Влияние компонентов питательной среды на развитие экстремально галофильного микробного сообщества

Полная исследовательская публикация _____________________________ Борисов В.Д. и Калёнов С.В.

Размещено на http://www.allbest.ru/

34 _______________ http://butlerov.com/ ______________ ©--Butlerov Communications. 2016. Vol.46. No.6. P.32-36.

Полная исследовательская публикация Тематический раздел: Биохимические исследования.

Идентификатор ссылки на объект - ROI: jbc-01/16-46-6-32 Подраздел: Биотехнология.

32 _________ ©--Бутлеровские сообщения. 2016. Т.46. №6. __________ г. Казань. Республика Татарстан. Россия.

УДК 579.222.3.

РХТУ им Д.И. Менделеева

Влияние компонентов питательной среды на развитие экстремально галофильного микробного сообщества

Борисов Владимир Дмитриевич

В современной биотехнологии, за редким исключением (кефирные грибки, активный ил), используются монокультуры микроорганизмов, полученные направленными изменениями гено-ма. Дальнейшее совершенствование технологий микробного синтеза лежит в области разра-ботки систем управления смешанными популяциями и поиска новых продуцентов в мало-изученных экологических нишах.

Солевые озера, пустыни, дно океана, кислотные сливы шахт создают условия, в которых большинство организмов выжить не могут, но экстремофильные бактерии, найденные там, успешно заселили эти экологические ниши. Экстремальные среды содержат относительно простые микробные сообщества, выработавшие специфичные механизмы устойчивости.

Большинство галофильных сообществ включает солелюбивые микроводоросли и гало-бактерии, их видовой состав определяется световым, солевым, температурным режимами соленых водоемов [1]. Создание подобных контролируемых метаболически замкнутых систем в лабораторных условиях поможет в дальнейшем использовать экстремально галофильные сообщества в промышленном масштабе для получения ряда полезных и уникальных в своем роде БАВ: каротиноидов, галоцинов, белков фотосистемы, различных осмопротекторов (эктоин, фитанол), термостабильных ферментов, а среда их обитания позволяет проводить культиви-рование с минимальными требованиями к асептике.

Создание метаболически замкнутой системы на основе водоросли (заменяет часть органического субстрата для бактерии) и бактерии может быть экономически эффективно. Одна из главных проблем, встающая перед биотехнологами при ферментации смешанных популяций - их регулирование, так как кефирные грибки и сообщества сточных вод регули-ровать сложно ввиду большого количества организмов, входящих в их состав. Экстремальные сообщества содержат до 2-3-х доминирующих культур и минорные компоненты [2]. Их модели-рование и контроль значительно проще, а спектр применения - широк.

В работе поставлена цель изучения устойчивого галофильного сообщества на основе доминирующей культуры, выделенной из озера Шотт-Эль-Джерид, и солелюбивой водоросли Dunaliella salina.

Экспериментальная часть

В данной работе изучены микроорганизмы, выделенные из консорциума с одноклеточной зеленой водорослью Dunaliella salina (природный источник - озеро Шотт-Эль- Джерид, Тунис (рис. 1)) методом накопительных культур на агаризованной среде Семененко (116 г/л NaCl) при интенсивном освещении 500 Лк и температуре 25-28 єС. Состав сбалансированной среды Семененко для культиви-рования зеленой микроводоросли Dunaliella salina, (г/л): КNO3 - 5.0; КН2РО4 - 1.25; MgSО4 - 50; FeSO4х7H2О - 0.009; NaCl - 116; EDTA - 0.037; 2 мл раствора микроэлементов [3].

Для разделения культур использовался метод Коха с применением различных сред (L-агар, комплексные среды для галофилов [4]). Для проверки чистоты выделенных культур проводился 16S-РНК анализ. Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК для каждого из исследуемых образцов были использованы универсальные праймерные системы, позволяющие детектировать как бактерии (27f-519r; 27F: 5' AGA GTT TGA TC(M) TGG CTC AG 3'; 519R: 5' G(W)A TTA CCG CGG C(K)G CTG 3') так и археи (8f-1492r; 8F: 5' AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3'; 1492R: 5' GGT TAC CTT GTT ACG ACT T 3').

Отбор наиболее устойчивых (претендующих таким образом на доминирование) субпопуляций бактерий проводится с использованием пероксида водорода, который выступает в качестве фактора отбора популяции, вызывая сильный оксидативный стресс у микроорганизмов. Самые устойчивые клоны реактивируются с помощью активированного угля АГ-3. Уголь используется для устранения метаболитов, образующихся в процессе угнетения микроорганизмов: возможных продуктов перекис-ного окисления липидов, токсичных веществ, выделяющихся в ходе повреждения и репарации ДНК. В глубинную культуру клеток S. marasensis, полученную в колбах и находящуюся в предстационарной фазе роста, добавляется пероксид водорода концентрацией 0.6 г/л. Колбы инкубируются в течении 3 часов при освещении 500 Лк и температуре 38-40 єС. Затем отбирается 0,5 мл культуры и переносится на агаризованную среду с инкапсулированным в ней активированным углем. С помощью стерильного шпателя каплю посевного материала равномерно распределяют по поверхности. Через 14 дней полу-чают отдельные колонии микроорганизмов.

Питательные компоненты для культивирования выделенного галофильного сообщества оптими-зировались по методу математического планирования Плакетта-Бермана. В качестве варьируемых факторов были взяты основные компоненты комплексной среды для выделения галофильных орга-низмов [4]. Влияние микроэлементов на данном этапе работы не рассматривалось, оптимизация их содержания в среде будет проводится в дальнейшем.

Рис. 1. Озеро Шотт-Эль-Джерид, Тунис

Табл. 1. Факторы и соответствующие им значения уровней варьирования в натуральном масштабе

Для возможности оценки значимости влияния 6 представленных в табл. 1 факторов, взятых на двух уровнях, был выбран ортогональный план Плакетта-Бермана для k = 11. Такой план позволяет оценить значимость коэффициентов линейного уравнения регрессии на основании 12 опытов. Введем мнимые факторы D7-D11 для оценки дисперсии воспроизводимости. В матрицу планирования (табл. 2) введем столбец с фиктивной переменной X0, необходимый для расчета свободного члена уравнения регрессии b0. Проведено 12 опытов, в каждом из которых было определено содержание биомассы на 5-й день культивирования (Y1) и относительное содержание C50-каротиноидов (Y2). Найден оптимум концентраций компонентов для роста и показано ингибирующее действие чрезмерного количества определенных органических субстратов. В модельных экспериментах сообщество выращивалось на среде следующего состава (г/л): NaCl, 250; MgSO4Ч7H2O, 20; KCl, 2; цитрат Na, 3; триптон, 5; дрож-жевой экстракт, 2; глицерин, 3 мл/л. Культивирование проводилось на качалке G10 New Brunswick при 180 об/мин, освещенности 500 Лк, температуре 38.5 °С 7 суток. бактериальный культура биомасса каротиноид

Коэффициенты уравнения регрессии определялись по формуле:

Табл. 2. Матрица планирования в безразмерном масштабе

Значимость коэффициентов определили по критерию Стьюдента, точность оценок эффектов факторов - по выражению:

,

дисперсию воспроизводимости определяли через фиктивную переменную по уравнению

.

Все расчеты сводятся в таблицу.

Адекватность уравнения регрессии проверяют по критерию Фишера:

.

Для этого рассчитывают прогнозируемые значения yiрасч по полученному уравнению регрессии, квадраты рассогласования (yi-yiр)2, остаточную дисперсию S2ост, которую оценивают относительно дисперсии воспроизводимости [5].

Результаты и их обсуждение

На среде Семененко из природного образца, отобранного из озера Шотт-Эль-Джерид, Тунис, выделены водоросли Dunaliella salina (в дальнейшем водоросли были заменены на штамм Dunaliella salina IBSS-2 из Института физиологии микроорганизмов). Параллельно с ними развивались галофильные бактерии, выделенные из кристаллов соли (рис. 2).

Рис. 2. Кристаллы соли с инкапсулированными микроорганизмами

Рис. 3. Отдельные колонии S. marasensis

16S-РНК анализ показал, что попытки разделения не увенчались успехом, так как в колониях присутствует смесь галофильных и бациллярных культур. С использованием разра-ботанной методики получены отдельные колонии Salicola marasensis (рис. 3).

Дальнейшие пересевы на агаризованные среды показали однородность колоний, прове-денный 16S-РНК подтвердил успешное выделение бактерии из природного ассоциата. Salicola marasensis - наиболее устойчивая доминирующая бактериальная культура сообщества. Ми-норные компоненты не могут расти отдельно от галокультур на насыщенных солевых раст-ворах, в силу отсутствия в среде осмопротекторов, вырабатываемых галофилами.

Оптимизация питательной среды по количеству биомассы.

Уравнение линейной регрессии имеет вид: y = 9.25-0.47?X1+0.24?X4+0.35?X5+0.61?X6

Табл. 3. Данные для расчета остаточной дисперсии S2ост

Расчетное значение не превышает квантиль Фишера при заданном уровне значимости, что говорит о том, что линейное приближение позволяет описать результаты с достаточной точностью.

Таким образом, оптимизированная ферментационная среда для Salicola marasensis имеет следующий состав (г/л):

NaCl 250

MgSO4·7H2О 10

KCl 1

Na цитрат 1

Триптон 8

Дрожжевой экстракт 3

Глицерин 5 мл/л

Оптимизация по содержанию C50-каротиноидов.

Уравнение линейной регрессии имеет вид: y = 4.88-0.62?X3 + 0.84?X6,

то есть снижение содержание KCl в ферментационной среде и повышение концентрации глицерина положительно влияют на выработку бактериями каротиноидов.

Табл. 4. Данные для расчета остаточной дисперсии S2ост

Расчетное значение не превышает квантиль Фишера при заданном уровне значимости, что говорит о том, что линейное приближение позволяет описать результаты с достаточной точностью. Оптимальная среда для получения каротиноидов соответствует оптимизирован-ной среде для получения биомассы.

Заключение

Накопление биомассы S. marasensis зависит от содержания в среде органических субст-ратов, а для получения каротиноидов бактериям необходим глицерин, высокое содержание минеральных компонентов препятствует их синтезу.

Для проведения в дальнейшем опытов в непрерывном режиме ферментации были предложены среды для регулирования компонентного состава сообщества без полной потери какого-либо микроорганизма. Оптимизированная для бактерии среда использовалась при сов-местном культивировании с D. salina, в котором получены высокие выходы -каротина, С50-каротиноидов, биомассы водоросли и бактерий. При культивировании сообщества биомасса D. salina может заменить часть органических компонентов, что повышает экономическую эффективность. Глицерин и в-каротин, вырабатываемые водорослями, способствуют росту S. marasensis. Глицерин необходим для построения клеточной стенки бактерий, а в-каротин дает дополнительную защиту от солнечной радиации и ионизирующего излучения.

1. Из озера Шотт-Эль-Джерид выделены бактериальные галофильные культуры, находящиеся в устойчивой ассоциации с микроводорослью Dunaliella salina. Для выделения монокуль-тур и самых устойчивых субпопуляций разработана методика, основанная на губительном действии пероксида водорода на клетки.

2. Для культуры Salicola marasensis были подобраны питательные среды и условия культи-вирования, которые затем были оптимизированы с помощью методов математического планирования.

Литература

[1] A. Oren. Halophilic microorganisms and their environment. USA. 2002. 358p.

[2] Abdeljabbar Hedi и др. Prokaryotic biodiversity of halophilic microorganisms isolated from Sehline Sebkha Salt Lake (Tunisia). African Journal of Microbiology Research. 2013. No.8(4). P.355-367.

[3] Тренкеншу Р.П., Геворгиз Р.Г., Боровков А.Б. Основы промышленного культивирования Дуналиеллы солоноводной (Dunaliella salina Teod.). Севастополь, НПЦ «ЭКОСИ-Гидрофизика». 2005. 10с.

[4] R.M. Atlas. Handbook of microbiological media. Washington, D.C.: «ASM Press». 2010. 2040p.

[5] Измерения. Статическая обработка результатов пассивного и активного экспериментов в биотехнологии. М.Г. Гордиенко и др. М.: РХТУ им. Д.И. Менделеева. 2015. С.77-84.

Аннотация

Из природного экстремально галофильного микробного сообщества озера Шотт-Эль-Джерид выделены и идентифицированы отдельные культуры. Для доминирующей бактериальной культуры Salicola marasensis оптимизирована питательная среда с использованием метода математического планирования Плакетта-Бермана. Выявлены значимые компоненты, влияющие на прирост биомассы и выработку каротиноидов, которые могут использоваться в косметических композициях. Проведены предварительные опыты по совместному культивированию водоросли Dunaliella salina - автотрофного компонента сообщества и бактерии Salicola marasensis.

Ключевые слова: микробные сообщества, галофильные микроорганизмы, каротиноиды, математическое планирование.

The individual culture were isolated and identified from the halophylic microbial community of Chott-El-Jerid lake. For the dominant Salicola marasensis bacterial culture growth medium optimized using the method of mathematical planning Plackett-Burman. The significant components of culture medium affecting microbial growth and production of carotenoids that can be used in cosmetic compositions were identified. The preliminary experiments were carried out in the co-cultivation of bacteria Salicola marasensis and algae Dunaliella salina that are autotrophic community component.

Размещено на Allbest.ru