Размещено на http://www.allbest.ru/

Оптимизация состава синтетической глюкозо-аммонийной среды 1

Институт проблем химико-энергетических технологий СО РАН

Оптимизация состава синтетической глюкозо-аммонийной среды по выходу этанола для штамма Saccharomyces cerevisiae Y-1693

Е.А. Скиба, С.Е. Орлов, В.В. Будаева

г. Бийск, Россия

Аннотация

Основное содержание исследования

Алтайский край представляет собой уникальную природно-климатическую зону Западной Сибири. Большие объемы отходов сельского хозяйства и наличие земельных угодий, позволяющих выращивать возобновляемое целлюлозосодержащее сырье в значительных количествах, создают предпосылки для разработки и использования технологий интенсивной переработки дешевого целлюлозосодержащего сырья. Одним из направлений переработки таких видов растительного сырья является производство биоэтанола, получившее особое развитие за рубежом [1, 2]. Так, например, в США к 2012 г. запланировано снизить стоимость биоэтанола из лигноцеллюлозного сырья с 0,59 (цена 2006 г.) до 0,28 долларов за литр. В прошлом веке в СССР была создана и успешно развивалась гидролизно-дрожжевая промышленность, преимущественно перерабатывались химические гидролизаты древесного лигноцеллюлозного сырья. В настоящее время в России в рамках программ по рациональному природопользованию и созданию альтернативных источников энергии активно проводятся исследования по получению биоэтанола сбраживанием ферментативных гидролизатов, полученных из отходов сельскохозяйственной переработки и биомассы быстро возобновляемого растительного сырья, так называемых энергетических растений. Полученные по данному научному направлению в Институте проблем химико-энергетических технологий СО РАН (г. Бийск) предварительные результаты исследований позволили объединить солому, плодовые оболочки злаков и российский мискантус в одну большую группу целлюлозосодержащего сырья для биотехнологической переработки в биоспирты [3-6].

Известно, что гидролизаты являются средами, плохо пригодными для жизнедеятельности дрожжей, поскольку в них недостаточное содержание азотных и фосфорных соединений, отсутствуют витамины и стимуляторы роста. Эти вещества должны вноситься в состав сред дополнительно в оптимальном количестве.

Для каждого источника сырья и способа получения гидролизата должны быть определены некоторые нормативы внесения питательных солей. Кроме того, разные штаммы имеют разные потребности в питательных веществах и обладают различной толерантностью к вредным примесям гидролизатов (фурфуролу, оксиметилфурфуролу, формальдегиду, лигногуминовым веществам) [2, 7, 8]. Для обеспечения нормальной работы штамма биотехнологические характеристики гидролизата должны быть стабилизированы.

В связи с этим первостепенными задачами являются изучение питательных потребностей выбранного штамма сахаромицетов и оптимизация состава синтетической глюкозо-аммонийной среды по выходу этанола.

Материалы и методики исследования. В работе использован штамм Saccharomyces сerevisiae Y-1693, полученный из Всероссийской коллекции промышленных штаммов микроорганизмов (г. Москва). Он был выделен из ферментера Котласского ЦБК Архангельской области и использовался для производства этанола на гидролизатах древесины. Особенностью штамма является его устойчивость к вредным примесям гидролизатов.

Для выявления питательных потребностей штамма Y-1693 были проведены эксперименты с использованием синтетических глюкозо-аммонийных сред. В качестве базовой использовалась стандартная синтетическая среда (табл.1). Сбраживание проводили в анаэробных условиях при температуре 28±1°С.

этанол синтетическая среда штамм

Таблица1

Базовый состав синтетической среды [9, 10]

В экспериментах варьировали три параметра (компонента питательных сред): концентрация глюкозы, фосфора (в виде монозамещенного фосфата калия) и азота (в виде сульфата аммония). Крепость бражек (объемную долю спирта) определяли ареометром для спирта в дистилляте, полученном после предварительной перегонки спирта из бражки [11]. Поскольку концентрация субстрата в опытах изменялась, то биосинтетическую активность штамма оценивали не по крепости полученной бражки, а по выходу этанола, выраженному в процентах от теоретически возможного [12].

Результаты исследования и обсуждение

По полученным экспериментальным данным в программе Math CAD было составлено уравнение регрессии. Для составления уравнения использован массив данных, представленный в табл.2. В общем виде зависимость функции от трех переменных можно представить как

f x x x (1 2 3) = a0 + a1 ? x1 + a2 ? x2 + a3 ? x3+a4 ? x1 ? x2 + a5 ? x1 ? x3 + a6 ? x2 ? x3 + a7 ? x1 ? x2 ? x3. (1)

В результате обработки методом наименьших квадратов экспериментальных данных были рассчитаны следующие коэффициенты регрессии: а₀ = 94,572; а₁ = - 0,474; а₂ = 5,107; а₃ = 1,177; а₄ = 2,585•10^-3; а₅ = 3,218•10^-3; а₆ = - 0, 192; а₇ = - 3,117•10^-4. Тогда уравнение регрессии можно записать следующим образом:

f x x x (_{1 2 3}) = 94,572 ? 0,474? x₁ + 5,107? x₂ +1,177? x₃ +2,585 10?^?3x₁ ? x₂ + 3,218 10?^?3 ? x₁ ? x_{3 -} ?0, 192? x₂ ? x₃ ?3,117 10?^?4 ? x₁ ? x₂ ? x₃. (2)

Таблица 2

Экспериментальные данные, использованные для построения уравнения регрессии

Зависимость выхода этанола от концентрации глюкозы, фосфора и азота в составе питательной среды носит сложный характер. Каждый из параметров оказывает влияние друг на друга. График функции выхода целевого продукта (этанола), соответствующий выходу этанола 95% от теоретического, представляет собой поверхность, полученную по уравнению регрессии.

Рис.1. Зависимость концентрации глюкозы (x₁) от концентраций монозамещенного фосфата калия (x₂) и сульфата аммония (x₃) при выходе этанола 95%

Для проверки адекватности составленного уравнения были проведены три дополнительных опыта (табл.3), в которых произвольно варьировались исследуемые параметры. При этом концентрации питательных солей и глюкозы не выходили за пределы массива данных, по которому построено уравнение регрессии (2).

Таблица 3

Экспериментальные данные, использованные для проверки адекватности

Адекватность уравнения регрессии проверялась по критерию Фишера (F). Для этого вычислялись дисперсия расчетных данных и дисперсия экспериментальных данных: D_теор = 148,91; D_эксп = 146,01.

Количество независимых переменных в уравнении N_теор = 8, количество экспериментальных точек N_эксп = 3.

Расчетное значение критерия Фишера равно 1,02; число степеней свободы большей дисперсии 2; число степеней свободы меньшей дисперсии 7.

Для такого количества экспериментов и чисел степеней свободы табличное значение критерия Фишера (F_т) равно 19,35 (при достоверности 95%) [13]. Расчетное значение критерия Фишера (F) равно 1,02. Так как расчетное значение критерия Фишера (F) меньше табличного (F_т), то уравнение регрессии можно считать адекватно описывающим эксперимент с достоверностью 95%.

Поверхность, изображенную на рис.1 и отвечающую уравнению регрессии (2), можно более наглядно представить в виде проекции на плоскость (x₂, x₃) при заданных значениях x₁ (концентрации глюкозы).

Рис.2. Зависимости концентраций монозамещенного фосфата калия (x₂) от сульфата аммония (x₃) при различных концентрациях глюкозы для выхода этанола 95%

Согласно проекциям составлена таблица рекомендуемых концентраций солей азота и фосфора, которые необходимо внести в гидролизаты растительного сырья, при установленной в них концентрации глюкозы (табл.4) для достижения выхода этанола 95% от теоретического.

Таблица 4

Рекомендуемые концентрации монозамещенного фосфата калия (КH₂РО₄) и сульфата аммония ( (NH₄) ₂SО₄) при установленной концентрации глюкозы в гидролизате

Таким образом, данные табл.4 позволяют определить необходимые количества монозамещенного фосфата калия и сульфата аммония для введения в гидролизную среду. Например, для достижения высокого выхода этанола в гидролизат с концентрацией глюкозы 35 г/л, в соответствии с табл.4, следует внести КH₂РО₄ - 1,7 ± 0, 2 г/л и (NH₄) ₂SО₄ - 8,5 ± 0,2 г/л. При отсутствии приведенных питательных солей можно вносить другие, пересчитывая на содержание фосфора и азота в веществе [12].

Заключение