Разработка технологии бактериальных концентратов на основе бифидобактерий B. longum DK-100, B. bifidum 83

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Разработка технологии бактериальных концентратов на основе бифидобактерий B. longum DK-100, B. bifidum 8₃

Специальность 05.18.04 - Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой

степени кандидата технических наук

Гамзякова Ильяна Вячеславовна

Улан-Удэ 2013

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» (ВСГУТУ)

Научный руководитель: доктор технических наук, профессор Хамагаева Ирина Сергеевна

Официальные оппоненты:

Анцупова Татьяна Петровна, доктор биологических наук, профессор кафедры «Неорганическая и аналитическая химия» ВСГУТУ

Занданова Туяна Нимбуевна, кандидат технических наук, доцент кафедры специальных дисциплин Бурятского филиала НГОУ ВПО Центросоюза РФ «Сибирский университет потребительской кооперации»

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Бурятская государственная сельскохозяйственная академия им. В.Р. Филиппова» (г. Улан-Удэ)

Защита диссертации состоится 25 декабря 2013 г. в 10⁰⁰ часов на заседании диссертационного совета Д 212.039.05 при ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» по адресу: 670013, г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40в, ауд. 8-124.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВСГУТУ.

Автореферат разослан « 22 » ноября 2013 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Столярова Анна Сергеевна

бактериальный концентрат технология

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В настоящее время наиболее изученным и практически реализованным направлением поддержания микробной экологии человека на оптимальном уровне, является использование для этих целей препаратов бифидобактерий. Многолетние клинические наблюдения за лечебной и профилактической эффективностью бифидобактерий показали, что они не обладают побочными эффектами при их длительном применении и могут быть рекомендованы для производства продуктов функционального питания для ежедневного использования людьми всех возрастов.

Бифидобактерии, присутствующие в пищевых продуктах, очень чувствительны к факторам окружающей среды, к низким значениям рН, отсутствию ростовых факторов, поэтому для удлинения сроков сохранения бифидобактерий в жизнеспособном состоянии необходимо исследовать факторы, повышающие их устойчивость в процессе производства и хранения.

Для улучшения технологических и функциональных характеристик отобранных для производства пробиотиков, а также для конструирования новых препаратов с заданными свойствами необходимо использовать различные биотехнологические приемы, повышающие биохимическую активность и пробиотические свойства.

Известно, что пребиотики активизируют рост бифидобактерий и играют важную роль в поддержании их жизнедеятельности.

Однако до настоящего времени остаются неизученными вопросы, касающиеся влияния пребиотиков на физиолого-биохимические и технологические свойства бифидобактерий. В связи с этим детальное исследование данной проблемы и создание бактериальных концентратов с высокими функциональными свойствами открывает широкие перспективы для расширения ассортимента инновационных пробиотических продуктов и отвечает запросам потребителей.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы является разработка технологии пробиотических бактериальных концентратов с высокими функционально-технологическими свойствами.

Для достижения указанной цели были определены следующие задачи исследований:

- изучить влияние пребиотиков на биохимическую активность Bifidobacterium longum DK-100 и Bifidobacterium bifidum 8₃;

- исследовать влияние пребиотиков на процессы адгезии и когезии бифидобактерий;

- исследовать устойчивость бифидобактерий к низким значениям рН;

- исследовать антимутагенную и холестеринметаболизирующую активность бифидобактерий;

- обосновать технологические параметры получения бактериальных концентратов;

- исследовать сроки хранения бактериальных концентратов бифидобактерий.

Научная новизна. В результате проведенных исследований выбраны оптимальные дозы пребиотиков, обеспечивающие активный рост бифидобактерий. Установлено, что высокомолекулярные полисахариды повышают адгезивные свойства, приводят к агрегации клеток бифидобактерий и формируют микроколонии. Ферментация бифидобактериями сложных углеводов способствует повышению их антимутагенной и холестеринметаболизирующей активности. Выявлено, что адгезия и агрегация бифидобактерий на биоволокнах повышают их устойчивость к низким значениям рН и пролонгируют сроки хранения бактериальных концентратов.

Практическая ценность работы. Основные результаты исследований нашли практическую значимость в разработке технологии производства жидких бактериальных концентратов. Разработаны проекты технической документации и проведена опытно-промышленная проверка технологии производства жидких бактериальных концентратов в условиях МИП «Бифивит»

Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на научных конференциях ВСГУТУ (Улан-Удэ, 2010-2012), международных и всероссийских конференциях: «Пищевые продукты и здоровье человека» (Кемерово, 2009, 2011), «Пищевые технологии и биотехнологии» (Казань, 2010), «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности» (Бийск, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе одна статья в журнале, рекомендованном ВАК Министерства образования и науки РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора, методической части, результатов эксперимента и их анализа, списка литературы и приложений. Основная часть работы изложена на 127 страницах машинописного текста, включает 27 таблиц, 10 рисунков, 2 приложения. Список литературы включает 135 наименований.

МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Экспериментальная часть исследований проводилась в лабораториях кафедры «Технология молочных продуктов. Товароведение и экспертиза товаров» и МИП «Бифивит» ВСГУТУ.

Объектами исследований служили чистые культуры пробиотических бактерий: штамм Bifidobacterium longum DK-100 и Bifidobacterium bifidum 8₃, полученные из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ «Генетика», активизированные уникальным биотехнологическим методом, разработанным в ВСГУТУ. В исследованиях использовали растительные добавки: из злаковых культур (ячменная мука по ТУ 9293-002-43175543-03, овсяная мука по ГОСТ 27168-86) и жмых ядра кедрового ореха по ТУ 9146-001-53163736-06.

Для культивирования пробиотических микроорганизмов применяли питательную среду на основе осветленной творожной сыворотки с внесением ростовых компонентов, разработанную в ВСГУТУ.

Оптическую плотность определяли фотоколориметрическим методом на фотоколориметре KF - 77 при л=550 нм; антимутагенную активность ? по тесту Эймса; адгезивные свойства - по развернутому методу Брилис; активную кислотность определяли по ГОСТ Р 53359-2009; контаминацию по ГОСТ Р 53430-2009; морфологию клеток бактерий - путем приготовления препаратов, окрашенных метиленовым синим, или по Граму с последующим микроскопированием в иммерсионной системе; количественный учет бифидобактерий - по МУК 4.2.999-00; в исследованиях использовали микроскоп марки МИКМЕД-6 (видимое увеличение 1000-кратное).

Общая схема проведения экспериментов представлена на рисунке 1.

Рисунок 1 - Общая схема проведения эксперимента

Для определения концентрации общего холестерина использовали ферментативный метод. Принцип метода заключается в том, что под действием фермента холестеринэстеразы эфиры холестерина распадаются на холестерин и жирные кислоты. Далее холестерин под воздействием холестериноксидисмутазы дает окрашенное соединение и перекись водорода. Интенсивность окраски в реакционной смеси прямо пропорциональна концентрации холестерина в пробе. После этого измеряли оптическую плотность опытной пробы (Е) и калибровочной пробы (Е_к) против рабочего реагента, состоящего из смеси ферментов при длине волны 500 нм. Концентрацию холестерина в пробе определяли расчетным методом по формуле С=Е/Е_к*4,65, где 4,65 - это концентрация холестерина в калибраторе (моль/л). При измерении опытных образцов, дающих интенсивный цвет, допускается разбавление образцов физиологическим раствором в два раза. Полученные данные в расчете умножают на 2. При исследовании холестеринметаболизирующей активности пробиотических микроорганизмов использовали питательную среду на основе молочной сыворотки, разработанную ранее в ВСГУТУ с добавлением очищенной сыворотки крови в качестве источника холестерина.

В таблицах обсуждены статистически достоверные различия при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение влияния пребиотиков на биохимическую активность Bifidobacterium longum DK-100 и Bifidobacterium bifidum 8₃

Одной из проблем использования пробиотических препаратов является потеря бифидобактериями жизнеспособности в процессе хранения при воздействии неблагоприятных технологических факторов или в агрессивной среде желудка. Поэтому важной биотехнологической задачей, имеющей коммерческую значимость, является повышение устойчивости бифидобактерий в пробиотических концентратах.

Известны эффективные лечебные препараты, созданные путем адсорбции молочнокислых бактерий на различных биоволокнах, повышающих их жизнеспособность.

В связи с этим нами выдвинута гипотеза о возможности повышения стрессоустойчивости бифидобактерий путем непосредственного культивирования в питательной среде с субстратом - адсорбентом, в качестве которого могут служить злаковые культуры и жмых ядра кедрового ореха, обладающие пребиотическими свойствами.

На первом этапе исследований изучали влияние ячменной, овсяной муки и жмыха ядра кедрового ореха на биохимическую активность ранее не изученных штаммов бифидобактерий B. bifidum 8₃ и B. longum DK-100.

При подборе условий культивирования бифидобактерий для получения пробиотических концентратов руководствовались следующими требованиями: низкая себестоимость процесса; высокий титр бифидобактерий в стационарной фазе роста; высокая устойчивость при неблагоприятных факторах внешней среды.

Для культивирования бифидобактерий использовали ранее разработанную питательную среду на основе осветленной творожной сыворотки, в которую вместо агара вносили различные дозы злаковых культур и жмыха ядра кедрового ореха.

В результате проведенных исследований с учетом количества жизнеспособных клеток бифидобактерий и органолептических свойств, были выбраны оптимальные дозы вносимых компонентов: для жмыха ядра кедрового ореха - 2%, для ячменной муки - 1,5 %, для овсяной муки - 1%. В дальнейших исследованиях выбранные дозы использовали при изучении биохимической активности бифидобактерий. Полученные результаты представлены на рисунке 2.

Рисунок 2 - Динамика роста В. longum ДК-100

Данные, представленные на рисунке 2, показывают, что внесение растительных компонентов ускоряет рост бифидобактерий B. longum DK-100.

Анализ динамики роста бифидобактерий показывает, что при внесении ячменной и овсяной муки количество жизнеспособных клеток бифидобактерий через 18 ч достигает 10¹¹ КОЕ/см³, тогда как в контроле такое значение наблюдается через 24 ч культивирования. Следует отметить, что при внесении жмыха ядра кедрового ореха стационарная фаза наступает через 18 ч культивирования, при этом количество жизнеспособных клеток бифидобактерий составляет 10¹² КОЕ/см³, что свидетельствует об его более высоких пребиотических свойствах (рис. 2). Такая же динамика отмечена при культивировании бифидобактерий B. bifidum 8₃.

В результате проведенных исследований выбраны оптимальные дозы пребиотиков, обеспечивающие активный рост бифидобактерий.

Исследование влияния пробиотиков на процессы адгезии и когезии бифидобактерий

Адгезия к слизи, гликопротеинам и эпителиальным клеткам, а также колонизация в желудочно-кишечном тракте человека являются основополагающими характеристиками микроорганизмов, обладающих пробиотическими свойствами.

Злаковые культуры и жмых ядра кедрового ореха содержат высокое количество растворимых и нерастворимых пищевых волокон и могут адсорбировать и колонизировать бифидобактерии в процессе культивирования. В связи с этим в дальнейших исследованиях изучали адгезивные свойства бифидобактерий при их культивировании на питательной среде с внесением пребиотиков. Адгезию бифидобактерии оценивали по среднему показателю адгезии (СПА), коэффициенту участия эритроцитов (КУЭ), индексу адгезивности микроорганизмов (ИАМ). Микроорганизмы считаются высокоадгезивными при ИАМ более 4,0; среднеадгезивными - при ИАМ от 2,51 - 4,0; малоадгезивными - при ИАМ от 1,76 - 2,54. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Влияние пребиотиков на адгезивные свойства бифидобактерий В. longum ДК-100 и B. bifidum 8₃

Результаты исследований, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что исследуемые штаммы бифидобактерий в присутствии пребиотиков обладают более высокими адгезивными свойствами.

Вероятно, высокомолекулярные полисахариды, содержащиеся в исследуемых растительных добавках, повышают адгезивные свойства бифидобактерий.

К механизмам, гарантирующим стабильность микробного консорциума, кроме адгезии относится также когезия (агрегация клеток). В литературных источниках недостаточно сведений о межклеточных контактах микроорганизмов, отражающих закономерности развития микробных популяций как саморегулирующих многоклеточных систем.

Дальнейшие исследования посвящены изучению влияния пребиотиков на когезию бифидобактерий.

Результаты исследований представлены на рисунке 3.

а) контроль б) овсяная мука 1%

в) ячменная мука 1,5% г) жмых ядра кедрового ореха 2 %

Рисунок 3 - Микрокартина бифидобактерий В. longum ДК-100 (видимое увеличение микроскопа 1000-кратное)

Из представленного выше рисунка 3 б-г видно, что внесение пищевых волокон приводит к агрегации клеток бифидобактерий и формированию микроколоний. Согласно современным данным, механизм позитивного эффекта пищевых волокон, растворимых в-глюканов овса и ячменя и нерастворимых высокомолекулярных полисахаридов, заключается в создании дополнительной площади для фиксации бифидобактерий и биотрансформации пищевых волокон с образованием доступных источников углерода и энергии. Из литературных данных известно, что адсорбция и иммобилизация на биоволокнах защищают клетки бифидобактерий при стрессовых воздействиях.

В результате проведенных исследований установлено, что исследуемые штаммы бифидобактерий обладают высокими адгезивными свойствами, колонизируются на поверхности пищевых волокон злаковых культур и жмыха ядра кедрового ореха с образованием агрегатов, что повышает их устойчивость к неблагоприятным факторам среды.

Дальнейшие исследования были посвящены изучению устойчивости бифидобактерий к низким значениям рН. Для этого проводили модельные опыты. Результаты представлены на рисунке 4.

Рисунок 4 - Влияние различных значений рН на выживаемость клеток B. longum DK-100

Как видно из рисунка 4, внесение пребиотиков в питательную среду повышают устойчивость бифидобактерий к снижению рН в сравнении с контролем. Наиболее высокой устойчивостью к низким значениям рН среды характеризуются бифидобактерии выращенные на среде со жмыхом ядра кедрового ореха. Так, например, при рН=5 выживаемость бифидобактерий составляет 96,6 %, тогда как в контроле без добавления жмыха ядра кедрового ореха количество жизнеспособных клеток снижается до 83%. Отмечена достаточно высокая выживаемость бифидобактерий на среде с пребиотиками в сравнении с контролем при рН=3. При этом количество жизнеспособных клеток на питательной среде со жмыхом ядра кедрового ореха составляет 77,2%, со злаковыми культурами находится в пределах (70,3-71)%, тогда как в контроле - 60%.

Полученные результаты подтверждают, что процессы адгезии и когезии влияют на метаболизм бифидобактерий и повышают их жизнеспособность при низких значениях рН среды.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что внесение пребиотиков в питательную среду не только стимулирует рост бифидобактерий, но и повышает их устойчивость при экстремальных условиях культивирования.

Исследование антимутагенной активности бифидобактерий

Известно, что бактерии эволюционно наиболее древние существа, постоянно подвергающиеся мутагенным и инактивирующим факторам среды. Это обстоятельство предполагает, что бактерии должны обладать надежными средствами защиты для сохранения стабильности своего генома. В настоящее время доказано, что бифидобактерии обладают антимутагенными свойствами, которые зависят от различных факторов. Одним из факторов, влияющих на антимутагенную активность пробиотических микроорганизмов, является состав питательных сред.

В связи с этим нами изучено влияние пребиотиков на антимутагенные свойства B.bifidum 8₃ и B. longum DK-100. Полученные результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Влияние пребиотиков на антимутагенную активность бифидобактерий

Из данных, представленных в таблице 2, видно, что культивирование бифидобактерий на питательной среде с внесением пребиотиков повышает антимутагенные свойства бифидобактерий. Это, вероятно, связано с биотрансформацией сложных углеводов и изменением метаболизма бифидобактерий, что способствует более высокому синтезу антимутагенных веществ.

Следует отметить, что полученные нами результаты согласуются с литературными данными о высокой антиоксидантной активности в-глюкана и нерастворимых пищевых волокон, содержащихся в пребиотиках и повышающих антимутагенные свойства бифидобактерий.

Исследование холестеринметаболизирующей активности бифидобактерий

Проведенные ранее исследования показали, что B. bifidum 8₃ и B. longum DK-100 обладают достаточно высокой холестеринметаболизирующей активностью. В ходе исследований нами было отмечено, что способность бифидобактерий снижать концентрацию холестерина в среде культивирования зависит от времени инкубации, концентрации субстрата и состава среды. Поэтому на следующем этапе исследований изучено влияние пребиотиков на холестеринметаболизирующую активность бифидобактерий. Результаты исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Влияние пребиотиков на холестеринметаболизирующую активность бифидобактерий

Как видно из таблицы 3, исследуемые штаммы бифидобактерий в процессе культивирования в питательной среде с добавлением пребиотиков обладают более высокой холестеринметаболизирующей активностью. Вероятно, холестерин адсорбируется на пищевых волокнах и разрушается при биотрансформации субстрата бифидобактериями.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что культивирование бифидобактерий в среде с пребиотиками повышает биохимическую активность и пробиотические свойства микроорганизмов.

Обоснование технологических параметров получения бактериальных концентратов

В результате проведенных исследований нами установлено, что оптимизация питательной среды пребиотиками повышают функционально-технологические свойства бифидобактерий. На основании полученных результатов разработана технологическая схема производства бактериальных концентратов (рис. 4).

Качественная характеристика бактериальных концентратов на основе B. longum DK-100 представлена в таблице 4.

Таблица 4 - Качественная характеристика бактериальных концентратов на основе B. longum DK-100

Рисунок 4 - Технологическая схема производства бактериальных концентратов

Как видно из данных, представленных в таблице 4, бактериальные концентраты обладают высокими пробиотическими свойствами, и количество жизнеспособных клеток составляет 10¹¹-10¹² КОЕ/см³.

Исследование сроков хранения бактериальных концентратов бифидобактерий

На следующем этапе изучали сроки хранения бактериальных концентратов бифидобактерий. Бактериальные концентраты хранили при температуре (4-6) ^oС. О качестве бактериальных концентратов судили по количеству жизнеспособных клеток бифидобактерий и органолептическим показателям. Результаты исследований представлены на рисунке 5.

Рисунок 5 - Исследование предельных сроков хранения бактериальных концентратов B. longum DK-100.

Как видно из рисунка 5, культивирование бифидобактерий в питательной среде с пребиотиками повышает их устойчивость при хранении. Наиболее высокая жизнеспособность бифидобактерий обнаружена при культивировании на питательной среде со жмыхом ядра кедрового ореха. Через 5 мес хранения количество жизнеспособность клеток бифидобактерий в концентрате с пребиотиками составляет 10⁸-10⁹ КОЕ/см³, тогда как в контроле количество клеток снижается до 10⁶ КОЕ/см³. При дальнейшем хранении концентрата с овсяной мукой отмечено ухудшение органолептических свойств через 5 мес, а в концентратах с ячменной мукой и жмыхом кедрового ореха ? через 7 мес.

В результате проведенных исследований установлено, что культивирование бифидобактерий на питательной среде с внесением пребиотиков пролонгирует сроки хранения концентратов.

ВЫВОДЫ

В результате проведенных исследований разработана технология бактериальных концентратов с высокими функциональными свойствами и пролонгированными сроками хранения.

1. Подобраны условия культивирования, обеспечивающие высокую биохимическую активность бифидобактерий.

2. Установлено, что бифидобактерии фиксируются на поверхности биоволокон с образованием агрегатов, что повышает их устойчивость к неблагоприятным факторам среды.

3. Отмечено, что процессы адгезии и когезии влияют на метаболизм бифидобактерий и повышают их устойчивость к низким значениям рН.

4. Биотрансформация сложных углеводов субстрата способствует более высокому синтезу антимутагенных веществ и повышает холестеринметаболизирующую активность бифидобактерий.

5. На основании проведенных исследований обоснованы технологические параметры и разработана технологическая схема жидкого бактериального концентрата.

6. Установлено, что бактериальные концентраты обладают высокой биохимической активностью и устойчивостью к экстремальным факторам внешней среды.

7. Опытно-промышленная проверка на базе МИП «Бифивит» показала, что они соответствуют требованиям технической документации.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гамзякова И.В. Влияние кедрового жмыха на рост бифидобактерий / И.В. Гамзякова, С.Н. Хазагаева, И.С. Хамагаева: ? Мат-лы II Всерос. конф. студентов и аспирантов «Пищевые продукты и здоровье человека». Кемерово: Изд-во КемТИПП, 2009. С. 37-39.

2. Гамзякова И.В. Влияние пищевых волокон на качественную характеристику продукта / И.В. Гамзякова, Н.А. Замбалова, И.С. Хамагаева: ? Сб. науч. тр. ВСГТУ. Сер.: Химия и биологически активные вещества природного происхождения. Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2010. С. 43-45.

3. Гамзякова И.В. Антимутагенная активность пробиотических микроорганизмов / И.В. Гамзякова, И.С. Хамагаева: ? Мат-лы XI Междунар. конф. молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии». Казань, Изд-во КГТУ, 2010. С. 68-69.

4. Гамзякова И.В. Влияние ячменной муки на рост бифидобактерий / И.В. Гамзякова, Веньи Занг, И.С. Хамагаева: ? Мат-лы IV Всерос. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Пищевые продукты и здоровье человека». Кемерово: Изд-во КемТИПП, 2011. С. 76-77.

5. Гамзякова И.В. Влияние пищевых волокон на адгезивные и антимутагенные свойства бифидобактерий / И.В. Гамзякова, Н.А. Замбалова, Сан Тиансонг, И.С. Хамагаева: ? Мат-лы IV Всерос. науч.-практ. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых с международным участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности». Бийск: Изд-во Алт. ГТУ, 2011. С. 308-311.

6. Гамзякова И.В. Влияние пищевых волокон на адгезию и когезию бифидобактерий / И.В. Гамзякова, Веньи Занг, И.С. Хамагаева: ? Сб. науч. тр. с междунар. участием. Сер.: Химия и биологически активные вещества природного происхождения. Улан-Удэ: Изд-во ВСГТУ, 2011. -С. 29-33.

7. Гамзякова И.В. Качественная характеристика бактериального концентрата, обогащенного пищевыми волокнами / И.В. Гамзякова, Н.А. Замбалова, И.С. Хамагаева: ? Вестник ВСГУТУ. Улан-Удэ, 2012. №1 (36). С. 72-77.

8. Гамзякова И.В. Влияние пребиотиков на холестеринметаболизирующую активность бифидобактерий / И.В. Гамзякова, Н.А. Замбалова, И.С. Хамагаева: ? Сб. науч. тр. с междунар. участием. Секция: Биоорганическая и пищевая химия. Улан-Удэ: Изд-во ВСГУТУ, 2012. -С. 119-121.

9. Гамзякова И.В. Холестеринметаболизирующая активность синбиотических БАД / И.В. Гамзякова, И.С. Хамагаева: ? Мат-лы II Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием «Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока», посвящ. 50-летию со дня образования университета ВСГУТУ, Улан-Удэ: Изд-во ВСГУТУ, 2012. -С. 76-78.

Размещено на Allbest.ru