Научные основы ферментативной конверсии целлюлозы хлопкового волокна

Биохимические воздействия СК жидкостей на субстраты впервые были описаны в 1985 Рандольфом и др. [Randolph et al., 1985]. Применение СК углекислого газа при ферментативном гидролизе (ФГ) различных субстратов целлюлозы с целью получения глюкозы было проведено в 1994-1996 годах Чженгом [Zheng et al., 1996; 1998]. Отмечено, что скорость реакции и концентрация глюкозы увеличивались по сравнению с ФГ целлюлозы без углекислого газа. Использование метода СК давления СО₂ при ФГ волокон хлопчатника впервые проводилось автором данной работы [Muratov G. et al., 2002; 2003; 2007].

В своих исследованиях динамику выходов ВС и глюкозы мы анализировали в зависимости от: вида, сорта и возраста волокон; температуры; СК давления СО₂; продолжительности реакции ФГ, а также от использования целлюлазных комплексов различного происхождения.

Прежде всего, в качестве одного из основных факторов, влияющих на процесс ФГ, изучали влияние температуры на выходы ВС и глюкозы при ФГ разновозрастных волокон хлопчатника целлюлазными комплексами различного происхождения при 2-суточном гидролизе (табл. 4). Следует отметить, что выходы ВС и глюкозы в зависимости от возраста волокон, температуры и давления, а также происхождения целлюлазных препаратов, различны. Так, например, если рассматривать волокна сорта Ташкент-6, то с увеличением возраста волокон, выходы ВС и глюкозы уменьшаются. Если при ФГ 30 дневного волокна (30⁰С) целлюлазным комплексом из Trichoderma viride выход ВС составлял 15.5, то в 40 и 60 дневном возрасте это значение соответствует 14.2 и 10.8 мг/мл соответственно. Такое падение выходов ВС и глюкозы можно наблюдать и для вариантов с двумя другими целлюлазными комплексами (Trichoderma reesei и Aspergillus niger). Это объясняется не содержанием целлюлозы, синтезируемой в процессе роста растений, а уплотнением надмолекулярной структуры от возраста волокон [Муратов A. и др., 1983; 1985; 1989; Муратов Г., 1998]. Несмотря на малое содержание целлюлозы у 30 дневных волокон, выходы ВС самые большие. Это связано с тем, что структура волокон, начиная от 40 дневного возраста, приобретает более плотную упаковку микрофибрилл и становится труднодоступной для целлюлазных препаратов. Об уплотнении (кристаллизации) структуры волокон хлопчатника с 40 дневного возраста было упомянуто в работах [Усманов и др., 1971; Муратов A. и др., 1983; 1985].

Изучением зависимости температуры на эффективность ФГ хлопковой целлюлозы показано, что с увеличением температуры от 30 до 50⁰С, выходы ВС и глюкозы увеличиваются. Дальнейшее увеличение температуры при ФГ приводит к уменьшению этих показателей. Так, например, если при ФГ целлюлозы волокон Термез-31 выходы ВС при 30⁰С (30 дн; фермент из Trichoderma viride) составляют 16.8 мг/мл, то при 50⁰С выходы ВС увеличиваются до 28.0 мг/мл, а при 60⁰С они падают до 23.5 мг/мл. Эти данные получены при ФГ хлопковой целлюлозы в атмосферном (1 атм.) давлении. Аналогичные результаты получены при гидролизе в условиях СК СО₂ давления. Так, если выходы ВС при 30⁰С имели значения 24.0 мг/мл, то при 50⁰С и 60⁰С они составляют 40.1 и 34.4 мг/мл соответственно. Т.е., выходы ВС при ФГ до 50⁰С увеличиваются, а затем падают. То же самое при ФГ наблюдается и для других возрастов волокон. Но главное различие проявляется в количественном соотношении выходов ВС. Т.е. с увеличением возраста волокон, выходы ВС и глюкозы уменьшаются. Если при ФГ 30 дневного волокна (30⁰С) целлюлазным комплексом из Trichoderma viride выход ВС составлял 16.8, то в 40 и 60 дневном возрасте это значение соответствует 15.3 и 8.9 мг/мл. Или же если при 50⁰С ФГ выходы ВС составили 28.0 мг/мл (1 атм.) и 40.1 мг/мл (120 атм.), то при ФГ 40 и 60 дневных волокон выходы ВС имели значения 25.2 и 14.9 мг/мл (1 атм.) и 36.1 и 21.4 мг/мл (120 атм.). Это можно наблюдать и для вариантов с двумя

Таблица 4 Сравнительные выходы ВС (мг/мл) при ФГ целлюлозы хлопковых волокон сортов и видов (время гидролиза 48 часов)

другими целлюлазными комплексами (Trichoderma reesei и Aspergillus niger). Это объясняется не содержанием целлюлозы, синтезируемой в процессе роста растений, а уплотнением надмолекулярной структуры от возраста волокон [Муратов Г., 1998], что подтверждается результатами электронно-микроскопических исследований.

Среди изученных целлюлазных комплексов самые высокие выходы ВС при равнозначном возрасте приходится на ФГ хлопковой целлюлозы в присутствии Trichoderma viride. Самые минимальные выходы ВС и глюкозы были получены при ФГ хлопковой целлюлозы в присутствии Aspergillus niger. Это, по-видимому, связано с активностью целлюлазных ферментов. Аналогичная закономерность была отмечена при ФГ при температурах 40, 50 и 60⁰С. Максимальные выходы ВС наблюдаются при температуре 50⁰С во всех изученных вариантах. Дальнейшее увеличение температуры реакции ФГ приводит к уменьшению выходов ВС. Это, по-видимому, связано с понижением активности целлюлаз при высоких температурах. Аналогичные результаты были получены в работе [Kamat et al., 1995], в которой изучалась активность ферментов при различных температурах проведения ФГ. Было установлено, что целлюлазные ферменты начинают терять свою активность при температуре выше 45⁰С.

Анализируя полученные данные по изучению влияния температуры на ход ФГ разновозрастных волокон хлопчатника, как в атмосферном, так и в СК давлении СО₂, установлено, что для получения высоких выходов ВС и глюкозы оптимальной температурой является проведение реакции при 50⁰С. Зависимость влияния температуры на выходы ВС хорошо иллюстрируются на гистограммах (рис. 4).

Было подробно изучено влияние продолжительности процесса проведения ФГ хлопковой целлюлозы. Показано, что как в атмосферном, так и в СК состоянии выходы ВС, независимо от возраста волокон, при увеличении продолжительности реакции увеличивается. Так, например, если сравнить волокна сорта Ташкент-6 при 12 часовом гидролизе и давлении 1 атм. выходы ВС для 30-дневного возраста составляет 11.0 мг/мл, а для 40 и 60 дн. возрастов составляют 8.3 и 5.6 мг/мл соответственно. Аналогичная закономерность наблюдается и для волокон, подвергнутых гидролизу при СК давлении, с той разницей, что в данном случае количество выхода ВС несколько выше. Общая зависимость выходов ВС при ФГ волокон сорта Ташкент-6 от продолжительности процесса представлена на рис. 5.

Следующим важным процесс - зависимым фактором при ФГ является СК давление [Gregg et al., 1996, 1998]. Динамику выходов ВС при ФГ разновозрастных волокон видов и сортов хлопчатника в зависимости от СК давления проводили при 1, 100, 120, 140 и 160 атм.

Следует отметить, что ФГ целлюлозы хлопковых волокон в условиях СК давления СО₂ проводится впервые. В таблице 5 приведены некоторые результаты выходов ВС и глюкозы при ФГ целлюлозы разновозрастных

Рис. 4 Влияние температуры на выходы ВС при ФГ целлюлозы 30-дн. хлопковых волокон сорта Ташкент-6 в условиях атмосферного (1 атм.)

и в СК СО₂ (120 атм.) давления целлюлазами из Trichoderma viride (продолжительность гидролиза 48 часов)

Рис. 5 Выходы ВС при ФГ целлюлозы 30-дн. хлопковых волокон сорта Ташкент-6 в условиях атмосферного (1 атм.) и СК СО₂ (120 атм.) давления целлюлазами из Trichoderma viride

волокон сортов и видов хлопчатника при различных СК давлениях СО₂ целлюлазными комплексами различного происхождения. В данном случае в качестве субстрата использовали волокна двух возрастов, различающиеся резко по структуре целлюлозы волокон: 30 дневные (с аморфной структурой)

Таблица 5 Содержание целлюлозы, выходы ВС и глюкозы при ФГ целлюлозы хлопковых волокон при различных СК давлениях СО₂ целлюлазными комплексами различного происхождения (продолжительность гидролиза 48 часов)

и 60 дневные (с кристаллической структурой). В том и другом случае предварительную обработку не проводили. Установлено, что с повышением давления до 120 атм. выходы ВС и глюкозы повышались, а выше происходило падение этого показателя, как у 30 дн., так и у 60 дн. волокон. Это происходило независимо от скороспелости сортов и от содержания в них целлюлозы. Так, например, если выходы ВС и глюкозы у 30 дн. волокон сорта Омад при давлении 100 атм составили 29.4 и 13.2 мг/мл (Trichoderma viride), то у 60 дн. волокон они соответственно имели значения 20.5 и 7.1 мг/мл. При повышении давления до 120 атм. эти значения повышались по выходу ВС у 30 дн. волокон до 33.2 мг/мл, а увеличение давления при ФГ до 160 атм. приводило к понижению выхода ВС до 25.7 мг/мл, против 33.2 мг/мл (120 атм.). Аналогичное наблюдали и по выходу глюкозы. Если выход глюкозы у 30 дн. волокна сорта Омад при давлении 120 атм. имеет значение 14.3 мг/мл, то при давлении 160 атм. выход глюкозы падает до 8.3 мг/мл. Эта закономерность наблюдалась и при использовании целлюлазного комплекса из Aspergillus niger. Так, например, если выходы ВС и глюкозы у 30 дн. волокон сорта Омад при давлении 100 атм. составили 16.7 и 7.1 мг/мл, то у 60 дн. волокон эти показатели имели значения 6.9 и 3.1 мг/мл соответственно. Увеличение давления до 120 атм. приводило к повышению выходов ВС и глюкозы у 30 дн. волокон Омад до 20.0 мг/мл (ВС) и 7.1 мг/мл (глюкоза). Поднятие СК давления до 160 атм. приводило к понижению выходов до 10.2 (ВС) и 6.3 мг/мл (глюкоза) волокон данного возраста и сорта. Эта закономерность наблюдалась и для сортов С-6037 и С-7059 хлопчатника. По видимому, поднятие давления до 120 атм. положительно влияет на ход ФГ, увеличивая хороший доступ ферментов к плотным участкам субстрата, т.е. происходит хороший контакт участков поверхности субстрата и поверхности фермента. Из литературы также известно, что в данном случае может образоваться уксусная кислота (продукт частичной деструкции гемицеллюлоз субстрата), которая также может способствовать (катализировать) реакцию деполимеризации при ФГ [Синицын и др., 1988]. Дальнейшее повышение давления приводит к деформации структуры поверхности ферментного комплекса, а также уменьшает активность фермента. Аналогичное явление было отмечено и в работе Марти [Marty et all, 1990]. На основании полученных результатов установлено, что максимальный выход ВС и глюкозы при ФГ разновозрастных волокон хлопчатника при использовании целлюлазного препарата из Aspergillus niger наблюдался при СК давлении 120 атм. Влияние СК давления на выходы ВС при ФГ представлено на гистограмме (рис. 6).

При сравнительном изучении различных целлюлазных ферментов было установлено, что максимальные выходы по ВС и глюкозе были получены при ФГ 30 дн. волокон сортов и видов хлопчатника использованием целлюлазного препарата из Trichoderma viride при СК давлении 120 атм.

В целом при ФГ разновозрастных волокон сортов и видов хлопчатника в оптимальных условиях (СК давление СО₂ 120 атм., температура 50⁰С)

Рис. 6 Выходы ВС при ФГ целлюлозы 30-дн. хлопковых волокон сортов вида G. hirsutum L. при различных давлениях в СК СО₂ целлюлазами из Aspergillus niger

целлюлазами различного происхождения в зависимости от продолжительности реакции гидролиза установлена одинаковая закономерность. Существенное различие наблюдается лишь в количественных соотношениях выходов продуктов гидролиза. Самые большие выходы ВС и глюкозы отмечались при ФГ целлюлазами из Trichoderma viride, а самые низкие - из Aspergillus niger.

Таким образом, в результате исследований были определены оптимальные условия проведения эксперимента: давление 120 атм, температура 45-50^oC и продолжительность реакции 48 часов. Высокие выходы ВС и глюкозы получены под действием целлюлазных ферментов из Trichoderma viride, а самый лучший субстрат - 30-40-дневные хлопковые волокна изученных сортов и видов хлопчатника. Общие выходы ВС и глюкозы при ФГ в условиях СК СО₂ в 1.2 -1.4 раза были выше, чем при атмосферном давлении.

Глава 5. Биоконверсия целлюлозы разновозрастных волокон хлопчатника в этанол

В данной главе диссертационной работы приводится анализ результатов исследований по одновременному осахариванию и ферментации хлопковой целлюлозы разновозрастных волокон 5 сортов, относящихся к 3 видам хлопчатника. Важность и актуальность получения биоэтанола из целлюлозосодержащих отходов с использованием биотехнологических методов подробно обоснованы и описаны в обзоре литературы (глава 1.7). Следует отметить, что в настоящее время технология получения этанола в развитых странах мира является хорошо отработанной и базируется на двух принципиально разных процессах. Этанол может быть получен химическим путём высокотемпературной каталитической гидратацией этилена, получаемого из нефти и газа. Второй путь - биотехнологический, когда этанол получают как продукт ферментации сахарозы или крахмала с помощью микроорганизмов.

Обычный этанол и "топливный биоэтанол" являются одинаковым продуктом, произведенным с использованием различного сырья и технологических процессов. Получение обычного этанола ведут из крахмала, содержавшегося в зерновых культурах (типа кукурузы, пшеницы или сои). "Топливный биоэтанол" может быть произведен из широкого разнообразия целлюлозосодержащего сырья, включая сельскохозяйственные отходы (стеблей зерна, соломы хлебных злаков, выжимок сахарного тростника, опилок, бумажной целлюлозы и т.д.).

Как и при переработке зернового сырья, процесс гидролиза, при получении спирта из целлюлозы, необходим для выделения из биомассы простых сахаров, пригодных для сбраживания. Как известно, целлюлоза и гемицеллюлоза представляют собой сложные углеводные цепочки, называемые полисахаридами (длинные цепи простых сахаров). Эффективное разделение этих сложных полимерных структур на простые сахара, необходимые для получения спирта, является основой технологии производства этанола из целлюлозы.

Среди многочисленных методов производства спирта из целлюлозы можно выделить два основных варианта переработки, позволяющих получить пригодные для брожения в простые сахара: а) кислотный гидролиз - использует химический гидролиз целлюлозной биомассы с помощью различных кислот; б) ферментативный гидролиз - метод подразумевает предварительную предобработку биомассы паром, позволяющей подготовить целлюлозную структуру к ферментативному гидролизу.

Процесс получения этанола путём ФГ осуществляется в 2 стадии: первая - проведение самого процесса ферментативного гидролиза и вторая стадия - брожения. В последние годы широко проводятся исследования по модификации процессов ферментации, т.е. осуществление прямой конверсии целлюлозы в этанол. Один из путей модификации процесса ферментации состоит в одновременном проведении осахаривания и ферментации биомассы. При использовании ФГ целлюлозосодержащих материалов для получения сахаров, одновременное сбраживание позволяет устранить ингибирование целлюлолитических ферментов избытком сахаров (ингибирование ферментов этанолом сказывается в меньшей степени, чем ингибирование сахарами). Отсутствие ингибирующего эффекта, в свою очередь, даёт возможность использовать меньшие количества ферментов для осуществления гидролиза.

В своих исследованиях мы также провели НИР по изучению закономерностей получения биоэтанола из хлопковой целлюлозы волокон хлопчатника различной зрелости и видового происхождения, некоторые результаты которых будут представлены и обсуждены ниже. Следует отметить, что исследования были проведены в лаборатории «Суперкритические флюиды» факультета «Биохимическая инженерия и биотехнология» университета Аджоу (Южная Корея).

Для ферментативного осахаривания хлопковой целлюлозы в нашей работе, с целью определения эффективности ферментов при биоконверсии, мы использовали целлюлазные комплексы различного происхождения из Trichoderma viride, Trichoderma reesei и Aspergillus niger.

На примере биоконверсии хлопковой целлюлозы волокон сорта Омад изучали закономерности динамики выходов этанола (мг/мл) при ФГ целлюлазами из Trichoderma reesei и дрожжами Saccharomyces cerevisiae в зависимости от продолжительности гидролиза.

Анализ полученных результатов показал, что с увеличением продолжительности реакции выходы этанола и степень превращения целлюлозы увеличиваются. Следует здесь отметить, что при изучении кинетики ФГ хлопковой целлюлозы в зависимости от времени реакции нами было установлено, что максимальные выходы ВС и глюкозы соответствовали 48 часам. Дальнейшее увеличение времени гидролиза не приводило к увеличению выходов ВС и глюкозы. В данном случае, реакцию проводили до 36 часов, т.к. выходы этанола, независимо от происхождения целлюлазных ферментов, увеличиваются до 24 часов и незначительно до 30 часов. Дальнейшее проведение реакции приводило к существенному уменьшению выходов этанола. Пробы на анализ выходов этанола брали через каждые 6 часов и темпы выходов этанола во всём периоде проведения гидролиза были различными. Установлено, что выделение этанола начинается уже после 2 часового гидролиза. При гидролизе волокон сорта Омад (независимо от происхождения целлюлаз) для 30 дневных волокон при 2-х часовом гидролизе выделяется этанол: 3.0 мг/мл (Trichoderma viride); 3.7 мг/мл (Trichoderma reesei) и 1.2 мг/мл (Aspergillus niger), а степень конверсии соответственно составляет 4.1; 5.5 и 1.6 %. Аналогичная закономерность обнаружена и для 40 дневных волокон: 3.2 мг/мл (Trichoderma viride); 3.5 мг/мл (Trichoderma reesei) и 1.2 мг/мл (Aspergillus niger) при степени конверсии целлюлозы 3.7; 4.2 и 1.4%. При дальнейшем увеличении времени гидролиза до 24 часов наблюдается резкое повышение, как выхода этанола, так и степени конверсии целлюлозы. Прибавка составляет примерно 1.3-4.3 мг/мл. При 30 часовом гидролизе также повышается выход этанола, но прибавка составляет примерно 0.1-0.3 мг/мл. Дальнейшее увеличение времени реакции приводит к уменьшению выхода этанола от 1.2 до 2.8 мг/мл в зависимости от использования различных целлюлазных ферментов и возраста волокон. Вышеописанная закономерность хорошо проиллюстрирована на гистограммах (рис. 7).

Если говорить о завершении реакции одновременного осахаривания и ферментации (ООФ) за несколько короткий срок по сравнению с ФГ целлюлозы волокон без дрожжей можно отметить следующее. В реакционной камере кроме фермента и субстрата присутствуют жизнеспособные клетки (дрожжи), ферментирующие продукты гидролиза в спирт. Они должны иметь способность развиваться в условиях среды

Рис. 7 Выходы этанола при ООФ целлюлозы 30-дн. хлопковых волокон сорта Омад целлюлазами различного происхождения и Saccharomyces cerevisiae

проведения процесса ФГ. Т.е. в реакционной камере происходит 2 процесса, первый - ферменты, обладающие целлюлолитической активностью, второй - микроорганизмы, обладающие способностью сбраживать моно- или олигосахариды. В начале гидролиза образующиеся продукты первого процесса (глюкоза и ВС) немедленно перерабатываются дрожжами Saccharomyces cerevisiae, продуцирующими этанол. Следовательно, уже в начале гидролиза (через 2 часа) образуется этанол. Причём, чем больше продолжительность процесса, тем больше и выходы этанола. Однако, если без добавления дрожжей, образующиеся в результате ФГ глюкоза (высокие концентрации) ингибируют процесс ФГ, то данный способ обладает несомненным преимуществом: продукты гидролиза целлюлозы немедленно перерабатываются микроорганизмом, продуцирующим этанол. Следовательно, они не ингибируют активность целлюлолитических ферментов. Так как основной продукт брожения - этанол - является токсичным для дрожжей, то реакция прекращается уже через 24 часа, а не через 48 часов, как при выделении глюкозы и ВС без дрожжей. Отвод продуктов способствует протеканию процесса.

Максимальные выходы этанола и высокие степени конверсии были получены при ФГ целлюлозы 30 дн. волокон сорта Омад целлюлазами из Trichoderma reesei за 24 часа гидролиза. Это подтверждается также результатами исследований других учёных. В работе [Клёсов, 1987] отмечается, что при использовании целлюлаз из Trichoderma reesei с активностью по фильтровальной бумаге 2-5 ед/мл и предварительно обработанного субстрата в концентрации 5-25% по массе становится возможным осуществление прямой ферментации сахаров в этанол. Также отмечается, что мутантные штаммы Trichoderma reesei являются: эффективными продуцентами разнообразных ферментов, включая целлюлазы и ксиланазы; содержание внеклеточных ферментов исключительно высоко и целлюлаза из них уже промышленно вырабатывается во многих странах мира для этих целей (США, Россия, Япония, Дания и др).

При выявлении зависимости выходов биоэтанола от возраста волокон основное внимание уделили волокнам хлопчатника вида G. barbadense L., т.к. согласно результатам, описанным в предыдущих главах, высокие выходы глюкозы и ВС при ФГ разновозрастных волокон хлопчатника соответствовали именно волокнам вида G. barbadense L.

Зависимость выходов этанола при ФГ от возраста волокон наблюдается и сохраняется во всём периоде проведения процесса ФГ, т.е. с увеличением возраста волокон выходы этанола уменьшаются. Это явление было обнаружено уже в начале проведения реакции ФГ. Так, при 2 часовом гидролизе, если при ФГ 30 дн. волокон сорта Термез-31 выход этанола составляет 4.2 мг/мл, то при ФГ волокон 40 и 60 дн. возрастов выходы этанола соответственно составляют 4.0 и 2.7 мг/мл. Аналогичное можно отметить и для позднееспелого сорта Ашхабад-25, но, естественно, с меньшим выходом этанола учитывая содержание целлюлозы в волокнах. Так, если при ФГ 30 дн. волокна сорта Ашхабад-25 выход этанола составляет 3.5 мг/мл, то при ФГ волокон 40 и 60 дн. возраста выходы этанола имеют значения 3.3 и 1.3 мг/мл соответственно. Этому, по-видимому, способствует постепенная кристалллизация целлюлозы волокна в процессе роста и развития. Наблюдаемая закономерность в основном сохраняется во всём периоде процесса. Однако, количественные соотношения выходов этанола из 30 и 40 дн. волокон несколько меняются. Т.е. начиная с 6 часового гидролиза в абсолютном большинстве случаев выходы этанола из 30 дневных волокон немного меньше, чем из 40 дн. волокон. Предельно максимальные значения выходов этанола наблюдаются на 30 часовой период гидролиза. Однако, между выходами этанола при ФГ и продолжительностью реакции 24 и 30 ч. существенной разницы в практическом отношении не обнаружено.

Зависимость степени конверсии хлопковой целлюлозы волокон сортов хлопчатника вида G. barbadense L. от возраста хорошо проиллюстрирована на гистограммах, представленных на рис. 8.

В последние годы в УзНИИССХ проводятся научно-исследовательские работы по выращиванию хлопчатника в полях как второй культуры после зерновых. Несмотря на то, что при данном способе выращивания высевают в основном скороспелые сорта, всё же увеличиваются числа нераскрывшихся коробочек. Учитывая вышеизложенное в наших экспериментах мы, наряду с позднеспелыми сортами, использовали довольно новые скороспелые сорта Омад (вид G. hirsutum L.) и Термез-31 (вид G. barbadense L.). Для сравнения и определения закономерностей биоконверсии хлопковой целлюлозы в этанол в видовом разрезе изучали и сорт С-7059 (вид G. arboreum L.). Некоторые данные по выходам в этанол при ФГ хлопковой целлюлозы разновозрастных

Рис. 8 Степень конверсии целлюлозы хлопковых волокон сортов Термез-31 и Ашхабад-25 целлюлазами из Trichoderma reesei и Saccharomyces cerevisiae

волокон сортов и видов хлопчатника целлюлазами из Trichoderma reesei и дрожжами Saccharomyces cerevisiae приведены в таблице 6. Следует отметить, что условия проведения (время гидролиза, температура и давление) были одинаковы. Из таблицы видно, что у всех изученных 30-дневных волокон содержание целлюлозы ниже, чем у 40 дневных. Но выходы этанола практически были одинаковыми для каждого индивидуального сорта. При взаимном межсортовом сравнении наблюдаются определённые отличия в количестве выходов этанола и в степени конверсии хлопковой целлюлозы. Так, например, если для 30 и 40 дневных волокон сорта Омад выходы этанола составляли 13.9 и 14.0 мг/мл, то для волокон Термез-31 (при данных возрастах) имели значения 15.9 и 16.0 мг/мл соответственно. Или же, если для сорта 149-Ф выходы этанола при данных возрастах составляли 14.7 и 14.8 мг/мл, то для волокон Ашхабад-25 имели значения 15.5 и 16.2 мг/мл. Аналогичное можно сказать относительно степени конверсии хлопковой целлюлозы в этанол. Так, например, если степень конверсии для 30 и 40 дн. волокон составляли 18.9 и 16.6% (сорт Омад) и 19.5 и 16.5 % (сорт 149-Ф), то для волокон вида G. barbadense L. имели значения 21.4 и 19.1 (сорт Термез-31) и 21.7 и 18.8 % (сорт Ашхабад-25). Выходы этанола и степень конверсии хлопковой целлюлозы волокон вида G. arboreum L. в количественном отношении приближаются к волокнам вида вид G. hirsutum L. Отсюда следует, что волокна видов G. hirsutum L., G. barbadense L. и G. arboreum L., имея одинаковый характер расщепления при ФГ, различаются в степени конверсии в этанол. Причём, показано, что, несмотря на различный темп накопления целлюлозы в волокнах сортов Омад (73.2 и 84.3%) и С-7059 (75.0 и 87.0%), выходы этанола при биоконверсии их целлюлозы практически одинаковы. Некоторое различие в степени конверсии объясняется различной структурой самих волокон.

Таким образом, используя хлопковую целлюлозу 30 и 40 дн. волокон хлопчатника в качестве субстрата, целлюлаз из Trichoderma reesei в качестве фермента и дрожжей Saccharomyces cerevisiae путём ООФ впервые достигнута высокая степень конверсии хлопковой целлюлозы в биоэтанол, что по выходу составляет 21.7% или 30.4% от теоретического.

Таблица 6 Динамика выходов этанола при ООФ целлюлозы хлопковых волокон сортов и видов хлопчатника целлюлазами из Trichoderma reesei и дрожжами Saccharomyces cerevisiae

Разработанные теоретические положения и новые результаты, полученные на основе биоконверсии хлопковой целлюлозы, могут быть в перспективе внедрены в практику для переработки целлюлозосодержащих отходов промышленности и сельского хозяйства с целью получения глюкозы, ВС, биоэтанола и др. полезных низкомолекулярных продуктов. В связи с этим нами предлагается принципиальная технологическая схема (рис. 9) получения глюкозы и биоэтанола. Она состоит из двух частей. В первой представлена схема получения глюкозы от сбора до её рафинирования, включая измельчение сырья и ФГ (рис. 9 А). ФГ может быть осуществлён как в атмосферном, так и в условиях СК СО₂ давления. Оптимальные условия, рекомендуемые для технологии проведения процесса ФГ, подробно описаны и приведены в работе. Совместное использование обоих частей схемы отражают получение биоэтанола (рис. 9 АБ).

Предлагаемая схема позволяет повысить эффективность биоконверсии целлюлозосодержащих отходов и проведения процесса ФГ, т.к. она исключает стадию предварительной обработки сырья (субстратов) перед проведением ФГ из существующей методики процесса гидролиза. Это

позволяет существенно сократить объём затрат на процесс проведения ФГ. Данная технологическая схема процесса ФГ может быть использована не только для отходов хлопковой целлюлозы, но и других отходов целлюлозосодержащей биомассы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Цель и задачи, поставленные в диссертационной работе, решены полностью. Впервые выполнен системный анализ особенностей проведения ферментативной конверсии целлюлозы разновозрастных волокон трёх видов восьми сортов и двух внутривидовых гибридов хлопчатника. Подробно изучены и проанализированы влияние таких факторов, как: скороспелость сортов, возраст и местоположение волокон (коробочек) на кусте; продолжительность реакции гидролиза; влияние температуры; давления, а также различных целлюлазных ферментных комплексов и др. Установлены общие и отличительные особенности закономерности процессов ФГ от видового происхождения хлопковой целлюлозы. Показано, что на гидролизуемость и степень превращения хлопковой целлюлозы в ВС и глюкозу большое влияние оказывает место формирования волокна на плодовых ветвях растения. В работе представлены абсолютные количественные показатели выходов ВС и глюкозы, а также степени конверсии при ФГ хлопковой целлюлозы разновозрастных волокон, собранных из различных плодовых ветвей. Подтверждено, что эффективность ФГ целлюлозы и целлюлозосодержащих материалов в значительной степени зависит от уровня кристалличности целлюлозных субстратов. Учитывая это, в работе впервые проведено последовательное световое и электронно-микроскопическое изучение структурных организаций, выделенных из гидролизатов после ФГ хлопковой целлюлозы разновозрастных волокон сортов и видов хлопчатника. На основе этих исследований впервые предложен механизм расщепления волокон хлопчатника на надмолекулярном уровне при ФГ. В работе впервые использована новая методика проведения процесса ФГ целлюлозы волокон различных сортов и видов хлопчатника в условиях СК СО₂ и обсуждаются результаты эффективности её действия на выходы продуктов гидролиза. Новая методика проведения исследований процесса ФГ целлюлозы была разработана автором в лаборатории «Суперкритические флюиды» кафедры «Биохимической инженерии и биотехнологии» университета Аджоу (Южная Корея). При использовании новой методики, во всех вариантах экспериментов, общие выходы ВС и глюкозы в 1.2 -1.4 раза были выше, чем в обычных условиях. Разработанные теоретические положения и новые результаты, полученные на основе ферментативной и биоконверсии хлопковой целлюлозы, могут быть в перспективе внедрены в практику для переработки целлюлозосодержащих отходов промышленности и сельского хозяйства с целью получения глюкозы, ВС, биоэтанола и др. полезных низкомолекулярных продуктов. В связи с этим в работе предлагается принципиальная технологическая схема получения глюкозы и биоэтанола, которая позволит повысить эффективность проведения процессов ферментативной и биоконверсии целлюлозосодержащих отходов, исключением стадии предварительной обработки сырья (субстратов) перед проведением ФГ из общепринятой методики процесса гидролиза. Результаты экспериментальных исследований работы представляют практический интерес также в плане разработки и создания устройств-реакторов для проведения процесса ФГ целлюлозосодержащего сырья. Другим важным в практическом отношении достоинством работы является то, что в качестве возможного нового источника целлюлозы, для последующего превращения в полезные низкомолекулярные продукты, впервые предложены незрелые волокна хлопчатника осенне-зимнего сбора. Они, имея в своем составе 70-85 % целлюлозы, в значительных количествах остаются непереработанными. Учитывая аморфную структуру их целлюлозы, они могут быть подвергнуты ФГ с высокой степенью конверсии, без предварительной декристаллизации.

Выводы

1. Впервые проведены сравнительные исследования условий, режимов, стадий проведения процесса ферментативной конверсии целлюлозы разновозрастных хлопковых волокон 3 видов (G. hirsutum L., G. barbadense L. и G. arboreum L.), 8 сортов, 2 внутривидовых гибридов в атмосферном, суперкритическом СО₂ давлениях и определено влияние субстрат-, фермент- и процесс-зависимых факторов.

2. Разработана и показана эффективность принципиально новой методики проведения процесса ФГ целлюлозы хлопкового волокна в условиях СК СО₂. Показано, что использование данного метода приводит к повышению в среднем от 20 до 40% выхода продуктов гидролиза по сравнению с атмосферными условиями для всех изученных волокон и этому явлению дано объяснение.

3. Установлена роль кристаллизации целлюлозы в процессе формирования хлопкового волокна, а также прямая корреляционная зависимость между степенью кристалличности и эффективностью ферментативной конверсии. Выявлено, что выходы низкомолекулярных веществ при ФГ целлюлозы хлопкового волокна в возрасте 30-40 дней больше, чем в ранние периоды роста и периоды созревания хлопчатника, что обусловлено различными этапами кристаллизации целлюлозы в процессе роста и созревания волокон.

4. На основе привлечения методов световой и электронной микроскопии выявлены механизм и характер расщепления целлюлозы хлопковых волокон при ФГ на надмолекулярном уровне. Установлено, что формы и размеры расщеплённых кристаллических частиц при ФГ, для целлюлозы волокон раннего возраста - до 20 дней (G. hirsutum L., G. arboreum L.) и 25 дней (G. barbadense L.) идентичны. Главные различия в указанных параметрах происходят начиная с 25 дневного возраста, независимо от видового и сортового разнообразия образцов.

5. Исследовано и научно обосновано влияние скороспелости и местоположения хлопковых волокон на ферментативную гидролизуемость. Показано, что выходы продуктов гидролиза выше у позднеспелых сортов, чем у скороспелых, а у гибридов F₁ (=среднеспелых) они превышают значения как скоро-, так и позднеспелых сортов. Найдено, что у волокон верхних плодовых ветвей выходы низкомолекулярных продуктов, а также степени их конверсии при ФГ в 1.5-1.7 раза выше, чем у волокон нижних плодовых ветвей. Это объясняется различиями процессов биосинтеза целлюлозы и такие закономерности характерны для всех изученных образцов.

6. Установлено, что целлюлоза хлопковых волокон видов G. hirsutum L., G. barbadense L., G. arboreum L. и их внутривидовые гибриды, имея одинаковый характер расщепления при ФГ, различаются в выходах и степени конверсии целлюлозы. Показано, что волокна вида G. barbadense L. в 1.5-2 раза легче подвергаются гидролизу, чем из видов G. hirsutum L. и G. arboreum L. При этом условные «пики-максимумы» и «пики-минимумы» выходов ВС и глюкозы у вида G. barbadense L. проявляются на 5 дней позже, чем у других видов.

7. Определены оптимальные условия проведения ФГ и степени конверсии хлопковой целлюлозы, без предварительной обработки, в атмосферных (а) и в условиях СК давления СО₂ (б): а) возраст волокон 30-40 дней, смесь ферментов целловиридина и пектофоетидина, температура 40-50⁰С, время гидролиза 48 часов; б) возраст волокон 30-40 дней, целлюлаза из Trichoderma viride, давление 120 атм., температура 45-50⁰С, продолжительность гидролиза 36-48 часов. В указанных условиях достигнута максимальная степень конверсии.

8. Впервые осуществлён процесс одновременного осахаривания и ферментации целлюлозы хлопковых волокон в виде одностадийного процесса. Показано, что он по сравнению с двустадийным процессом имеет преимущество в снижении общего времени гидролиза. Используя целлюлозу 30-40 дн. волокон хлопчатника в качестве субстрата, целлюлаз из Trichoderma reesei в качестве фермента и дрожжей Saccharomyces cerevisiae путём ООФ, достигнута степень конверсии в биоэтанол 21.7% или 30.4% от теоретического.

9. Целлюлоза незрелых хлопковых коробочек - «курак» (30-40 дн. возраста), которая в осенне-зимний период практически остаётся в виде отходов на полях республики, рекомендуется в качестве дешёвого, многотоннажного и потенциального сырья (субстрата) для ферментативной конверсии. Разработана технологическая схема получения глюкозы и биоэтанола из «курака», которая исключает стадию предварительной обработки сырья из общепринятой методики процесса ФГ. Необходимые технические условия проведения процесса переданы технологам (НПП «Тегирмон») для разработки соответствующей опытно-промышленной установки.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

Монография:

1. Муратов Г.А. Ферментативная конверсия хлопковой целлюлозы. Ташкент: ООО «Мехридарё», 2007. - 206 с. (13 п. л.).

Статьи, опубликованные в научных журналах и сборниках:

2. Муратов Г.А., Юлдашев Б. Т., Рахимов М. М. Ферментативный гидролиз хлопковых волокон сортов и гибрида вида G.hirsutum L. // Узб. биол. ж. - Ташкент, 1997.- № 4.- С.45-48.

3. Муратов Г.А., Рахимов М. М. Сравнительная ферментативная гидролизуемость волокон хлопчатника видов G. hirsutum L. и G. barbadense L. // Узб. биол. ж. - Ташкент, 1998.- №4.- С.45-47.

4. Муратов Г.А., Рахимов М. М., Юлдашев Б. Т., Муратов А.М. Влияние кристаллитов целлюлозы на деградацию разновозрастных волокон хлопчатника при их ферментативном гидролизе // Доклады АН РУз. - Ташкент, 1998.- №4.- С.37-40.

5. Муратов Г.А., Рахимов М. М., Юлдашев Б. Т. Ферментативный гидролиз хлопковых волокон. // Прикладная биохимия и микробиология. - Москва, 1998.- № 34 (5).- С.525-528(рус), - С.477-479(eng).

6. Gayrat Muratov and Chul Kim. Enzymatic hydrolysis of cotton fibers in supercritical CO_{2 .}// Biotechnology and Bioprocess Engineering. - Seoul (South Korea), 2002.- Vol.7.- №2.- P. 85-88.

7. Muratov G., Kim C. Producing of sugars by biodegradation of cotton fibers in supercritical CO₂ // Сoll. articles: Second Regional Conference on Energy Technology towards a Clean Environment. - Phuket (Thailand), 2003.- Vol.1.- P.304-308.

8. Муратов Г.А. Чи?индидан ма?сулот ёки глюкоза ва ?анд моддалари олишда янги хомашё хусусида //Ж. Ўзбекистон ?ишло? ?ўжалиги. - Тошкент, 2007.- №3.- 19 б.

9. Муратов Г.А. Пахта чи?индисидан шакар // Ж. Ўзбекистон ?ишло? ?ўжалиги. - Тошкент, 2007.- №9.- 18 б.

10. Муратов Г.А. Ферментативное расщепление незрелых волокон сортов хлопчатника вида G. hirsutum L. // Ж. Вестник Аграрной Науки Узбекистана. - Ташкент, 2007.- №1-2(27-28).- С.73-75.

11. Муратов Г.А. Биодеградация целлюлозы разновозрастных волокон тонковолокнистых сортов хлопчатника вида G. barbadense L. // Узб. биол. ж. - Ташкент, 2007.- №4.- С.26-29.

12. Муратов Г.А., Ким Ч. Эффект суперкритического давления СО₂ на биоконверсию волокон сортов различных видов хлопчатника // Узб. биол. ж. - Ташкент, 2007.- №4.- С.31-35.

13. Муратов Г.А. Биоконверсия недозревших хлопковых волокон сортов вида G. hirsutum L., собранных из различных симподиальных ветвей // Доклады АН РУз. - Ташкент, 2007.- №5.- С.79-81.

14. Муратов Г.А. Целлюлозосодержащие отходы хлопководства Узбекистана как перспективное сырьё для получения биоэтанола //Ж. Агро илм. - Ташкент, 2007.- №2. - С.8.

15. Муратов Г.А. Недозрелые зеленые коробочки хлопчатника // Ж. Ўзбекистон ?ишло? ?ўжалиги. - Ташкент, 2007.- №11.- С.18.

16. Муратов Г.А. Биоконверсия хлопковой целлюлозы до глюкозы под действием суперкритического давления СО₂ // Химия природных соединений. - Ташкент, 2007.- №5.- С.529-530.

17. Муратов Г.А., Рахимов М. М., Муратов А.М. Электронно-микроскопические исследования гидролизатов волокон сортов хлопчатника вида G. barbadense L. // Ж. Вестник НУУЗ. - Ташкент, 2007.- №4.- С.143-145.

18. Рахимов М. М., Муратов Г.А. Обзор современного состояния проблемы получения биоэтанола в мире и перспективы этого направления в республике Узбекистан // Ж. Вестник Аграрной Науки Узбекистана. - Ташкент, 2007.- №1-2(27-28).- С.107-110.

19. Муратов Г.А. Ферментативная конверсия хлопковой целлюлозы в глю-козу и сахаристые вещества // Узб. биол. ж.- Ташкент, 2008.- №3.- С.31-33.

20. Муратов Г.А. Биоконверсия хлопковой целлюлозы в этанол // Доклады АН РУз. - Ташкент, 2008.- №3.- С.72-74.

21. Muratov G.A., Кim С. Utilization of Supercritical Fluids in Enzymatic Conversion of Cotton Biomass // Research Progress in Biotechnology. - New York, 2008. Nova Biomedical Books. - P. 35-40.

22. Муратов Г.А. Сравнительная оценка влияния атмосферного и суперкритического давления СО₂ на биодеградацию целлюлозы волокон хлопчатника // ?ўза, беда селекцияси ва уру?чилиги илмий ишлар тўплами - Ташкент, 2009.- №28.- С.145-150.

Тезисы научных докладов:

23. Муратов Г.А., Юлдашев Б.Т., Рахимов М.М. Ферментативный гидролиз волокон сортов и гибрида хлопчатника в период их развития // Тез. докл. 3 конф. биохимиков Узбекистана. - Ташкент, 1996.- С.135.

24. Муратов Г.А., Юлдашев Б.Т., Рахимов М.М. Сравнительное микроскопическое изучение механизма процессов кислотного и ферментативного гидролиза хлопкового волокна // Амир Темурнинг 660 йиллигига багишланган Ёш олимлар ва талаб. II-Респ. Илмий конф. тезислари туплами. - Тошкент, 1996.- С.35.

25. Муратов Г.А., Юлдашев Б.Т. Хар ?ил навли ва дурагай пахта толаларини ўсиш даврида ферментлар ёрдамида парчалаш // «Организмдаги модда алмашинуви жараёнларига физик ва кимёвий омилларнинг таъсири», номли ?ал?аро илмий анжуман материаллари.- Андижон, 1997. 2К.- 110 б.

26. Muratov G.A. Comparative biodegradation of cotton fibers by enzymes of cellulase complex // Proceedings of Intern. Conf. of Fund. Sci. «Lomonosov-2000», Moscow State University. - Moscow, 2000.- Р.48.

27. Гайрат Муратов, Чул Ким. Ферментативный гидролиз разновозрастных волокон хлопчатника катализирующихся четыреокисью углерод...