Рассмотрение технической реализации основных биотехнологических процессов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рассмотрение технической реализации основных биотехнологических процессов, в первую очередь техники ферментации, целесообразно вести на основе универсальной технологической схемы, либо, как уже отмечено, аппаратура создается (подбирается) для реализации определенной технологии.

В части схемы, касающейся обработки продуктов ферментации, учтены следующие основные товарные формы продуктов: концентраты, биомассы, очищенные целевые продукты.

Схема в принципе охватывает все варианты культивирования:

глубинное и поверхностное (на жидких и твердых средах);

периодическое, отъемно-доливное и непрерывное;

стерильное и условно стерильное;

аэробное и анаэробное;

с использованием биокаталитических реакций (реактор полного перемешивания, иммобилизованные (ферменты, биомасса) системы и др.);

массовое культивирование растительных и животных тканевых клеток (кроме ряда специальных методов, используемых в лабораторных и пилотных масштабах, которые рассмотрены, например, в работе).

Предферментационные процессы начинаются с приготовления питательных сред в реакторе (1), далее проводится ее термическая стерилизация путем максимально быстрого нагревания до температуры стерилизации (4), выдержки (5) и максимально быстрого охлаждения до температуры ферментации или на несколько градусов выше ее (6). В схеме, во избежание чрезмерного усложнения, не отражена холодная стерилизация (ультрафильтрация) термолабильных компонентов (раздельная стерилизация сред). Доминирующими в настоящее время в промышленности являются аэробный (10) и анаэробный (9) ферментаторы (биореакторы). В схеме отражены и поверхностные ферментаторы как на твердых (12), так и па жидких (13) средах. Будущее принадлежит биокаталитическим реакторам (11). Принципиальную роль в определении товарной формы продуктов играют сепаратор (15) и дезинтегратор биомасс (18).

Рис. 4.1. Принципиальная схема реализации биотехнологических процессов.

1 -- реактор для приготовления питательных сред; 2 -- вихревой насос; 3 -- аппарат для приготовления и стерилизации сред из нерастворимых субстратов для поверхностной и твердофазной ферментации; 4 -- паровая колонка для подогрева питательных сред до температуры стерилизации; 5 -- выдерживатель питательных сред при температуре стерилизации; 6 - теплообменник для охлаждения стерильных питательных сред; 7 -- мерник -- сборник питательной среды; 8 -- дозатор; 9 -- анаэробный ферментатор; 10 -- основной глубинный аэробный ферментатор; 11 -- биокаталитический реактор; 12 -- различные конструкции поверхностных и твердофазных ферментаторов; 13 -- поверхностный ферментатор (протва) на жидких средах; 14 -- экстрактор; 15 -- сепаратор для отделения биомассы; 16 -- система локальной автоматики с или без ЭВМ для поддерживания режимов биосинтеза (АСУТП); 11 -- плазмолизатор биомассы для кормовых препаратов; 18 -- дезинтегратор биомассы; 19 -- выпарная установка: 20 -- фракционирование дезинтегратов; 21 -- сушилка и другие аппараты для обезвоживания; 22 -- аппаратура нормализации и расфасовки; 23 -- ионообменные колонны, мембранная аппаратура, аппараты реализации химических методов выделения, центрифуги, фильтры, выпарные установки, кристаллизаторы и другие устройства.

Условные обозначения: рН - растзор дл корректировки рН; П -- компоненты и среды для подпитки: Нос -- посенной материал: В -- стерильный сжатый воздух; ПАВ - стерильный пеногаситгль (поверхностно-активные вещества); Ср -- стерильная питательная среда; для процессов брожения, получения кормовых дрожжей и др. -- условно стерильная; БА -- биологический агент.

ПРЕДФЕРМЕНТАЦИОННЫЕ ПРОЦЕДУРЫ

ТРАНСПОРТ И ДОЗИРОВАНИЕ КОМПОНЕНТОВ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

По разнообразию и свойствам компонентов питательных сред биотехнология весьма близка к пищевой промышленности. Поэтому в качестве дозирующего оборудования для подачи компонентов сред в реактор для приготовления сред главным образом применяются весовые и объемные устройства из арсенала пищевой, химической и других отраслей промышленности. Транспорт осуществляется насосами, ленточными и шнековыми транспортерами, элеваторами, контейнерами и мешками на передвижных средствах и т. д. Сыпучие компоненты питательных сред нередко из транспортной тары засасывают в реактор вакуумом. Для этого к реактору подключают вакуум-насос.

Нередко применяется принцип предварительных смесей, например, соли предварительно растворяются, транспортируются насосами по трубопроводам и дозируются по объему.

Ряд солей может поставляться на предприятие в жидком виде. В этом случае хранение и все внутризаводские транспортные операции существенно упрощаются.

Вместо аммиачной воды в последних проектах предусматривается применение жидкого аммиака и его подача в газообразном состоянии в линию воздуха или в ферментатор по самостоятельному трубопроводу. Жидкий аммиак по проекту Латгипропрома поступает на завод в железнодорожных цистернах и хранится в рессиверах. Его транспорт и превращение в газообразное состояние осуществляется холодильной машиной МКТ 22-7-2 завода «Черкесскхолодмаш» в составе: компрессор аммиачный АВ-22, конденсатор КТГО-6Б, испаритель кожухотрубный ИТГ-9Б. Стерилизация (фильтрация) газообразного аммиака значительно проще холодной фильтрации аммиачной воды.

В большинстве случаев выбор средств внутризаводского транспорта и дозирования компонентов питательных сред серьезных инженерных трудностей не представляет.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ЖИДКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Жидкие питательные среды приготавливаются в реакторах с мешалкой. В зависимости от совместимости и растворимости компонентов сред могут быть применены отдельные реакторы и их системы. Если в состав сред входят нерастворимые компоненты (мука, мел и др.), технология средоварения усложняется (разваривание муки и т. п.), однако аппаратурная схема сохраняется. Реакторы выбираются с якорными или другого вида мешалками для взвесей. Для транспорта таких сред применяются специальные, допускающие наличие в среде взвесей насосы.

В конкретных технологиях могут быть применены специальные более сложные схемы и аппаратура для получения сред. Так, например, при производстве хлебопекарных дрожжей мелассные среды для получения нужного качества продукта специально осветляются. При производстве пива и этанола процесс средоварения включает осахаривание крахмала. Мучные среды могут быть подвергнуты дезинтеграции. При производстве кормовых дрожжей на гидролизатах из последних удаляется фурфурол. Нередко в состав сред входят экстракты или гидролизаты каких-либо продуктов, получение которых также относится к процессу средоварения. Если в рецептуру входят слаборастворимые ингредиенты, процесс эмульгирования также относится к средоварению.

В последних проектах для определения массы содержимого реакторов, мерников и промежуточных емкостей широко применяются тензометрические. Диапазон 40--800 кг.

СТЕРИЛИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

В настоящее время доминирует термический метод стерилизации питательных сред. Холодная стерилизация (фильтрация) применяется для термолабильных компонентов. Эти среды не должны содержать нерастворимых веществ.

Наиболее часто применяемая принципиальная схема стерилизации включает подогрев среды острым паром (в стерилизационной колонке) с последующим ее выдерживанием при нужной температуре и охлаждением.

Время стерилизации среды (выдержку) регулируют путем изменения длины труб или количества пластинчатых теплообменников, температуру -- подачей пара на подогрев. Для сред, содержащих термолабильные компоненты, необходимое время выдержки составляет иногда 18--20 мин при сравнительно низкой температуре, что трудно реализовать в проточных выдерживателях. Например, при производстве кормового лизина в этом случае применяются многокорпусные объемные выдсрживатели с перемешиванием (увеличением скорости потока) при передаче среды последовательно из корпуса в корпус.

Контрольно-измерительная и управляющая аппаратура линии стерилизации размещена на отдельном пульте управления или на общем пульте цеха ферментации.

Посевные питательные среды рекомендуется стерилизовать, а иногда приготавливать непосредственно в посевных ферментаторах. Последнее упрощает аппаратуру и уменьшает вероятность получения нестерильной культуры.

Стерилизация питательной среды для периодического процесса главной ферментации решается по-разному. Непрерывная стерилизация вне аппарата обеспечивает экономию тепла и минимум термической экспозиции питательных компонентов, хотя технически сложно осуществима и связана с повышенной вероятностью нестерильных операций, особенно на средах с нерастворимыми компонентами. Второй вариант -- подача среды, нагретой до температуры стерилизации, в рабочие ферментаторы с последующей ее выдержкой и охлаждением в аппарате -- более простой и надежный в отношении гарантий стерильности. Расход тепловой энергии и вероятность ухудшения свойств среды в результате длительного термического воздействия в этом случае возрастают.

При синтезе вторичных продуктов нередко необходимы более концентрированные среды для подпитки. Их стерилизация в принципе не отличается от таковой для основных сред. Однако обычно верхний предел допустимого содержания в них сухих веществ все же определяется техническими параметрами линии стерилизации (образование накипи, оседание и др.), а температура стерилизации и время выдержки -- составом среды (допустимая карамелизация и другие реакции компонентов среды).

Линии стерилизации сред для непрерывных процессов не отличаются от таковых для периодических.

Холодная стерилизация, как уже было отмечено, применяется в настоящее время только для термолабильных компонентов -- раствора мочевины, аммиачной воды и других корректирующих рН растворов -- для классической биотехнологии, ряда сложных сред -- для нетрадиционной биотехнологии. Основным аппаратом линии холодной стерилизации является мембранный фильтр. Ведущие иностранные фирмы «Полл корпорейшн», «Миллипор» и другие предлагают ряд мембран из полипропилена, целлюлозы, пористой нержавеющей стали, спеченной тканой проволочной сети, микроволохна, нейлона, эпоксидной смолой целлюлозы и других материалов. Мембраны чаще всего оформлены в виде фильтрующих патронов. Например, «Полл корпорейшн» наиболее часто предлагает патроны диаметром 70 мм, длиной 250--760 мм. Корпуса патронов изготавливаются из нержавеющей стали.

В линиях стерильных сред и других компонентов (а также для обвязки ферментаторов) в последних проектах применяется только сильфонная стальная нержавеющая арматура. В настоящее время стерильные сыпучие питательные среды реально используются при производстве ферментов поверхностным методом. Эти технологии и аппаратура в достаточной степени описаны [30], поэтому на них подробнее останавливаться не будем.

ДОЗИРОВАНИЕ ЖИДКИХ СТЕРИЛЬНЫХ

ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

И ДРУГИХ ЖИДКИХ КОМПОНЕНТОВ:

ПЕНОГАСИТЕЛИ, КОРРЕКТИРУЮЩИЕ

рН РАСТВОРЫ, ПОДПИТКА

Дозирование технологических потоков жидких сред в биотехнологии можно было бы осуществлять техническими средствами, аналогичными применяемым в пищевой, химической и других отраслях промышленности. Так эти операции выполняются при реализации нестерильных процессов (производство кормовых дрожжей, этилового спирта и т. д.). Однако особенность многих биотехнологий заключается в необходимости реализации процесса в асептических условиях, т. е. в дозировании стерильных, в большинстве случаев корродирующих, жидкостей.

Дозирование стерильных корродирующих жидкостей для периодических, отъемно-доливных и непрерывных способов культивирования реализуется при помощи индивидуальных групповых мерников, из которых соответствующий компонент вручную или автоматически подается в ферментатор согласно временному графику или величине соответствующего параметра процесса. Индивидуальные мерники моются и стерилизуются одновременно с ферментатором, для которого они предусмотрены. По мере развития техники ферментации дозирование жидкостей через мерники и емкости должно быть заменено использованием специальных дозирующих насосов или передавливанием с расходомерами на транспортной линии.

В практике биотехнологии вопрос техники дозирования целесообразно рассмотреть в комплексе со способами дозирования. Несколько примеров к сказанному.

Если ферментатор снабжен системой индикации уровня и состояния пены, то момент и доза подачи химического пеногасителя определяются этой системой, а в линии подачи от мерника (работает под избыточным давлением) до ферментатора собственно дозатор не нужен, достаточно иметь пневматическую или электромагнитную управляемую (с учетом инерции системы) запорную арматуру. При этом важен способ непосредственного ввода пеногасителя в аппарат (форсунка, механическое распыление и т. д.), а также общая схема пеногашения (химико-механическое, пневматическое, химическое).

Аналогично можно обойтись без дозаторов (расходомеров) при регулировании рН.

Несколько сложнее состояние вопроса при реализации стерильных непрерывных методов ферментации (хемостат, турбидостат и т. д.). В принципе возможно согласовать производительность линии непрерывной стерилизации с нужной скоростью протока в хемостате. Однако такие линии с трудом поддаются регулировке по производительности, поскольку приходится менять соотношение: время выдержки -- температура стерилизации. Поэтому обеспечение даже наиболее простого режима -- хемостата без промежуточной емкости (мерника) проблематична, и практически эти емкости применяются. Кроме того, следует отметить, что промышленный опыт технической реализации таких процессов весьма скуден. Так, например, в практике авторов настоящей работы производство лизина непрерывным методом -- это единственный процесс, где реально необходим хемостат в промышленных экспериментах.

Рассмотрение проблемы дозирования стерильных жидкостей целесообразно начать с лабораторных и пилотных масштабов. Практически все такие исследовательские установки, в том числе ФУ-8 и ФУ-30, комплектуются шланговыми насосами, которые при наличии гибких трубопроводов нужного качества и точного управления скорости вращения вала насоса обеспечивают нужные параметры дозирования и срок службы. Принцип работы таких насосов известен: периодическое пережимание шланга клавишным механизмом или скатывание специальных роликов по окружности петли шланга. Эти насосы допускают наличие суспензий в обрабатываемых потоках. Иностранные фирмы также выпускают шланговые насосы отдельно от ферментационных установок. В качестве примера можно упомянуть систему «Мастерфлекс» (США) производительностью 0,06--2280 мл/мин, имеющую до 10 параллельных каналов.

Промышленные насосы-дозаторы для стерильных жидкостей могут быть созданы на базе имеющихся в нестерильном исполнении путем уплотнения поршня, например применением специального сильфона. Такой пример описан в работе, и в настоящее время завод «Ригахиммаш» близок к выпуску первых отечественных промышленных насосов-дозаторов для стерильных жидкостей.

Ожидается также прогресс в создании надежных, действующих в стерильных корродирующих средах расходомеров. В таком случае, как отмечено выше, транспорт можно осуществлять насосами, передавливанием, самотеком и т. д.

ПРОВЕДЕНИЕ ПРОЦЕССОВ ФЕРМЕНТАЦИИ

Проведение процесса ферментации с точки зрения его инженерной реализации сводится к обеспечению дозированной согласно технологическому режиму подачи потоков в ферментатор, отвода из него культуральной жидкости, тепла, отработанного воздуха (газов) и измерению (если необходимо -- поддержанию) нужных для конкретного биологического агента физико-химических параметров среды, а также к управлению межфазным транспортом веществ в культуральной жидкости, т. е. обеспечению оптимальных концентраций субстратов/продуктов для конкретной культуры и гомогенности среды внутри биореактора. При этом большинство сред -- корродирующие, непрозрачные, многокомпонентные, пенящиеся. Они могут содержать нерастворимые компоненты.

Если задаться целью систематизации самих технологических способов, то, как показывает результат нашей попытки такой систематизации, их разнообразие настолько велико, что, в отличие от классификации конструкций аппаратов, получаемая система настолько сложна, что ее использование затруднительно.

ВЫБОР КОНСТРУКЦИИ БИОРЕАКТОРА

ТИПЫ ФЕРМЕНТАТОРОВ И ОСОБЕННОСТИ ПРОЦЕССОВ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Технически наиболее сложным процессом ферментации является глубинный, стерильный, непрерывный (с подпиткой),особенно на природном многокомпонентном сырье, образующем обильную пену.

Ферментаторы группы ФГ обычно обеспечивают дешевый продукт, поэтому они используются при производстве дрожжей и других крупнотоннажных продуктов. Введение механической энергии сокращает длительность процесса культивирования, но связано с увеличением затрат. В результате нередко технико-экономические расчеты суммарной эффективности той или иной; конструкции аппарата сложны и окончательный выбор типа аппарата длится годами. Примером может служить производство лизина, где в течение последних 15 лет так и не дан окончательный ответ, какая группа аппаратов (ФГ или ФЖГК) наиболее приемлема.

Хотя классификация ферментаторов нами подробно рассмотрена ранее, все же следует отметить, что в иностранной литературе эти аппараты чаще всего различают по конструктивным признакам:

аппараты с мешалками (ФЖГК -- по нашей системе);

барботажные колонные реакторы (ФГ). Однако в эту группу входят аппараты с динамическими диспергаторами -- эффекторами, инжекторами, соплами вентури (ФЖ), а также статическими соплами воздуха (ФГ). Деквер сюда же включает барботажные колонны с циркуляционным контуром обратного потока, хотя, после знакомства с данными Бланке, их можно также отнести к третьей группе;

третью группу, по мнению Бланке, составляют реакторы с выраженным (организованным) циркуляционным трактом (loop reactors), в том числе с механическими побудителями циркуляции (ФЖГК), газлифтные (ФГ), струйные (ФЖ), аппараты струи глубокого погружения (ФЖ) и др.

Аппараты для аэробной обработки сточных вод авторы не вводят в общую классификацию.

Как известно, ферментаторы, перечисленные выше, главным образом создавались и применялись в течение «эры» антибиотиков и кормовых дрожжей. Они широко применяются и в наши дни. Однако прогресс в получении рекомбинантных культур выдвигает специальные требования к аппаратуре -- биореакторам. Генетически модифицированные микроорганизмы являются более сложным объектом для биотехнологов и биоинженеров, так как при их использовании на первый план выдвигатся такие показатели, как стабильность модификаций биологических агентов, повышенные требования к асептике, лимитация срезовых усилий при перемешивании и т. д. Намечается тенденция объединить в биореакторе процессы биосинтеза и разделения полученных продуктов и биомасс. Нередко биореакторы этого класса комбинируются с внутренними или наружными системами мембран или осуществляется иммобилизация биологических агентов, что позволяет достичь высоких концентраций клеток, а следовательно, интенсифицировать процессы соответствующих биопревращений.

Среди быстро развивающихся конструкций для этих целей следует упомянуть:

биореакторы кипящего слоя (получение этилового спирта, циклоспорина, очистка сточных вод и др.);

биореакторы с подвижными микроносителями для биологических агентов, которые «любят» фиксироваться на поверхностях (получение интерферона и клеточных масс различного использования, например для продуцирования вирусов, для метанового брожения и т. д.). Системы весьма близки к иммобилизованным;

мембранные биореакторы с трубчатыми или ротирующими системами мембран (преимущественно экспериментальные) для выращивания клеточных культур и иммобилизации бактерий и дрожжей; применение широкое: получение вирусов, в том числе для производства вирусных вакцин, моноклональных антител, этанола, глюкозы, фруктозы и др.;

проточные колонны с иммобилизованными биологическими агентами широкого применения, начиная с получения этанола и кончая получением моноклональных антител.

ПРИНЦИПЫ ВЫБОРА БИОРЕАКТОРОВ

Выбор или разработка биореакторов осуществляется исходя из их назначения. Для исследовательских целей выбираются аппараты с универсальной системой перемешивания, для промышленных целей -- специализированные. Ферментаторы для твердофазных (поверхностных) процессов описаны в работе. Неотъемлемым элементом ферментаторов является система пенорегулирования.

ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУКТОВ

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ

Возможны следующие принципиальные варианты переработки культуральных жидкостей:

обезвоживание с получением всего сухого остатка в виде микробиологических концентратов;

фракционирование на биомассу и жидкую часть (фугат) с получением живой (хлебопекарные дрожжи, бактериальные удобрения и др.), ослабленной (вакцины) или инактивированной (кормовой белок) клеточной массы и продуктов различной степени очистки из фугата или фракций дезинтегратов биомасс.

Методы фракционирования - сепарирование, фильтрование, осаждение.

Исходным материалом для выделения продуктов микробиологического синтеза является культуральная жидкость, которая представляет собой сложную многофазную систему, содержащую клетки микроорганизмов, остатки питательной среды, жиры. Исследования фильтрационных характеристик культуральных жидкостей, в частности при получении антибиотиков, показали,, что содержание в них сухого остатка достигает 17% и более, а целевого продукта -- не превышает 1,5%.

Выделение целевого продукта из такой сложной смеси связано с определенными трудностями и, как правило, зависит от эффективной предварительной очистки культуральных жидкостей.

Независимо от типа биосинтеза (внеклеточное или внутриклеточное расположение целевого продукта) первой стадией подготовки культуральной жидкости для дальнейшей переработки является отделение взвешенной фазы -- биомассы. На производстве это связано с переработкой больших объемов труднофильтруемых суспензий, значительными потерями целевого продукта, в определенной степени влияющими на показатели последующих стадий очистки.

Фракционирование целесообразно осуществить путем сепарирования, имеющего ряд преимуществ перед фильтрацией и другими способами, а именно:

нет необходимости в применении фильтрующих добавок; кроме технологических удобств и экономии это позволяет ненужную для дальнейшей обработки фракцию использовать в корм животным;

сепарация как более надежный, непрерывный процесс дает-возможность обработать материал с наименьшими потерями активного вещества;

процесс легче поддается автоматизации, агрегаты занимают меньше помещений, легче осуществить мойку оборудования.

Сепараторы делятся на 4 группы:

1) осадительные, состоящие из ротирующего горизонтального цилиндра конической формы с расположенным внутри ротирующим (с меньшей скоростью) шнеком. Обрабатываемый материал вводится в центре, жидкая фракция выводится из конца цилиндра с большим диаметром, густая -- из другого конца, с меньшим диаметром;

2) кларификаторы с увеличенным объемом седиментационного пространства; густой продукт выгружается во время остановки машины;

саморазгружающиеся с пакетом конических тарелок и системой периодической выгрузки густой фракции в процессе работы;

форсуночные, также имеющие пакет конических тарелок и систему непрерывной выгрузки густой фракции через форсунки во время работы.

Технологические схемы, по которым работают сепараторы, зависят от свойств обрабатываемого и целевого продукта и отличаются разнообразием; нередко прибегают к последовательному включению сепараторов различных конструкций. С обработкой полупродуктов способом сепарирования связано получение хлебопекарных и кормовых дрожжей (в том числе из парафинов, метанола, этанола), медицинских антибиотиков, этилового спирта, дрожжевого экстракта, продуктов из зеленых водорослей, ферментов, аминокислот, витамина В12, вакцин, стимуляторов роста и средств защиты растений и многих других продуктов химико-фармацевтической, медицинской, микробиологической и пищевой промышленности.

Широко описаны и эксплуатируются дрожжевые сепараторы (4-я группа).

Основные проблемы, связанные с процессами сепарирования, "заключаются в создании эффективных сепараторов для выделения бактерий и других мелких частиц с определяющим размером 0,5-- 1,0 мкм и меньше, а также в обеспечении непрерывности операций, включая мойку и настройку форсунок и разгружающих систем с учетом свойств материала. Создает трудности обработка больших количеств культуральных жидкостей (при производстве кормового белка, кристаллических аминокислот и др.). Процесс осложняется и в случаях, когда переработке подвергается и фугат, т. е. когда необходимо его осветление, а также при фракционировании мицелиальных культур. Для сепарирования бактерий и осветления жидкостей применяются специальные аппараты из 3-й группы, с пакетом тарелок. Биомасса или твердые частицы собираются в камере с наружной стороны тарелок, откуда они периодически эвакуируются (с остановкой машины или без остановки). Мицелиальные культуры чаще всего фильтруются.

Фильтрование является менее энергоемким, но одновременно и менее интенсивным процессом по сравнению с сепарированием. Фильтрованию поддаются далеко не все культуральные жидкости; многие из них имеют свойство быстро закрывать (засорять) поры фильтрующего материала. Иногда специально меняют культуру, чтобы культуральная жидкость поддавалась фракционированию фильтрованием (например, процесс «Пэкилло», Финляндия).

В качестве оборудования для фильтрования применяют фильтр-прессы различной конструкции, барабанные вакуумные фильтры, ленточные фильтр-прессы и другие конструкции, например ФПАКМ 5,0 (площадь поверхности фильтрации 5 м2), ФПАКМ 2,5 (2,5 м2).

Для улучшения показателей фильтрации в фильтрах периодического действия используют вспомогательные фильтрующие материалы (ВФМ), которые на поверхности фильтрации образуют грунтовой фильтрующий слой. При отделении биомассы от культу-ральной жидкости актиномицетов -- продуцентов антибиотиков толщина грунтового слоя составляет 2,5 мм, а расход наполнителя при максимальной скорости фильтрации -- 8%. Первые 15--20 с процесс соответствует фильтрации с закупориванием пор намывного слоя, а далее протекает по типу фильтрации с накоплением осадка, что резко повышает ее скорость. Правильный выбор режима фильтрации определяет скорость фильтрации, расход фильтровального порошка, влажность мицелиального осадка и, соответственно, потери целевого продукта.

При производстве ферментных препаратов, особенно из бактериальных культур, для фильтрации культуральной жидкости используют ВФМ типа кизельгур (диатомит, инфузорная земля), бентонит, микрозил, фильтроперлит. Широкое применение находит фильтроперлит, однако не все ферменты индифферентны к нему.

Полученные после отделения биомассы фильтраты содержат наряду с целевым продуктом органические и неорганические вещества, белки как в растворенном, так и в коллоидном состоянии. По существу, культуральная жидкость представляет собой коллоидную систему, коагуляцию которой можно вызвать добавлением электролитов и неэлектролитов, изменением температуры, механическим воздействием и действием акустического поля.

Коллоидные и взвешенные частицы имеют отрицательный заряд и обладают существенной электрофоретической подвижностью; поэтому эффективным способом коагуляции коллоида может быть обработка его катионогенными коагулянтами.

Для выделения, очистки и фракционирования физиологически активных веществ, в частности антибиотиков, все чаще используют полимерные реагенты-флоккулянты. В отличие от неорганических электролитов и тепловой обработки флоккулянты позволяют проводить предварительную очистку культуральных жидкостей в более «мягких» условиях. дозирование ферментация культивирование фракционирование

При выделении ферментов к стадии предварительной обработки культуральной жидкости можно отнести процесс осаждения сульфатами протамина или стрептомицина нуклеиновых кислот, затрудняющих дальнейшее фракционирование белка. Немаловажную роль играет вязкость обрабатываемых растворов, значительно возрастающая в присутствии нуклеиновых кислот. При выборе способа осаждения нуклеиновых кислот необходимо руководствоваться достигаемым эффектом снижения вязкости раствора, полнотой удаления нуклеиновых кислот и степенью сохранности основной активности. Некоторые авторы высказываются против применения сульфатов протамина и стрептомицина как осадителей нуклеиновых кислот, основываясь на их высокой стоимости, и предлагают обработку нуклеазами. При относительно термостабильных белках предусматривается термообработка. Нагревание суспензии дезинтегрированных пекарских дрожжей в течение 20 мин при 50СС и биомассы Е. coil в течение 5 мин при 55СС приводит к удалению 85% нуклеиновых кислот. Повышение концентрации ионов Н+ вызывает денатурацию и осаждение нуклео-протеидов и неактивного белка, однако эта процедура требует особой осторожности и знания параметров стабильности выделяемого вещества. Изменение рН обрабатываемых растворов может не только служить способом удаления балластных белков, но и приводить к инактивации нежелательных сопутствующих активностей.

Как видно из сказанного, методы обработки культуральных жидкостей очень разнообразны и специфичны, поэтому мы ограничимся рассмотренными общими принципами и приведенными примерами.

ДЕЗИНТЕГРАЦИЯ БИОМАССЫ

В том случае, если целевые продукты содержатся в биомассе (внутриклеточные метаболиты), необходимой технологической операцией является дезинтеграция.

Основной критерий качества дезинтеграции -- максимальное сохранение структуры и функций компонентов клеток (органелл, биополимеров, физиологически активных веществ).

Большое количество клеточных компонентов обусловливает разнообразие целей и методов дезинтеграции микробных клеток. Эти методы разделяются на физические (механические), химико-экстрактивные и физиолого-биохимические. Дезинтеграция может быть одно- и многооперационной.

Из сотен известных способов дезинтеграции большинство составляют механические. Среди них преобладают баллистические методы, хорошо управляемые и обладающие сравнительно хорошими технико-экономическими показателями. Серийный выпуск механических дезинтеграторов организован в ФРГ, Швейцарии, США и других странах.

Выбор метода дезинтеграции зависит от свойств конкретной культуры и необходимого продукта, метода дальнейшей обработки дезинтегратов, цели дезинтеграции (аналитическая, производство) и ряда других факторов.

Для аналитических целей весьма часто применяют экструзион-ные дезинтеграторы с замораживанием продукта. Механическая дезинтеграция микроорганизмов широкого заводского применения еще не нашла. Чаще используются химико-экстракционные и физиолого-биохимические методы.

При выделении внутриклеточных метаболитов микроорганизмов физиолого-биохимическими способами разрушение клеточной оболочки осуществляется, безусловно, наиболее мягким образом (например, расщепление клеток при помощи литических ферментов).

Ферментативный способ дезинтеграции клеток особенно полезен при выделении субклеточных структур, которые могут разрушаться при дезинтеграции клеток механическими или химическими способами.

Развитие методов ферментативной дезинтеграции сдерживается сравнительно высокой стоимостью ферментных препаратов и отсутствием высокоочищенных литических ферментов. Литические ферментные препараты обычно малостабильны и нестандартны. Один из путей преодоления этих трудностей -- применение иммобилизованных ферментов.

Фракционирование дезинтеграторов (как и сами методы дезинтеграции) очень специфичны, поэтому подробнее на этих вопросах останавливаться не будем.

ПОЛУЧЕНИЕ МИКРОБНЫХ КОНЦЕНТРАТОВ

Одной из перспективных товарных форм продуктов биотехнологии являются концентраты, которые представляют собой сухой остаток (включая биомассу) культуральных жидкостей, частично обработанный (стабилизация, очистка, концентрирование и др.) или без предварительной обработки. В виде концентратов выпускаются ферменты, аминокислоты, витамины, кормовые антибиотики, бактериальные препараты, гидролизаты белков и др. Основной особенностью концентратов является наличие кроме целе вого компонента ряда сопутствующих веществ -- остатков питательной среды, агентов регулирования рН и пеногашения, водорастворимых побочных метаболитов и др.

Концентраты могут быть жидкими, порошкообразными и в виде смесей с наполнителями. Они гигроскопичны, слипаются и спекаются, так как экстрацеллюлярная часть культуральных жидкостей при обезвоживании сохраняет аморфное состояние. Вследствие этого сорбция влаги происходит по механизму абсорбции, т. е. сопровождается гидратацией ионов и молекул во всей массе препарата -- по существу, происходит образование раствора.

ПОЛУЧЕНИЕ БИОМАСС (КОРМОВЫХ, ОСЛАБЛЕННЫХ И ЖИВЫХ)

Кормовые биомассы (инактивированные), главным образом кормовые дрожжи, получают путем сепарирования культуральной жидкости, плазмолиза клеточной массы, упаривания, высушивания и расфасовки. Хлебопекарные дрожжи производят без плазмолиза и упаривания. Производства кормовых дрожжей являются самыми крупнотоннажными в биотехнологии, действуют сотни заводов, доступны многие книги по технологии их получения. Поэтому мы ограничимся лишь упоминанием этого вида биотехнологической продукции. Менее традиционные разделы классической биотехнологии -- производство вакцин, бактериальных удобрений, молочно-кислых бактерий, силосных заквасок и ряда других широко известных препаратов также в достаточной степени описаны ранее.

ПОЛУЧЕНИЕ ЦЕЛЕВЫХ ПРОДУКТОВ РАЗЛИЧНОЙ СТЕПЕНИ ОЧИСТКИ

Эта группа продуктов самая крупная. Наиболее широко применяемыми методами выделения и химической очистки являются экстракционные, ионообменные методы и осаждение. Отличительная особенность всех методов -- большое количество технологических стадий (неоднократное отделение -- фильтрация осадков, двух- и трехступенчатое экстрагирование, кристаллизация, концентрирование растворов вакуум-выпариванием, применение различных методов сушки и т. д.), разнообразие и сложность используемого оборудования, его разномасштабность (на первых стадиях объемы -- до сотен кубических метров, а на последних -- иногда несколько десятков литров). Так, например, применяются вакуум-барабанные фильтры, фильтр-прессы, друк- и нутч-фильтры, сепараторы и центрифуги различной производительности, экстракторы различных конструкций, ионообменные колонны, пленочные испарители разных систем, сушильные установки, работающие по принципу распыления, псевдоожижения, сублимации .льда, и другие виды оборудования. Поскольку, например, антибиотики -- сложные органические соединения, -- как правило, малостабильны и чувствительны к воздействию внешней среды (повышенная температура, изменение рН растворов и т. д.), то процессы химической очистки должны проводиться в условиях, максимально обеспечивающих стабильность препаратов.

Получение лекарственных препаратов высокой степени чистоты, особенно для инъекций, предъявляет ряд специфических требований к санитарным условиям производства. Конечные стадии (сушка, фасовка) должны проводиться в асептических условиях, для чего необходимы не только специальная обработка оборудования, вспомогательных материалов, помещений, соответствующая подготовка обслуживающего персонала, но и введение дополнительных технологических приемов, например очистки поступающего в помещения воздуха.

Вакуум-выпаривание. Вакуум-выпаривание как способ концентрирования широко распространен в химической и фармацевтической промышленности. При получении микробных метаболитов концентрация целевых продуктов в исходных растворах в большинстве случаев очень низкая (менее 1%), поэтому применение методов осаждения или непосредственного высушивания неэкономично.

Биологически активные вещества, синтезируемые микроорганизмами, как правило, обладают высокой термочувствительностыо. Во избежание потерь при выпаривании к аппаратуре предъявляются строгие требования: низкая температура испарения, кратковременный контакт с теплоносителем, возможность организации непрерывного процесса, особые конструкции, обеспечивающие выпаривание вязких жидкостей.

Благодаря прогрессу в вакуум-выпарной технике время контакта с теплоносителем уменьшилось с часов до минут и даже секунд.

Вымораживание. Все более широкое распространение как для концентрирования, так и обессоливания растворов находит вымораживание. Концентрирование вымораживанием основано на превращении воды в кристаллы льда с последующим механическим отделением их. При вымораживании важное значение имеют содержание воды и характер связывания ее с материалом, глубина и скорость вымораживания, величина и форма образующихся кристаллов, обусловленная тепловым обменом и временем кристаллизации.

Множество схем вымораживания строится в основном по трем принципам: многоступенчатое замораживание; одноступенчатое замораживание с рециркуляцией; распыление раствора на холодной поверхности.

При механическом отделении кристаллов льда (центрифугирование, вакуум-фильтрация, сепарирование) наблюдаются потери концентрата, которые тем больше, чем выше концентрация полученного концентрата. Во избежание этих потерь проводят переменное частичное подтаивание массы снега и двух-, трехкратное центрифугирование.

Несмотря на возможные потери, эксплуатация вымораживающих установок дешевле, чем выпарных аппаратов. Особенно перспективен этот метод при получении высокоочищенных ферментных препаратов.

Осаждение. Осаждение белков из водных растворов основано на изменении их растворимости при добавлении определенных веществ. Для получения очищенных ферментных препаратов в лаборатории широко применяют метод высаливания белков. Осаждение белка зависит от ряда факторов, влияющих па их растворимость, в основном от величины рН и концентрации раствора. Степень насыщения обрабатываемого раствора сульфатом аммония изменяется в очень широких пределах; в большинстве случаев ее находят эмпирически из-за сложности состава разделяемых смесей. Более того, степень насыщения неорганической солью различна на разных стадиях очистки и зависит от используемого. продуцента-микроорганизма.

Степень насыщения электролитом также специфична для осаждения каждого конкретного белка. Это легло в основу методов фракционирования биополимеров постепенным изменением степени насыщения электролитом. Использование фракционного высаливания сернокислым аммонием особенно целесообразно в случае ферментного комплекса и может успешно конкурировать с осаждением органическими растворителями.

Известно применение флотоагентов (толуола, жидких парафинов и др.). Среди реагентов, способных специфически связывать и осаждать ферменты, значительную роль играют растворимые синтетические или природные полимеры и полиэлектролиты.

При получении ферментов, в частности гидролаз, из культу-ральных жидкостей рекомендовано использовать танин и белковые добавки -- желатину, казеин, сыворотку, пептон или желатину с добавлением танина.

Кроме перечисленных полимеров способностью осаждать белки обладают и другие заряженные полимеры, такие, как ДЭАЭ-декстран, сульфат декстрана, полиэтиленимин, сульфат протамина.

Помимо осаждения полиэлектролитами известны способы образования малорастворимых соединений. На этом приеме, например, основана производственная технология выделения лимонной кислоты из культуральных жидкостей Aspergillus niger. Применение ионообменных и экстракционных процессов, а также прямой кристаллизации неэффективно из-за высокого содержания примесей, вносимых в питательную среду мелассой, и присутствия других органических кислот. Нейтрализация культуральной жидкости лимонной кислоты гидроокисью кальция или мелом в определенных условиях -- при рН 6,8--7,0 и температуре 100°С -- сопровождается образованием малорастворимого цитрата кальция. Частично происходит также осаждение кальциевых солей щавелевой, яблочной и сахарной кислот. Осадок затем промывают горячей водой и подвергают разложению под воздействием концентрированной серной кислоты. Полученный раствор лимонной кислоты (вместе с промывными водами),имеющий концентрацию не ниже 16%, поступает на вакуум-выпаривание и кристаллизацию. Фильтрат культуральной жидкости после отделения цитрата кальция упаривают и используют в качестве кормовой добавки.

Осаждение органическими растворителями, проводимое при охлаждении, -- один из распространенных способов концентрирования ферментных растворов. Он имеет ряд преимуществ перед высаливанием, в частности возможность регенерации, что положительно сказывается на экономических показателях процесса. Однако органические растворители не обладают способностью избирательного осаждения белков.

Мембранные процессы. В настоящее время в микробиологической и химико-фармацевтической промышленности все шире получают распространение сложные термически и химически лабильные органические соединения. Для качественного выделения этих веществ требуются «мягкие» условия производства, которым в значительной степени отвечают мембранные процессы. Внедрение мембранных процессов позволяет интенсифицировать технологию концентрирования биологически активных веществ, сокращая при этом потери каталитической активности. Мембранные методы разделения смесей, содержащих ферменты, значительно повышают качество продукции.

Основой разработки современных экономичных мембранных процессов явилось получение и последующее усовершенствование высокоселективных ацетатцеллюлозных и синтетических мембран. Так, за 10 лет, прошедших со времени получения мембран из ацетата целлюлозы, их проницаемость удалось увеличить примерно в 100 раз. Создание так называемых динамических мембран позволило повысить проницаемость по сравнению с мембранами из ацетата целлюлозы в 2,5 раза.

Среди жидкофазных мембранных процессов различают: диализ, электродиализ (преимущественно с использованием ионообменных мембран); ультрафильтрацию, обратный осмос.

Ультрафильтрация, функционально напоминающая обыкновенную фильтрацию, -- первый физический прием концентрирования очень разбавленных растворов, находящий широкое применение как в биотехнологии, так и в научных исследованиях. Применение ультрафильтрации имеет ряд преимуществ: исключается денатурация белка, так как процесс идет без фазовых превращений при любой температуре, когда смесь находится в жидком состоянии и растворенное вещество не испытывает влияния рабочего давления; возможны одновременное концентрирование и очистка от минеральных и низкомолекулярных органических веществ; незначительные затраты энергии, ультрафильтрационные установки отличаются простотой конструкции и эксплуатации.

Метод ультрафильтрации незаменим в непрерывных процессах -- выделение ферментов при ферментации, отделение биокатализаторов от полученного продукта в мембранных реакторах, очистка сточных вод и утилизация производственных отходов. Недостатком является эмпирический подход к подбору мембран для определенной стадии выделения биопрепарата. Теоретически предсказать ультрафильтрационные свойства растворов сложного состава невозможно, так как мембраны обычно стандартизируют чистыми веществами с определенной молекулярной массой.

Схемы получения высокоочищенных и кристаллических ферментных препаратов почти все включают ионообменную хроматографию, влекущую за собой некоторое разбавление растворов. Методы концентрирования их -- лиофилизация, вакуум-выпаривание или вымораживание -- вызывают значительную инактивацию ферментов.

Применение ультрафильтрации для концентрирования растворов ферментов заманчиво простотой исполнения. Однако на этот процесс влияют многие факторы, связанные со свойствами мембран, концентрируемых жидкостей, техникой фильтрации и ограничивающие его применение. Рациональное ведение процесса ультрафильтрации требует тщательной подготовки раствора.

Сорбция. В последние десятилетия широко развернулись исследования по применению сорбционных процессов при выделении продуктов микробного синтеза. Теория и практика применения ионного обмена наиболее интенсивно развивались в производстве аминокислот и антибиотиков.

Существует значительный разрыв между технологическими и лабораторно-препаративными методами выделения ферментов. В технологии, как правило, используют приемы фракционного осаждения, в лабораторной практике -- методы гель- и ионообменной хроматографии, аффинной хроматографии, электрофореза и др. Увеличение масштабов этих процессов от лабораторных до технологических -- задача сложная, так как используемые в лабораторной технике материалы не имеют удовлетворительных гидродинамических характеристик, исключающих возможность, интенсификации процессов.

Подбор ионитов и режимов сорбции, регенерации, промывки специфичны для конкретного процесса, поэтому подробнее на них не будем останавливаться.

Кристаллизация и сушка. Ряд продуктов микробиологического синтеза, в частности органические кислоты и некоторые аминокислоты, могут быть выделены из культуральных жидкостей прямой кристаллизацией.

Разработан и внедрен в производство способ получения итаконовой кислоты по следующей схеме: осветление культуральной жидкости активированным углем в количестве 0,3--0,5 об.%; 8-- 10-кратное упаривание под вакуумом при 50--60°С; кристаллизация и отделение кристаллов центрифугированием. Выход технической итаконовой кислоты составляет 80%.

Глутаминовую кислоту можно получить путем кристаллизации ее из упаренных культуральных жидкостей с выходом 73%, при условии, что исходное ее содержание не менее 20 г/л.

Метод прямой кристаллизации, однако, осуществим только npir условии, что используемые компоненты питательных сред мало-окрашенны и не содержат больших количеств балластных веществ. При содержании в питательных средах мелассы кристаллизация органических кислот и аминокислот сопровождается большими потерями и экономически невыгодна.

Помимо прямой кристаллизации производится большое количество препаратов, где кристаллизации подвергаются растворы различной степени очистки и концентрирования.

Обезвоживание термочувствительных продуктов микробного биосинтеза -- технологически сложный процесс. При выборе метода и режима сушки материалов различной природы основным: критерием служит качество сухого продукта. Применение тепловой сушки требует определить влияние на продукт температуры и времени нагрева, т. е. его термоустойчивость.

В сушке различных медицинских препаратов находит все большее применение сублимационный способ. Сублимационное высушивание защищает биологические материалы в процессе их хранения, так как без влаги многие химические, физические и ферментативные процессы затормаживаются или прекращаются. Можно сказать, что сублимационная (лиофильная) сушка -- наиболее прогрессивный метод обезвоживания биологических препаратов.

В СССР выпускают лиофилизированные установки типа ТГ-5, ТГ 15 и. ТГ-50 (цифра обозначает количество литров удаляемой за цикл влаги), из зарубежных наиболее популярны установки: фирм «Фригера» (ЧССР), «Лейбольд» (ФРГ), «Хохвакуум» (ГДР).

Несмотря на значительную термолабильность ферментов, показана возможность использования для получения сухих препаратов распылительной сушки. Простота конструкции и удобство в эксплуатации распылительных сушилок обусловили широкое их применение. На предприятиях Министерства медицинской и микробиологической промышленности СССР успешно работают отечественные и зарубежные распылительные установки, например сушилки СРЦ Сумского машиностроительного завода производительностью по испаренной влаге от 1 до 15 т/ч.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключение следует еще раз подчеркнуть, что вышесказанное можно рассматривать лишь как общее представление о методах выделения, очистки и концентрирования продуктов биотехнологии. Они очень специфичны, очень быстро развиваются, и фактически можно представить целый обзор по выделению и препаративным формам большинства выпускаемых промышленностью продуктов. Однако углубление в проблемы в такой степени не является нашей задачей и не входит в нашу компетенцию.

Ясно одно -- лабораторных методов исключительно много и результаты научных исследований в этой области позволяют выдвинуть в качестве первоочередных задач разработку и усовершенствование конструкции отдельных единиц технологического оборудования (сепараторов, дезинтеграторов, экстракторов, выпарных установок для термолабильных материалов, сушилок, ионообменных и ультрафильтрационных установок и др.), а также комплектных технологических линий для получения различных товарных форм микробных метаболитов. В то же время необходимо дальнейшее развитие исследований перспективных методов очистки, в том числе ультрафильтрации, других мембранных и сорбционных процессов. При этом основное внимание следует уделить разработке и организации промышленного выпуска сорбентов и ультрафильтрационных мембран.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков / Пер. с англ. -- М.: Мир, 1982. -- 263 с.

Баев А. А. Новые направления биотехнологии // Биотехнология. -- 1985. --

№ 2. -- С. 8--13.

Бекер М. Е. Введение в биотехнологию. -- М.: Пишевая пром-сть, 1978. -- 232 с.

Бекер М. Е. Микробная биоконверсия растительного сырья и перспектива ее использования // Вестн. АН СССР. -- 1983. -- № 6. -- С. 89--98.

Биотехнология микробного синтеза. -- Рига: Зинатне, 1980. -- 350 с.

Размещено на Allbest.ru

...