Изучение способности выделенных из буровых шламов микроорганизмов к синтезу биологических поверхностно-активных веществ в условиях повышенной солености среды

Materials and methods. The objects of this research were 6 microbial strains isolated from drill sludges: Halomonas sp. sample 1, Bacillus circulans NSh, B. firmus OBR 1.1, B. firmus OBR 3.1, Solibacillus silvestris OBR 3.2; B. circulans OBR 3.3 and the control oil-oxidizing microorganism Dietzia maris AM3. The ability of microorganisms to synthesize biosurfactants when cultured in a medium with different concentrations of NaCl was determined based on the index of surface tension reduction (Ac) of the culture medium and supernatants.

Results. It was found that five of the six studied microbial strains were capable of producing endo- and exo-surfactants when cultured in an environment with high salinity (3,5 and 6,5 % NaCl). The exception was the microbial strain Halomonas sp. OBR 1. Maximum values of Ac of the culture medium and supernatants were observed when cultivating B. firmus OBR 3.1 in an environment with a 3,5 % concentration of NaCl and B. circulans OBR 3.3; with a 6,5 % concentration of NaCl - B. circulans NSh and B. firmus OBR 1.1.

Conclusions. The properties of microorganisms isolated from drilling sludges capable of producing biosurfactants in conditions of high salinity of the environment, discovered by us, open the prospect of the practical use of these microorganisms in biotechnologies for detoxification of drilling waste.

Keywords: biosurfactants, microbial strains, the surface tension, of the culture medium, the supernatant.

Введение

Многие микроорганизмы способны синтезировать биосурфактанты и биоэмульгаторы - амфифильные соединения, различающиеся по структуре и химическим свойствам и способные выполнять много разных функций, такие как снижение поверхностного и межфазного натяжения, солюбилизация гидрофобных субстратов, разрушение эмульсии и др. [1, 2].

Благодаря природному происхождению, низкой токсичности, биоразлагаемости и относительной простоте получения, по сравнению с синтетическими сурфактантами, поверхностно-активные вещества, продуцируемые микроорганизмами, находят все большее применение в различных отраслях промышленности, медицины и сельского хозяйства [3]. Использование биоПАВ исключает необходимость их удаления из сточных вод из-за малой токсичности [4].

Синтетические ПАВ, широко использующиеся в настоящее время для очистки загрязненных нефтепродуктами почв, почвогрунтов, нефтешламов, других природных и техногенных субстратов, обладают потенциальным риском вторичного загрязнения объектов окружающей среды [5, 6].

В связи с ужесточением требований к внедрению экологически безопасных технологий и стремлением к минимизации загрязнений в технологиях утилизации отходов нефтяной индустрии предпочтительным является применение биоПАВ [7-9].

Ранее было показано, что микроорганизмы способны продуцировать биоПАВ с различной интенсивностью в зависимости от используемых субстратов и условий культивирования [10-12].

Изучение закономерностей роста микроорганизмов - потенциальных продуцентов биоПАВ - и подбор оптимальных условий культивирования для максимального синтеза биоПАВ являются актуальными научно-практическими задачами.

Цель настоящей работы состояла в оценке способности микроорганизмов - потенциальных продуцентов биоПАВ, выращенных в среде с различным содержанием №С1, к снижению поверхностного натяжения культуральной среды и супернатантов.

Материалы и методы

Объектами исследований являлись шесть микробных штаммов: Halo- monas sp. ОБР 1, Bacillus circulans НШ (В-12646), B. firmus ОБР 1.1 (В-12647), B. firmus ОБР 3.1 (В-12645), Solibacillus silvestris ОБР 3.2 (В-12644), B. circulans ОБР 3.3, выделенных А. Ю. Беляковым [13] из буровых шламов, отобранных из нефтяных скважин Восточной Сибири. Четыре штамма депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГБУ «ГосНИИгенетика» Минобрнауки России (ВКПМ, г. Москва).

Буровые шламы отличались специфическими свойствами: высокой щелочностью (рН 9) и высокой степенью минерализации (15 %). Поэтому микроорганизмы, выделенные из этих буровых шламов, характеризуются уникальным сочетанием эколого-функциональных свойств, в том числе широким субстратным спектром в отношении нефтяных углеводородов разной степени токсичности, алкало- и галотолерантностью, полирезистентностью к тяжелым металлам [14]. Для сравнения в настоящих экспериментах использовали нефтеокисляющий микроорганизм Dietzia maris АМ3, полученный из коллекции непатогенных микроорганизмов ИБФРМ РАН (г. Саратов).

Микроорганизмы культивировали в жидкой минеральной среде М9 [15] с различными концентрациями NaCl (0,05, 3,5 и 6,5 % по объему) при комнатной температуре в настольном шейкере-инкубаторе PSU-10i в течение суток. В качестве единственного источника углерода и энергии использовали глицерин (2 % по весу).

Абиотическим контролем служила минеральная среда разной степени минерализации с глицерином без микроорганизмов. В качестве посевного материала использовали смыв суточной культуры микроорганизмов (в случае D. maris АМ3 - трехсуточной) с мясо-пептонного агара (МПА) стерильным физиологическим раствором. Оптическая плотность посевной дозы составляла 0,2-0,5 ед. при длине волны 540 нм. Каждый вариант изучали в трех повторностях, измеряя поверхностное натяжение при температуре окружающей среды 25-27 °С методом отрыва кольца [16] в культуральной среде и в супернатантах, полученных центрифугированием при 12 000 об/мин в течение 5 мин на центрифуге Eppendorf 22331 MiniSpin.

По полученным результатам рассчитывали показатель снижения поверхностного натяжения (Да) как разницу между значениями поверхностного натяжения стерильной среды (контроль) и пробы исследуемой культуральной среды или супернатанта. Для всех полученных данных вычисляли средние значения, для сравнения которых использовали показатели стандартного отклонения и наименьшей существенной разницы. Статистическую обработку результатов проводили при p < 0,05 с помощью программного обеспечения Microsoft Excel 2010.

Результаты и обсуждение

Для микроорганизмов, выделенных из буровых шламов и являющихся объектами наших исследований, была присуща галотолерантность - одно из оригинальных эколого-функциональных свойств, имеющих важное прикладное значение.

Как было показано ранее [14], в нашем эксперименте все шесть микробных штаммов отличались заметным ростом при 3,5 и 6,5 %-й концентрации NaCl в полноценной питательной среде. Поэтому необходимо было оценить возможную продукцию биоПАВ данными микроорганизмами при их культивировании в минеральной среде с углеводородным субстратом в условиях повышенной солености. Результаты определения снижения поверхностного натяжения культуральной среды и супернатантов при культивировании микроорганизмов в среде в диапазоне NaCl представлены на рис. 1,0 и б. Как показали эксперименты, в абиотическом контроле (исходная среда без микроорганизмов) при всех исследованных концентрациях NaCl показатель снижения поверхностного натяжения культуральной среды равнялся нулю. При культивировании исследуемых микроорганизмов в среде с 0,05 %-м содержанием NaCl данный показатель варьировал от 11,16 до 19,80 мН/м. Минимальные значения зафиксированы для микробного штамма B. firmus ОБР 3.1, максимальные - для B. firmus ОБР 1.1 и Halomonas sp. ОБР 1 (см. рис. 1,о).

Согласно литературным данным, микроорганизмы, снижающие поверхностное натяжение более чем на 10 мН/м, могут являться перспективными продуцентами ПАВ [17, 18]. Поэтому все исследованные авторами микроорганизмы можно охарактеризовать как способные к синтезу биоПАВ. У контрольного нефтеокислящего штамма D. maris АМ3 при росте в данных условиях показатель Да культуральной среды составил 14,06 мН/м, что было сопоставимо с Да у других исследованных микроорганизмов или чуть ниже. микроорганизм утилизация биоремедиационный

Для определения типа биоПАВ регистрировали поверхностное натяжение не только в культуральной среде с микробными клетками, но и в супернатантах исследованных микроорганизмов. У всех изученных микроорганизмов, выросших в среде с 0,05 %-м содержанием NaCl, включая контрольный нефтеокислящий штамм D. maris АМ3, значения Да супернатантов были выше 10 мН/м, находясь в пределах от 10,98 до 16,64 мН/м, и незначительно ниже значений Да культуральной среды (см. рис. 1,б). Полученные данные свидетельствовали о синтезе экзоПАВ изученными микроорганизмами.

Рис. 1. Снижение поверхностного натяжения: а - культуральной среды; б - супернатантов при выращивании микроорганизмов: 1 - Halomonas sp. ОБР 1; 2 - B. firmus ОБР 1.1; 3 - B. firmus ОБР 3.1; 4 - Solibacillus silvestris ОБР 3.2; 5 - B. circulans ОБР 3.3; 6 - B. circulans НШ; 7 - D. maris АМ3 в среде с различным содержанием NaCl

В ходе экспериментов было установлено, что при культивировании исследуемых микроорганизмов в среде с 3,5 %-м содержанием NaCl значения Да культуральной среды находились в диапазоне от 5,23 до 12,86 мН/м (см. рис. 1,а). Минимальное значение наблюдалось у микробного штамма Halomonas sp. ОБР 1 (5,23 мН/м), при выращивании которого в среде с невысокой соленостью обнаружено, напротив, максимальное значение Да по сравнению с другими исследованными микроорганизмами, что указывало на неспособность данного штамма продуцировать биоПАВ в условиях повышенной солености среды.

За исключением Halomonas sp. ОБР 1, у остальных изученных микроорганизмов, включая контрольный нефтеокислящий штамм D. maris АМ3, значения Да культуральной среды были сходными, они превышали 10 мН/м, свидетельствуя о продукции биоПАВ.

Значения показателя снижения поверхностного натяжения супернатантов у всех исследованных микроорганизмов, культивируемых при 3,5 % NaCl, были выше, чем значения показателя снижения поверхностного натяжения культуральной среды (см. рис. 1,6).

Максимальное значение Да супернатанта зафиксировано у микробного штамма B. circulans ОБР 3.3 (17,58 мН/м), который также отличался и высоким значением Да культуральной среды, а также у микробного штамма B. circulans НШ (15,78 мН/м). У микробного штамма B. firmus ОБР 3.1 определены высокие значения показателя снижения поверхностного натяжения культуральной среды и супернатанта (12,86 и 14,25 мН/м соответственно).

Таким образом, все изученные микроорганизмы, включая контрольный нефтеокислящий штамм D. maris АМ3, снижали поверхностное натяжение культуральной среды и супернатантов более, чем на 10 мН/м (за исключением Halomonas sp. ОБР 1 в культуральной среде), что позволяет их считать перспективными продуцентами эндо- и экзоПАВ в условиях повышенной солености среды (3,5 % NaCl).

В результате экспериментов было выявлено, что при культивировании исследуемых микроорганизмов в среде с 6,5 %-м содержанием NaCl значения Да культуральной среды варьировали от 8,47 до 25,59 мН/м (см. рис. 1,а), значения Да супернатантов - от 8,99 до 30,94 мН/м (см. рис. 1,6). У микробного штамма Halomonas sp. ОБР 1 значения Да были невысокими (8,47 и 8,99 мН/м культуральной среды и супернатанта соответственно), аналогично данным, полученным при росте штамма в среде с 3,5 %-й концентрацией NaCl. Невысокие значения Да наблюдались и у контрольного нефтеокисля- щего штамма D. maris АМ3, выросшего в условиях высокой солености (8,43 и 8,56 мН/м культуральной среды и супернатанта соответственно). У остальных изученных микроорганизмов значения Да были выше 10 мН/м. Максимальные значения Да культуральной среды и супернатанта наблюдались у микроорганизмов: B. circulans НШ (22,65 и 30,94 мН/м соответственно) и B. firmus ОБР 1.1 (25,59 и 21,05 мН/м соответственно). У ряда исследованных микроорганизмов: B. firmus ОБР 3.1, B. circulans ОБР 3.3 и B. circu- lans НШ - значения показателя снижения поверхностного натяжения супернатантов были выше, чем значения Да культуральной среды.

Известно, что молекулярные механизмы осмоадаптации основаны на аккумуляции хлорид-ионов и катионов калия, которые, в свою очередь, индуцируют биосинтез осмолитиков. Ранее было показано, что у микробного штамма Azospirillum halopraeferens, проявляющего устойчивость к присутствию 3 % NaCl, основной стратегией осмоадаптации является внутриклеточное накопление органических растворенных веществ, таких как бетаин и пролин [19]. У нефтеокисляющего галотолерантного штамма Dietzia sp., выделенного из пластовых вод Ромашкинского нефтяного месторождения (Республика Татарстан), было идентифицировано другое осмопротекторное соединение - глицинбетаин [20].

Так как производные бетаина могут выступать в роли ПАВ, то можно предположить, что наличие подобных механизмов осмоадаптации у изученных авторами микроорганизмов, выделенных из буровых шламов, обусловливает повышенную продукцию ПАВ при культивировании данных бактерий в условиях соленой среды. Доказательством этого является увеличение способности бактерий снижать поверхностное натяжение. Также можно предположить, что микробный штамм Halomonas sp. ОБР 1 реализует иной механизм солеустойчивости, не связанный с синтезом соединений, обладающих свойствами ПАВ. Возможно, этот механизм сходен с обнаруженным свойством бактерий Halomonas boliviensis и H. longate, которые защищаются от высокой концентрации соли, синтезируя эктоин [21], который окружает себя и соседние белки слоем воды, стабилизируя клеточные мембраны и липиды, улучшая их подвижность.

Заключение

В ходе данных исследований при повышенной солености среды получены убедительные доказательства продукции эндо- и экзоПАВ микроорганизмами, выделенными из буровых шламов (за исключением микробного штамма Halomonas sp. ОБР 1). Использование микроорганизмов, способных продуцировать биоПАВ в присутствии соли, может заменить дорогостоящие технологии, направленные на снижение солености или удаление соли путем обратного осмоса, ионного обмена или электродиализа перед практическим применением биологической очистки. Поэтому изученные микробные штаммы как перспективные продуценты ПАВ в экстремальных экологических условиях могут быть применены в биотехнологиях ремедиации почв и вод, загрязненных органическими поллютантами и тяжелыми металлами, и для утилизации отходов нефтяной индустрии.