Лазерный флуориметрический детектор со сверхвысокой чувствительностью для приборов капиллярного электрофореза

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

УДК 543.423:543.545

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

Лазерный флуориметрический детектор со сверхвысокой чувствительностью для приборов капиллярного электрофореза

05. 11. 13 - Приборы и методы контроля природной среды, веществ, материалов и изделий.

кандидата технических наук

Козулин Роман Анатольевич

Санкт-Петербург, 2007

Работа выполнена в Институте аналитического приборостроения РАН.

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук,

профессор: Золотарёв Владимир Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор технических наук: Горбунов Г.Г. (ВНЦ ГОИ им. Вавилова)

доктор физико-математических наук,

профессор: Земский В.И. (СПбГУ ИТМО)

ХХХХ

Ведущая организация: ФГУП «Гос НИИ БП» (Москва)

Защита состоится 17 апреля 2007г. в 17 ³⁰ часов на заседании диссертационного совета Д.212.227.01 в Санкт-Петербургском государственном университете информационных технологий, механики и оптики по адресу: 190000, Санкт-Петербург, пер. Гривцова 14, ауд. 314а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан «____»______________2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат технических наук В.М. Красавцев

излучение краситель капиллярный электрофорез

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Практическая потребность в аналитических средствах, использующихся в медицине, химии, биотехнологии и экологии, основанных на чувствительных и высокоэффективных методах анализа и контроля твёрдых и жидких сред вызвала интенсивное развитие комбинированных методов. В этих методах совмещены стадии предварительного концентрирования и разделения сложных смесей на компоненты, а также способы качественного и количественного определения искомых компонент. Среди этих методов разделения веществ важное значение занимает электрофорез, получивший всеобщее признание как наиболее удобный для исследования образцов, представляющих собой сложные многокомпонентные смеси неизвестного состава. Современные технические приемы, используемые в электрофорезе, в общем случае можно разделить на две большие части по принципу проведения процесса - это электрофорез на плоскости (классический) и капиллярный электрофорез. Быстрое развитие техники капиллярного электрофореза (КЭ) было обусловлено разработкой высококачественных кварцевых капилляров с равномерным внутренним диаметром 10-200 мкм, имеющих высокую прозрачность в УФ-области. В результате этого удалось улучшить как разделение многокомпонентных смесей, так и возможности детектирования отдельных компонент. Специфической особенностью КЭ является малая по объему измерительная ячейка, определяемая внутренним диаметром капилляра, вследствие чего возникают проблемы, связанные с низким уровнем полезного сигнала.

В последние годы КЭ наиболее активно и успешно применяется для определения последовательности ДНК, изучении наследственности, мутаций и в других генетических исследованиях. Такие исследования, как правило, характеризуются малыми количествами пробы и низкими концентрациями исследуемого вещества. В силу этой особенности, а также учитывая малый объём измерительной ячейки необходимо дальнейшее совершенствование эксплуатационных характеристик систем КЭ и повышение чувствительности детектирования.

Целью диссертационной работы является создание флуориметрического детектора с высокой чувствительностью, предназначенного для использования в приборах капиллярного электрофореза.

Для достижения указанной цели необходимо решить следующие задачи:

- Изучить влияние отражённого от капилляра излучения на чувствительность измерений;

- Разработать оптическую систему детектора, обеспечивающую прецизионную автоматическую юстировку излучения, возбуждающего флуоресценцию в центре капилляра и оптимизировать элементы детектора;

- Исследовать процесс фоторазложения красителей, используемых в приборах КЭ в качестве флуоресцентных меток, при их взаимодействии с лазерным излучением, с целью оптимизации условий измерений, обеспечивающих достижение наибольшей чувствительности;

- Разработать на основе полученных результатов приборы КЭ для лабораторных биохимических анализов с чувствительными флуориметрическими детекторами на базе лазерных источников возбуждения.

Научная новизна.

1. Разработана оригинальная схема флуоресцентного детектора для КЭ, обеспечивающая высокую чувствительность за счёт оптимизации условий освещения цилиндрического капилляра.

2. Предложена оригинальная схема автоматической фокусировки лазерного луча точно в центр капилляра с помощью многоэлементного фотоприёмника, основанная на совмещении пучков, отражённых от 4-х поверхностей капилляра.

3. Показано, что для достижения наибольшей чувствительности флуоресцентных измерений константа скорости поглощения света молекулой, используемой в качестве флуоресцентной метки, должна быть близкой по величине к константе скорости флуоресценции.

Практическая ценность работы.

В работе были получены следующие результаты, получившие внедрение в конкретные разработки приборов КЭ:

- предложена базовая оптическая схема флуориметрического детектора, отличающаяся низкой фоновой засветкой фотоприёмника и прецизионной автоматической юстировкой лазерного луча в центр капилляра;

- на основе проведённых в работе исследований предложена практическая методика по определению оптимальной интенсивности возбуждающего света для систем КЭ.

- разработаны системы капиллярного электрофореза с одноканальным и четырёхканальным флуоресцентными детекторами.

Основные результаты, выносимые на защиту.

1. Показано, что условия освещения кварцевого капилляра и способ автоматической юстировки луча лазера в центр капилляра, предложенные в работе, позволяют достичь предельной чувствительности анализа в приборах КЭ, использующих флуоресцентные детекторы.

2. Показано, что выбор мощности источника возбуждения флуоресценции рекомендуемой для использования в приборах КЭ, полученный на основе проведенных в работе исследований, имеет благодаря минимизации уровня шума оптимальное значение, при котором обеспечивается наибольшая светоотдача флуоресцентных красителей, что обеспечивает повышение чувствительности анализа в тех случаях, когда молекулы имеют высокую электрофоретическую скорость.

3. Методика, позволяющая определять оптимальную мощность возбуждения флуоресцентной метки в капилляре применительно к анализу молекул в тех случаях, когда их электрофоретическая скорость низкая.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на семинарах лаборатории в Институте Аналитического Приборостроения РАН (С.-Петербург), а также были представлены на Всероссийской конференции «Химический анализ веществ и материалов» (Москва, 11-15 апреля 2000); научной и учебно-методической конференции СПбГУ ИТМО (С.-Петербург 3-6 февраля 2004).

Публикации. Основные результаты диссертационной работы опубликованы в 6 статьях и тезисах докладов, а также получен патент на изобретение.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырёх глав, заключения, списка литературы и приложения. Работа изложена на 105 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков, 4 таблиц и 69 библиографических ссылок на литературу.

Краткое содержание работы

Во введении обосновывается актуальность работы, сформулированы цель и задачи работы и перечислены защищаемые положения, отмечена научная новизна и практическая значимость.

В первой главе приводится анализ тематической литературы, определяющей основные задачи настоящей работы. Даётся коротко описание процессов, происходящих в капиллярном электрофорезе, и отмечены особенности детектирования в капилляре, который представляет собой гибкое кварцевое волокно с пустой центральной частью диаметром от 30 до 200 мкм. Рассмотрены различные принципы построения оптических детекторов для КЭ с различными оптическими схемами. Приведены предельные минимальные концентрации, которые можно обнаруживать при данных схемах детектирования.

Наиболее часто встречающимися в КЭ и, во многих случаях, наиболее дешевыми являются фотометрические детекторы. Существует множество вариантов фотометрических детекторов. Они могут работать на одной длине волны или на нескольких одновременно или последовательно (детекторы с линейкой фотодиодов в качестве фотоприемника, детекторы со сканирующим дисперсионным элементом). Однако фотометрирование в принципе не позволяет достичь в капилляре высокой чувствительности.

Гораздо более высокую чувствительность по сравнению с фотометрированием имеют флуориметрические детекторы. Больший прогресс в увеличении чувствительности флуоресценции достигнут благодаря применению лазеров с их уникальными свойствами: высокими мощностью и пространственной когерентностью, что позволяет сосредотачивать максимальную интенсивность возбуждающего излучения в минимальном объеме. Высокая чувствительность флуоресцентных систем, бесспорно, определила их использование для высокочувствительных исследований в системах КЭ.

Во второй главе рассмотрены различные спектральные диапазоны с целью выбора наиболее подходящего для достижения максимальной чувствительности флуориметрического детектирования в КЭ. УФ и ИК-диапазоны менее всего подходят для возбуждения и регистрации флуоресценции в капилляре в силу отсутствия подходящих источников излучения, флуоресцентных меток, оптически прозрачных материалов, а так же сложности юстировки невидимого излучения в микрообъёмы. Анализ показал, что флуоресцентное детектирование в ближней-ИК области является наиболее подходящим вариантом в плане достижения максимальной чувствительности, так. как в этом случае обеспечивается максимальное устранение паразитного фона, обусловленного Релеевским и комбинационным рассеянием растворителя пробы и капилляра, а также флуоресценцией оптических сред и примесей анализируемой пробы.

Исследование ортогональных схем освещения капилляра возбуждающим излучением лазера показало, что отражённый свет является главным фактором, снижающим чувствительность флуоресцентного детектирования. Используя формулы Френеля, получена интегральная оценка отражённого от капилляра излучения, попадающего на фотоприёмник измерительного канала Расчеты показывают, что интенсивность отражённого света на 9 порядков выше интенсивности флуоресценции одной молекулы красителя, и это является существенным препятствием в достижении предельной чувствительности. Более 2/3 отражённой интенсивности приходится на участок полного внутреннего отражения (ПВО) от внутреннего диаметра капилляра. Следовательно, диаметр d сфокусированного луча следует определять из условия:

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

,

где d_k внутренний диаметр капилляра, п_ж и n_кв показатели преломления жидкости в капилляре и кварца.

Оптическая схема детектора приведена на рис. 1. Для максимального устранения отражённого от капилляра света излучение лазера в оптической схеме детектора падает на капилляр под углом Брюстера к его оси (рис. 2), что снижает отражения от стенок капилляра и выводит отражённые лучи лазера из угла сбора флуоресценции, которая собирается сферическим зеркалом. Далее флуоресценция проходит через светофильтры, подавляющие отражённое и рассеянное излучение лазера, и фокусируется на площадку фотодиода. Такая схема позволила зарегистрировать 75 молекул в пробе с концентрацией нафталоцианинового красителя 10^-12 М.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Отражённый свет можно использовать для юстировки луча лазера в центр капилляра. При перемещении луча поперёк оси капилляра будет наблюдаться расхождение в противоположные стороны двух пучков лучей отражённого света. Они появляются при отражении от передней и задней поверхности внешнего диаметра капилляра (рис. 3). Хотя свет отражается также и от внутренней поверхности, которая заполнена водой, но его интенсивность более чем в 10 раз слабее и поэтому он менее заметен.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Когда падающий луч проходит через центр капилляра, оба отражённых луча совпадают и находятся в одной плоскости с падающим лучом и осью капилляра. Такая картина однозначно определяет положение луча лазера точно в центре капилляра.

Для автоматического определения положения луча в капилляре необходимо отслеживать эти отражённые лучи. С этой целью в детектор вводится канал юстировки в виде ПЗС-матрицы, установленной в плоскости возбуждающего луча и оси капилляра, фоточувствительная площадка которой направлена к отражённым лучам. Анализируя положение лучей на ПЗС-матрице происходит автоматическое выравнивание положения луча лазера точно в центре капилляра.

Третья глава посвящена оптимизация условий измерения в капилляре при лазерном флуоресцентном детектировании.

В качестве способа увеличения потока флуоресценции с целью повысить чувствительность можно повышать мощность возбуждающего света. Предполагается, что с ростом мощности возбуждения интенсивность флуоресценции и скорость фотодеструкции красителя будут возрастать линейно, что верно для слабых потоков возбуждения. Но, если плотность потока фотонов столь велика, что среднее время между их прохождением через площадку, численно равную сечению поглощения молекулы, меньше времени жизни молекулы в возбуждённом состоянии, то молекула не успевает вернуться в основное состояние к моменту попадания в неё следующего фотона, который, следовательно, не поглотится. Такой процесс вызовет насыщение возбуждённого состояния молекулы и нелинейную зависимость флуоресценции от мощности возбуждения. Т.к. интенсивность фона, обусловленная рассеянием, в отличие от флуоресценции, не насыщается, то увеличение мощности возбуждения с какого-то момента приведёт только к увеличению фона. Кроме того, свойство флуоресцентных красителей распадаться под действием света приводит к тому, что флуоресцирующее вещество может в значительной степени израсходоваться при измерении, что приведёт к заниженной величине сигнала. В силу этих факторов, длительность и мощность возбуждающего излучения являются двумя критическими параметрами для оптимизации индуцированной лазером флуоресценции в КЭ.

В системах КЭ время взаимодействия излучения лазера с веществом может быть относительно длительным, однако фоторазложение приводит к конечному количеству актов флуоресценции. Относительную скорость фоторазложения красителя за интервал времени dt можно записать как:

.(1)

что имеет решение:

(2)

где с₀ - начальная концентрация красителя, с - конечная концентрация, - молярная экстинкция красителя, - интенсивность возбуждающего света, - квантовый выход деструкции.

На рис. 4 представлены теоретические кривые относительных концентраций, рассчитанные согласно (2), для разных мощностей лазера.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Выражение (2) хорошо подтверждается экспериментами, проведёнными при мощности 20 мВт (точки на кривой 20 мВт) и при фокусировке луча в диаметр 25 мкм. Скорость красителя менялась от 0,01 до 0,7 мм/с. Квадратиками на кривых обозначены значения . Эксперименты и расчеты проводились при ширине зоны облучения 25 мкм. Незначительное отклонение точек вверх в конце кривой может быть связано с гауссовым профилем луча лазера. Видно, что при увеличении интенсивности лазера, следует увеличивать скорость потока, чтобы избежать заметного выгорания красителя.

Так как интенсивность флуоресценции пропорциональна мощности возбуждения при отсутствии насыщения, поток фотонов за секунду, испускаемый молекулой с квантовым выходом и с учётом фоторазложения можно записать в виде:

,(3)

где сс₀ определяется из (2).

Теоретически, повышая мощность возбуждения и скорость движения молекулы через зону облучения можно бесконечно увеличивать поток флуоресценции, а также скорость фотораспада . Однако, для (3) имеется ограничение, связанное с тем, что при мощном возбуждении, приводящем к обеднению основного состояния, длительность акта поглощение-испускание ограничивается скоростями переходов между энергетическими уровнями молекулы. В этом случае флуоресценция и скорость фотораспада перестают возрастать линейно и будет иметь место насыщение. Необходимо учесть эту особенность для более точного описания распада красителя при движении в капилляре и выборе оптимальной мощности возбуждения.

Рассмотрим систему энергетических уровней красителя (рис. 5). Будем исходить из того, что фотодеструкция происходит из состояния S₁. Поглощая фотон, молекула переходит из основного состояния S₀ в первое возбужденное синглетное состояние S₁ с константой скорости поглощения

(4)

Попав на верхние колебательные уровни любого возбуждённого состояния молекула быстро безызлучательно теряет энергию с константой скорости (волнистая стрелка), переходя на уровень S₁. Из состояния S₁ молекула может вернуться в состояние S₀ испуская излучение с константой скорости флуоресценции , или может произойти безызлучательный переход со скоростью . С уровня S₁ также может происходить интеркомбинационная конверсия на триплетный уровень Т₁ со скоростью и далее с излучением () или без излучения () на уровень S₀. Если в верхних синглетных возбуждённых состояниях не идут ни фотохимические реакции, ни интеркомбинационная конверсия, то скорость попадания возбуждённых молекул в состояние S₁ оказывается равной скорости поглощения света.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

После выключения возбуждающего света, заселённость возбуждённого состояния S₁ уменьшается со скоростью , которая является суммой скоростей:

,(5)

где k_d скорость фотохимической реакции, _f длительность жизни состояния S₁.

Полную скорость испускания флуоресценции F с учётом фотораспада и населённостей S₁ и Т₁ уровней можно записать в виде:

(6)

Это выражение позволяет оценить интенсивность флуоресценции протекающего красителя, облучаемого мощным светом с учётом фоторазложения. Принимая во внимание тот факт, что шумы фотоприёмника увеличиваются пропорционально квадратному корню из увеличения, была построена зависимость отношения Сигнал/Шум от интенсивности возбуждения и длительности облучения пробы (рис. 6).

Рисунок 3.7 является ключевым графиком, позволяющим в случае синглетного насыщения флуорофора оптимизировать лазерное флуоресцентное детектирование в проточных системах по известным значениям молекулярной экстинкции , времени затухания флуоресценции и скорости фотораспада красителя . Относительная интенсивность k является безразмерной величиной, определяемой как отношение скорости поглощения фотонов молекулой , зависящей от интенсивности источника возбуждения, к скорости флуоресценции .



Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Наглядно влияние интенсивности возбуждения на отношение S/N при электрофоретическом движении красителя в капилляре показаны на рис. 3.10. Краситель с концентрацией 510-¹¹ М запускался по капилляру электрофоретически, что обеспечивало практически прямоугольный профиль пика. Интенсивность лазера составляла 4, 20 и 80 мВт, скорость съёма данных 5 точек/сек. При скорости движения 1.8 мм/с время облучения составляло 14 мс. Очевидно, что при увеличении мощности облучения с 4 до 20 мВт наблюдается рост чувствительности в 1.5 раза при росте фона в 5 раз. Увеличивая мощность с 20 до 80 мВт вследствие фотораспада и насыщения флуоресценции мы

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

наблюдаем уже падение чувствительности примерно в 1.5 раза при 4-х кратном увеличении фона. Шумы при этих измерениях возрастали пропорционально квадратному корню фона. Результаты на рис.7 хорошо согласуются с (6). При длительности облучения мс согласно (6), пик на среднем графике укладывается в оптимальное значение интенсивности при . Таким образом, выражение (3.20) и построенный по нему график (7) позволяют выбрать оптимальную интенсивность возбуждения для достижения максимальной чувствительности детектирования флуоресцирующих компонентов.

В четвертой главе рассматриваются задачи проектирования четырёхканального лазерного флуоресцентного детектора для определения нуклеотидной последовательности ДНК, в том числе выбор оптимальных параметров оптических компонентов и технического обеспечения детектора.

В задачах многокомпонентного анализа, к которым относится определение последовательности 4-х нуклеотидов в цепи ДНК, предпочтительно применение многоканальных схем детектирования, где число каналов равно числу анализируемых компонентов. Не смотря на то, что были показаны варианты одноканального детектирования нуклеотидов, используя один краситель, такой подход не получил распространения из-за больших ошибок в распознавании нуклеотидов. Многоканальность аналитической системы с использованием красителей с ПЭ позволяет осуществлять практически независимое детектирование нескольких красителей, имеющих отличные друг от друга спектры флуоресценции.

В соответствии с результатами, полученными во второй главе, детектор будем строить по ортогональной схеме, в которой луч лазера будет падать на капилляр под углом, минимизируя при этом фоновую засветку. В качестве источника возбуждения используем лазер с диодной накачкой на иттрий-алюминиевом гранате с неодимовым легированием (YAG:Nd) и с удвоением частоты второй гармонки. Максимальная мощность 20 мВт на длине волны 473 нм (LCS-DTL-364, ООО НПФ «Лазер-Компакт»). Такой тип лазера хорошо подходит для возбуждения донорного красителя (FAM), имеет меньшие габариты и более низкую цену, чем ион-аргоновый лазер 488 нм. Для обеспечения многоканальности используем дихроичные светоделители, которые отражают на фотоприёмник полосу флуоресценции одних красителей и пропускают излучение флуоресценции более длинноволновой области. Отражённое и рассеянное излучение будет дополнительно подавляться интерференционными фильтрами (ИФ). Сочетание светоделителей и светофильтров позволяет уйти от применения движущихся узлов, когда спектральные интервалы выделяются при вращении блока светофильтров. В силу того, что в генетических исследованиях применяются флуорофоры видимого спектрального диапазона, в качестве фотоприёмников используем ФЭУ, обладающие высокой чувствительностью в спектральном диапазоне, в котором флуоресцируют 4 красителя.

Оптическая схема разработанного 4-х канального детектора представлена на рис. 8. Луч лазера проходит через узкополосный ИФ (_max=473 нм, =3нм) и фокусируется линзой в капилляр. Диаметр лазерного пучка в капилляре определяется из условия (r - внутр. радиус капилляра), рассмотренного в главе 2, и составляет около 40 мкм.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Флуоресценция из капилляра собирается сферическим зеркалом в телесном угле стерадиан, проходит через Notch-фильтр, подавляющий линию 473 нм и пропускающий длинноволновую область, и затем направляется на 3 дихроичных зеркала. Отражённое от каждого зеркала излучение проходит через ИФ, которые подавляют фоновую засветку и окончательно выделяют флуоресценцию определённого красителя. Максимумы пропускания ИФ и максимумы флуоресценции спектров красителей совпадают и имеют значения 525, 550, 580 и 610 нм. После фильтров излучение с помощью линз фокусируется на фотокатоды ФЭУ.

Спектры используемых в секвенировании красителей представляют собой широкие перекрывающиеся полосы, занимающие интервал порядка 100 нм и вытянутые от максимумов в длинноволновую область. В силу близкой расположенности спектров и их протяжённости, поток, приходящий на ФЭУ i-го канала, будет складываться из суммы потоков своего красителя и других красителей, попадающих в полосу пропускания i-го светофильтра:

.(7)

Здесь S_i(,) -- спектральная характеристика i-го светофильтра, где -- ширина полосы на полувысоте пропускания; -- спектральная плотность потока m-го красителя.

Каждый ИФ пропускает световой поток от каждого красителя в большей или меньшей степени. Однако, для любого аналитического канала дополнительная флуоресценция соседних красителей является фоновой засветкой. Увеличив ширину , мы одновременно увеличим уровень фона в измерительном канале, хотя при этом вырастет и сигнал измеряемого красителя. При узком фильтре наряду с уменьшением фона неизмеряемых красителей можно значительно потерять полезный сигнал. Важно определить ширину светофильтров так, чтобы обеспечить оптимальное отношение S/N (сигнал/шум) по каждой флуоресцентной метке.

На рис. 9 представлена рассчитанная для четырёх красителей зависимость нормированного отношения Сигнал/Шум от полуширины светофильтров. Видно, что в системе из 4-х красителей существует максимум в отношении S/N, когда полуширина светофильтров составляет около 35-38 нм. Нижняя горизонтальная ось представляет собой безразмерное отношение к расстоянию между максимумами флуоресценции красителей -- . Когда /1, рост чувствительности практически прекращается. Данный критерий можно использовать для выбора оптимальной фильтра. В разрабатываемом секвенаторе расстояние между красителями составляет 29 нм. Исходя из этого, была выбрана полуширина ИФ в 30 нм.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

В настоящее время разработанный 4-х канальный флуориметрический детектор используется в анализаторе последовательности нуклеиновых кислот «Нанофор 03-С». Для работы анализатора могут применяться отечественные реактивы, что значительно снижает затраты на эксплуатацию. На рис. 10 представлен фрагмент последовательности ДНК плазмиды pGEM3Zf(+), полученный на разработанном приборе. Итоговые данные отображены после вычитания базовой линии по всем каналам, сглаживания пиков и устранения перекрёстной флуоресценции красителей через матрицу цветовой компенсации. На имеющемся рисунке приведена часть последовательности ДНК, состоящая из 93 разделённых нуклеотидов, демонстрирующая высокую эффективность разделения и распознавания отдельных нуклеотидов.

Выводы

1. Продемонстрированы возможности лазерного флуоресцентного детектирования в ближней-ИК области спектра, характеризующейся низким уровнем фонового рассеяния. Разработан высокочувствительный флуоресцентный детектор КЭ для ближней-ИК области, позволяющий детектировать вещество в сверхмалых (десятки молекул) количествах. Разработанный детектор позволяет измерять кинетику фотораспада флуоресцентных красителей.

2. Исследовано поведение красителей при воздействии на них возбуждающего излучения большой мощности. Установлено, что флуоресценция и скорость фотодеструкции красителя начинают испытывать насыщение в силу того, что молекула не может поглощать кванты света со скоростью большей, чем скорость затухания флуоресценции.

3. Для детекторов КЭ с лазерным возбуждением, особенно в системах определения последовательности ДНК, характеризующихся продолжительным временем анализа, мощность возбуждающего излучения и длительность облучения пробы являются важными параметрами, непосредственно влияющими на чувствительность детектирования. Теоретически и экспериментально обоснована методика нахождения оптимальной мощности лазера, заключающаяся в определении скорости фотораспада красителя, что позволяет достичь максимальной чувствительности при данной скорости движения пробы в капилляре.

4. Разработан и выпускается опытными партиями первый отечественный автоматический анализатор последовательности нуклеиновых кислот «Нанофор 03-С» с высокочувствительным четырёхканальным флуориметрическим детектором.

Основные результаты диссертационной работы отражены в следующих публикациях

1. Б. Г. Беленький, А. А. Евстрапов, Р. А. Козулин. Влияние отражённого капилляром излучения лазера на чувствительность флуориметрического детектора капиллярного электрофореза // Научное приборостроение. 2001. Т.11, №2. С. 21-25.

2. Б. Г. Беленький, Р. А. Козулин, В. Е. Курочкин, В. М. Золотарев. Приборы аналитического контроля на основе комбинированного метода капиллярного электрофореза и флуоресценции // Оптический журнал. 2002. Т. 69, №3. С. 69-77.

3. Б. Г. Беленький, А. А. Евстрапов, Р. А. Козулин, С. В. Коновалов, В. Е. Курочкин. Флуориметрический детектор. Патент RU 2182329, 2002.

4. Р. А. Козулин, В. Е. Курочкин. Аналитические системы контроля качественного и количественного состава ДНК // Научно-технический вестник СПбГИТМО. 2004. №13 , С. 166-170.

5. Р. А. Козулин, В. Е. Курочкин, В. М. Золотарев. Системы контроля ДНК на основе флуоресцентного метода // Оптический журнал. 2005. Т. 72, №1. С. 25-28.

Размещено на Allbest.ru

...