Синтез и антимикробная активность комплексов природных полисахаридов и их производных с катионами металлов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Синтез и антимикробная активность комплексов природных полисахаридов и их производных с катионами металлов

Введение

Комплексы природных полисахаридов и их производных с катионами металлов приме-няются для иммобилизации ферментов, в качестве кровезаменителей с гемостимулирующим и противоанемическим действием, используются в рентгенологии и как биодеградирумые носители для низкомолекулярных лекарственных веществ [1]. Некоторые комплексы полисахаридов с катионами металлов обладают противомикробной активностью [2-4]. Известны обладающие антибактериальным действием конъюгаты на основе хитозана и его производных с наночастицами серебра [5, 6]

При получении полимерных комплексных соединений медицинского назначения большой интерес в качестве функциональной комплексообразующей группы представляет гидроксамовая (N-гидроксикарбоксамидная) группировка.

Содержащие её лекарственные препараты и природные биологически активные вещества, обладают противобактериальной, антигрибковой, противовоспалительной и гипогликемической активностью [7]. Противомикробная активность обнаружена также и у комплексных соединений некоторых гидроксамовых кислот с переходными металлами [8, 9]

Целью данной работы было получение и изучение комплексов химически модифициро-ванного микробного полисахарида декстрана - О-[2-(гидроксиамино)-2-оксоэтил]-О-(карбоксиметил)-(1>6)-б-D-глюкана (I), содержащего гидроксамовые группы (-CONHOH), с катионами Fe^{3 +}, Cu^{2 +}, Co²⁺, Ni^{2 +}, Mn^{2 +}, Zn^{2 +}, Ag ⁺ .

Экспериментальная часть

Гидроксамовое производное I было синтезировано по ранее описанной методике [10] из микробного полисахарида декстрана (линейный (1>6(3))-б-D-глюкан, продуцируемый Leuconostoc mesenteroides). Для получения комплексов использовали образец натриевой соли гидроксамовой кислоты (Iа) с содержанием карбоксильных групп (С_км) 0.61 и содержанием гидроксамовых групп (С_гк) 0.29 моль на моль моносахаридных звеньев. Iа представляет собой бежевый гигроскопичный порошок, хорошо растворимый в воде и не растворимый в органических растворителях.

Синтез комплексов О-[2-(гидроксиамино)-2-оксоэтил]-О-(карбоксиметил)-(1>6)-б-D-глюка-на с катионами Fe³⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, Ag⁺ (Iб-ц). Навеску натриевой соли (Iа) массой 0.2 г растворяли в 2 мл дистиллированной воды, pH среды доводили до необходимого значения 4 н. раствором HCl (6 н. HNO₃ в случае синтеза соединений серебра). По каплям прибавляли 10% водный раствор хлорида соответствующего металла (или нитрата серебра(I)) (соотношение в реакции металл/моносахаридное звено 1.5:1), затем, после корректировки pH, реакционная смесь перемешивалась в течение 30 мин. Растворимые продукты осаждали этанолом. Образовавшиеся окрашенные аморфные осадки растирали до получения однородной массы, отфильтровывали, тщательно промывали удаления избытка соли металла и сушили в вакууме при остаточном давлении 20-25 мм рт. ст. и 61 °С.

ИК спектры соединений в KBr записывали на фурье-спектрометре ФСМ 1201. УФ спектры водных растворов веществ получены на спектрометре Ocean Optics PX-1 в кюветах с толщиной поглощающего слоя 1 см при 18 °C. Для фотометрических измерений использовался спектрофотометр КФК-3-01. Гравиметрический тест на растворимость выделенных комплексов проводили согласно методике, описанной в работе [16].

Потенциометрические измерения проводили на иономере универсальном ЭВ-74. Железо(III) определяли в виде комплекса с сульфосалициловой кислотой в водно-аммиачном растворе, медь(II) - фотометрированием аммиачного комплекса, кобальт(II) - фотометрированием тиоционатного комплекса в ацетоне, марганец(II) - в виде комплекса с формальдоксимом в щелочной среде, никель(II) - в виде комплекса с диметилглиоксимом в щелочной среде в присутствии йода [17].

Определение Ag(I) в комплексе, после его разрушения в азотнокислой среде, проводили методом прямой потенциометрии на иономере универсальном И-160 с помощью ионно-селективного электрода ЭСЛ-51-07СР и вспомогательного электрода ЭВЛ-1М3.1, установленного через электролитический ключ 1Е5.184.412 [17]. Определение Zn(II) проводили комплексонометрическим титрованием в кислой среде комплексоном III в присутствии индикатора ПАН [18].

Микробиологические исследования. Антимикробную активность исходного полилиганда, полученных комплексных соединений и препарата сравнения (Протаргола) определяли in vitro методом двукратных серийных разведений в мясопептонном бульоне (в отношении бактерий) или жидкой среде Сабуро (в отношении грибов) [18]. Использовали следующие тест-культуры: Bacillus subtilis ATCC 6633, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus aureus ATCC 6538-P, Candida albicans ATCC 10231, Aspergillus niger ATCC 9642 [19]. Микробная нагрузка составляла 5•10⁵ клеток (для A. niger - конидий) в 1 мл среды. Инкубацию проводили: для S. aureus, B. subtilis, E. сoli, P. aeruginosa и C. albicans - 24 ч при 36±1 °С, для A. niger - 3 суток при 24±1 °С.

Наличие, угнетение или отсутствие роста тест-культур оценивали визуально. Для определения микробостатического или микробоцидного действия из всех пробирок, в которых было отмечено отсутствие роста тест-микроорганизмов, проводились высевы на плотные питательные среды (мясо-пептонный агар для бактерий, агар Сабуро для грибов).

Результаты и их обсуждение

Синтез комплексов гидроксамового производного с ионами металлов проводили в водном растворе при комнатной температуре. При взаимодействии натриевой соли (Iа) с катионами Fe³⁺ и Cu²⁺ происходило образование интенсивно окрашенных комплексов, которые при рН 4.5 и 7.5 частично выпадали в осадок.

Образование нерастворимых комплексов наблюдались также в случае ионов Co²⁺, Ni²⁺ и Ag⁺ при pH 7.5. В случае образования водорастворимых соединений из раствора их выделяли добавлением в реакционную массу этанола. Для установления степени связывания катионов с полилигандом и оценки комплексообразующей способности функциональных групп синтез и выделение комплексных соединений проводили при значениях рН 1, 4.5, 7.5.

Полученные соединения характеризовали степенью замещения С_з (количество молей ионов металла, приходящееся на 1 моль моносахаридных звеньев) (табл. 1). Содержание металла в комплексах ионов Fe³⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Mn²⁺ после их разрушения в кислой среде рассчитывали по результатам анализа с использованием спектрофотометрических методик.

Определение Ag⁺ проводили методом прямой потенциометрии [11], Zn²⁺ - комплексонометрическим титрованием [12].

Табл. 1. Характеристика комплексов катионов Fe³⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, Ag⁺ с О-[2-(гидроксиамино)-2-оксоэтил]- О-(карбоксиметил)-(1>6)-б-D-глюканом

Примечание: ^а) В таблетках с KBr. ^б) Дн(COO-) = н_as (COO-) - н_s (COO-). ^в) В водных растворах с с = 10^-2 моль/л.

Из полученных данных следует, что гидроксамовая кислота (I) проявляет высокую хелатирующую способность ко всем выбранным металлам. При этом наименьшее содержание металла (С_з = 0.04-0.06) было установлено для комплексов Co²⁺ (Iз), Ni²⁺ (Iл) и Zn²⁺ (Iс), синтезированных в сильно кислой среде (pH 1).

Следует отметить, что для комплексов Fe³⁺ (Iб), Cu²⁺ (Iд), Ag⁺ (Iф), выделенных при pH 1, а также комплексов Ni²⁺ (Iм) и Mn²⁺ (Iп), полученных при pH 4.5, соотношения С_з/С_гк составляют 1, 0.90, 1.07, 0.90 и 0.93 соответственно. Таким образом, в этих комплексах, по-видимому, происходит координация катиона металла с одной гидроксамовой группировкой. Данная схема комплексообразования была установлена нами ранее фотоколориметрическим методом при взаимодействии кислоты I с ионами Fe³⁺ [13].

Для остальных комплексов С_з превышает С_гк, что указывает на возможное участие в связывании катионов металлов при pH 4.5 и 7.5 также карбоксильных и гидроксильных групп.

В ИК спектрах комплексов с катионами Fe³⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺ наблюдается смещение полосы поглощения н[C=O(NH)] в область низких частот на 3-30 см-¹ по сравнению со спектром кислоты I. Это можно объяснить снижением электронной плотности на атоме азота гидроксамовой группировки в результате образования координационной связи (табл. 1).

Для комплексов Ag⁺ (Iф-ц) полоса поглощения н[C=O(NH)] смещена на 18 см-¹ в область более высоких частот по сравнению со спектром кислоты I, что говорит об образовании простой соли.

На спектрах всех выделенных при pH 4.5-7.5 комплексов, наблюдается изменение частот колебания карбоксилата с 1604 см-¹ (Iа) на 1575-1600 см-¹, что указывает на его участие в составлении первой координационной сферы комплексов.

Предположение о способе связывания карбоксилатной группы можно сделать, основываясь на разности волновых чисел, соответствующих антисимметричным и симметричным валентным колебаниям карбоксилатной группы в комплексах и натриевой соли Iа [14].

Разность Дн(СОО-) = н_as(СОО-) - н_s(СОО-) для натриевой соли Iа составляет 187 см^-1. На основании анализа спектров комплексов с участием в координировании СОО- группы найдено, что значение Дн(СОО-) для них составляет 150-176 см-¹, что позволяет предположить бидентатное хелатирование катионов Fe³⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Ni²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, Ag⁺ карбоксилатной группой при pH 4.5-7.5.

В ИК спектрах комплексов Co²⁺ (Iи,к), Ni²⁺ (Iм,н), полученных при pH 4.5-7.5, а также комплексов Mn²⁺ (Iр) и Zn²⁺ (Iу), полученных при pH 7.5, наблюдается появление новых полос при 1046-1050 см-¹, а также происходит смещение полос от 1106-1115 см-¹(I и Iа) в низкочастотную область (1079-1088 см-¹). Изменение положения полос данной области, соответствующие валентным колебаниям связей С-О и С-С глюкопиранозного цикла [15], указывают на участие в комплексообразовании свободных гидроксильных групп в положениях 2, 3.

В электронных спектрах поглощения водных растворов полученных комплексов имеют-ся максимумы поглощения, отсутствующие в спектре натриевой соли Iа (табл. 1). В спектрах всех комплексов Fe³⁺, Cu²⁺ и Mn²⁺ наблюдаются гиперхромный эффект и батохромный сдвиг максимума поглощения хромофорных групп в модифицированном полисахариде в область 230-250 нм.

В спектрах растворов комплексов Co²⁺ (Iз) и Ni²⁺ (Iл), синтезированных при pH 1, максимум поглощения карбонильных групп полилиганда практически не меняется по сравнению с кислотой I, что говорит о слабом взаимодействия катионов с комплексообразующими группами и согласуется с низкими значениями С_з.

Для комплексов Co²⁺ (Iи,к) при pH 4.5 и 7.5 полосы поглощения карбонильных групп смещаются в длинноволновую область к 250-280 нм, а интенсивность сигнала при 510-520 нм повышается, что связано с процессом комплексообразования. Аналогично в спектрах растворов комплексов Ni²⁺, полученных при pH 4.5 и 7.5, наблюдается смещение максимума поглощения карбонила к 230 нм, а также появляется слабый максимум при 480-500 нм.

Для комплексных соединений Zn²⁺ (Iс-у) и Ag⁺ (Iф-ц) получить электронные спектры не удалось из-за низкой прозрачности соответствующих растворов.

Для микробиологических испытаний были отобраны образцы комплексов Fe³⁺ (Iб), Cu²⁺ (Iд), Ag⁺ (Iф), полученные при pH 1, а также Co²⁺ (Iи), Ni²⁺ (Iм), Mn²⁺ (Iп), Zn²⁺ (Iт), выделенные при pH 4.5.

Табл. 2. Антимикробная активность соединений О-[2-(гидроксиамино)-2-оксоэтил]-О-(карбоксиметил)-(1>6)-б-D-глюкана с катионами металлов

Примечание: МСК - минимальная микробостатическая концентрация; МЦК - минимальная микробоцидная концентрация; прочерк - в условиях эксперимента действие не выявлено.

Наиболее выраженное ингибирующее действие в отношении всех исследованных штаммов бактерий и грибов проявил комплекс серебра(I) (Iф), при этом его активность в отношении B. subtilis и грибов оказались выше, чем у Протаргола. Комплексы Cu²⁺ (Iд), Co²⁺ (Iи), Ni²⁺ (Iм), Mn²⁺ (Iп), Zn²⁺ (Iт) также обладали (но в меньшей степени) противогрибковым действием, однако для натриевой соли (Iа) и комплекса Fe³⁺ (Iб) такая активность в исследованном диапазоне концентраций не была выявлена. Активность комплексов в отношении грамположительных бактерий была на уровне или даже ниже, чем у полилиганда Iа, в то время как грамотрицательные бактерии оказались более чувствительными. В целом, наименее выраженное антимикробное действие проявили комплексы Fe³⁺ (Iб) и Mn²⁺ (Iп).

Выводы

Впервые получены комплексы О-[2-(гидроксиамино)-2-оксоэтил]-О-(карбоксиметил)-(1>6)-б-D-глюкана, содержащего гидроксамовые группы (-CONHOH), с катионами некоторых d-металлов. Установлено, что в некоторых комплексах, полученных при рН 1 и 4.5, происходит координация катиона металла с одной гидроксамовой группировкой. Ингибирующее действие в отношении всех исследованных штаммов бактерий и грибов проявил комплекс серебра(I), при этом его активность в отношении B. subtilis и грибов оказались выше, чем у Протаргола.

Литература

полисахарид комплекс железо антимикробный

1. Сибикина О.В., Иозеп А.А., Москвин А.В. Хим.-фарм. журн. 2009. Т.43. №6. С.35-39.

2. X. Wang, Y. Du, L. Fan et al. Polym. Bull. 2009. Vol.55. No.1-2. P.105-113.

3. S. Adewuyi, K.T. Kareem, A.O. Atayese et al. Int. J. Bio. Macromol. 2011. Vol.48. No.2. P.301-303.

4. B.L. Rivas, A. Maureira, C. Guzmбn. Macromol. Symp. 2010. Vol.287. P.69-79.

5. D. Wei, W. Sun, W. Qian et al. Carbohydr. Res. 2009. Vol.344. No.17. P.2375-2382.

6. H. Penchev, D. Paneva, N. Manolova et al. Carbohydr. Res. 2010. Vol.345. No.16. P.2374-2380.

7. Жунгиету Г.И., Артеменко А.И. Гидроксамовые кислоты (N-гидроксиамиды) и их производные. Штиинца, Кишинев. 1986. C.103-129.

8. A.O. Aliyu, J.N. Nwabueze. Int. J. Phys. Sci. 2008. Vol.2. No.7. P.167-172.

9. A.O. Aliyu, J.N.P.A. Egwaikhideb, S.O. Okeniyia et al. EJEAFChe. 2010. Vol.9. No.6. P.1019-1024.

10. Сибикина О.В., Ушаков Н.В., Иозеп Л.И., Москвин А.В. Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Cб. науч. тр. Пятигорск. 2010. C.395-397.

11. Титов В.Е., Стеценко А.И., Сахаров А.А. Потенциометрические методы анализа. Ленинград: Изд-во ЛХФИ. 1986.

12. Живописцев В.П., Селезнева Е.А. Аналитическая химия цинка. Москва: Наука. 1975. С.58-59.

13. Ушаков Н.В., Сибикина О.В., Москвин А.В. Тез. докл. XXV межд. Чугаевской конф. корд. хим. Суздаль. 2011. С.333.

14. K. Nakamoto. In Infrared and Raman spectra of Inorganic and Coordination Compounds, 3rd ed. Wiley Interscience, New York. 1978.

15. Жбанков Р.Г. ИК спектры и структура углеводов. Минск: Наука и техника. 1972. С.180-183.

16. A. Para. Carbohydr. Polym. 2004. Vol.57. P.277-283.

17. Марченко З., Бальцежак М. Методы спектрофотометрии в УФ и видимой областях в неорганическом анализе. Москва: Бином. 2007.

18. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва: Медицина. 2005. С.515-522.

19. Государственная фармакопея Российской Федерации XII. Научный центр экспертизы средств медицинского применения. Москва. 2008.

Размещено на Allbest.ru