microbiol. -- 2003. -- 69, No. 1. --399-407.

5. Zhou S., Shanmugam K.T., Ingram L.O. Functional Replacement of the Escherichia coli D(-)-Lactate Dehydrogenase Gene (ldhA) with the L(+)-Lactate Dehydrogenase Gene (ldhL) from Pediococcus acidilactici // App. and environ. microbiol. -- 2003. Vol. 69, 4. -- P. 2237-2244.

6. Patel M.A. Ou M.S., Harbrucker R., Aldrich H.C., Buszko M.L., Ingram L.O., Shanmugam K.T. Isolation and Characterization of Acid-Tolerant, Thermophilic Bacteria for Effective Fermentation of Biomass-Derived Sugars to Lactic Acid // App and environ. microbiology. -- 2006. -- Vol. 72, No. 5. -- P. 3228-3235.

7. Yang X. Lai Zh., Lai Ch., Zhu M., Li Sh., Wang J., Wang X. Efficient production of L-lactic acid by an engineered Thermoanaerobacterium aotearoense with broad substrate specificity // Biotechnology for Biofuels. -- 2013. -- Vol. 6, No. 124. -- P. 1-12.

8. Skory Ch.D. Isolation and Expression of Lactate Dehydrogenase Genes from Rhizopus oryzae // Applied and environm. microbiol. -- 2000. -- 66, No 6. -- P. 2343-2348.

9. Ilmen M., Koivuranta K., Ruohonen L., Suominen P., Penttila M. Efficient Production of L-Lactic Acid from Xylose by Pichia stipitis // Appl. and environ. microbiology. -- 2007. -- 73, No. 1. -- P. 117-123.

10. Varman A.M., Yu Y., You L., Tang Y.J. Photoautotrophic production of D-lactic acid in an engineered cyanobacterium // Microbial Cell Factories. -- 2013. -- 12, No. 117. -- P. 1-8.

11. Пат. 2205216 Российская Федерация, МПК7C12N001/20 C12P007/56 C12N001/20 C12R001/01. Штамм бактерий Enterococcusfaecium в-2240d -- продуцент оптически чистой L(+)-молочной кислоты и промышленный способ получения L(+)-молочной кислоты или ее солей / Галкина Г.В., Илларионова В.И.; заявитель и патентообладатель Морозов Василий Юрьевич. № 2000125372/13; заявл. 05.12.00; опубл. 27.05.2003, Бюл. №3.

12. Carvalho A.L., Cardoso F.S., Bohn A., Neves A.R., Santos H. Engineering trehalose synthesis in Lactococcus lactis for improved stress tolerance // Appl. Environ. Microbiol. -- 2011. -- 77, No. 12. -- Р. 4189-4199.

13. Guo T., Kong J., Zhang L., Zhang C, Hu Sh. Fine Tuning of the Lactate and Diacetyl Production through Promoter Engineering in Lactococcus lactis // Plos one. -- 2012. -- Vol. 7, Issue 4. -- e36296 [Электронныйресурс]

14. Vink E.T.H., Davies S., Kolstad J.J. The eco-profile for current Ingeo polylactide production // Industrial Biotechnology. -- 2010. -- 6, No. 4. -- P. 212-224.

15. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов, М.А.Егорова, Л.М.Захарчук и др.; Под ред. А.И. Нетрусова. -- М.: Изд. центр «Академия», 2005. -- 608

16. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для вузов / Е.З.Теппер, В.К.Шильникова, Г.И.Переверзева; Под ред. В.К.Шильниковой. -- М.: Дрофа, 2004. -- 256 с.

17. Хоулт Дж., КригН. Определитель бактерий Берджи: В 2 т. -- М.: Мир, 1997. -- Т. 1. -- 432 с.; Т. 2. -- 368 с.

18. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Учеб. пособие / М.Н.Пименова, Н.Н. Гречушкина, Л.Г.Азова, А.И. Нетрусов и др.; Под ред. Н.С.Егорова. -- М.: Изд-во МГУ, 1995. -- 224 с.

19. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. --Y., 1989. -- 1659 p.

20. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов. -- 4-е изд., перераб. и доп. -- М.: Высш. шк., 1990. --352 с.

Размещено на Allbest.ru