Верифікація скринінг-методу визначення залишкових кількостей стрептоміцинів у зразках меду

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів та кормових добавок

Верифікація скринінг-методу визначення залишкових кількостей стрептоміцинів у зразках меду

Д. Янович,

д-р с.-г. наук

З. Засадна,

канд. біол. наук

М. Ридчук,

канд. хім. наук

С. Плотиця,

канд. хім. наук

С. Кіслова,

старший науковий співробітник

О. Паздерська,

старший науковий співробітник

Анотація

Основним напрямком роботи Національної референс-лабораторії з контролю залишкових кількостей діючих речовин ветеринарних препаратів та кормових добавок є експертна оцінка безпечності меду за показником вмісту залишків антимікробних препаратів, який експортується з України до країн Європи та Америки. Вміст стрептоміцину та його похідного дигідрострептоміцину - одні з показників безпеки меду, які досліджують методом імуноферментного аналізу (ІФА). З 2002 року нами розроблено та запропоновано чітку схему контролю експортних партій меду на вміст залишкових кількостей цих аміноглікозидних антибіотиків тест-набором Рідаскрін® Стрептоміцин R3104, виробництва фірми Р-Біофарм (Німеччина).

Тест-набір було валідовано на рівні 2,0 та 5,0 мкг/кг з урахуванням мінімально необхідної межі визначення (МНМВ) або встановленої точки прийняття рішення (RPA), згідно з Рішенням Європейської Комісії 2002/657/ЕС та 2021/808/ЕС. Придатність методик підтверджено на основі встановлення основних валідаційних параметрів для скринінг - методів (технічного порогу та фактору відсікання) з використанням контрольних (чистих) та навантажених стандартними розчинами стрептоміцину на рівні Є МНМВ зразків меду за критерієм «додано-одержано». Підготовка зразків базується на попередній очистці зразків методом твердофазного екстрагування колонками С18, що сприяє не тільки очистці екстракту аналіту від впливу матриці, але й допомагає його додатковому концентруванню.

У статті представлено також результати верифікації та валідації тест-набору Стрептоміцин НА01904Н фірми Квінбон Біотек (Китай). Наведено результати досліджень контрольних (чистих) зразків меду та навантажених на рівні 2,0 та 5,0 мкг/кг стандартним розчином стрептоміцину. Оскільки перевагами апробованої методики є простота виконання та експресність, нами було запропоновано використовувати її у роботі лабораторій фірм - виробників та експортерів.

Ключові слова: стрептоміцин, дигідрострептоміцин, залишкові кількості, мед, іфа, валідація.

Abstract

Verification of the screening method for the determination of streptomycins residues in honey samples

Yanovych, Z. Zasadna, M. Rydchuk, S. Plotytsia, S. Kislova, O. Pazderska

State Scientific Research Control Institute of Veterinary Medicinal Products and Feed Additives

The main field of activity of the National Reference Laboratory of Veterinary Drug Residues Control is the expert evaluation of honey safety based on the parameter of antimicrobial drug residues in honey bathes exported from Ukraine to European and American countries. The content of streptomycin and its derivative dihydrostreptomycin is one of the safety parameters for honey, which is investigated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Since 2002, we have developed and proposed the clear scheme to control export honey batches on the content of residual amounts of these aminoglycoside antibiotics by means of Ridascreen® Streptomycin R3104 test kit from R-Biopharm (Germany).

The test kit has been validated at 2.0 and 5.0 pg/kg taking into account the minimum required performance limit (MRPL) or the set reference point for action (RPA) according to European Commission Decision 2002/657/EC and 2021/808/EC. The fitness-for-purpose of the methods was confirmed based on the establishing of main validation parameters for screening methods (technical threshold and cut-off factor) using control (blank) honey samples and spiked with streptomycin standard solutions at the level of Ц MRPL by means of «added - found» approach. The preparation of samples is based on the preliminary purification by the method of solid-phase extraction using C18 columns, which facilitates the purification the sample extract from the influence of matrix components as well as the additional concentration of the analyte.

The article also presents the results of the verification and validation of the Streptomycin NA01904H test kit from Kwinbon Biotechnology (China). The results of the assay of control (blank) honey samples and spiked with streptomycin standard solutions at the level of 2.0 and 5.0 pg/kg are given. Since the advantage of the approved method is the simplicity and rapidity of its performance, so we suggest using it in the laboratory practice of manufacturing and exporting companies.

Keywords: streptomycin, dihydrostreptomycin, residues, honey, elisa, validation

Основна частина

Стрептоміцин та його похідне - дигідрострептоміцин - це антибіотики групи аміноглікозидів. Ветеринарні препарати на основі цих антибіотиків авторизовано до використання для усіх жуйних тварин та свиней або як засоби захисту рослин в комбінації з антибіотиками групи пеніцилінів або тетрациклінів з широким спектром дії проти грам - негативних бактерій. Для контролю залишкових кількостей цих аналітів у продуктах тваринного походження (м'ясі, жирі, печінці, нирках молоці) встановлено максимально допустимі рівні (МДР) та, відповідно, кожного року в Україні розробляють План державного моніторингу залишків ветеринарних препаратів та забруднювачів. Стрептоміцин застосовують також у ролі пестициду для боротьби з фітофторозом плодових дерев, зокрема яблунь. Крім того, стрептоміцинами успішно лікують американський та європейський гнилець - одну з найбільш поширених хворіб медоносних бджіл. Однак, для захисту іміджу меду, як дієтичного натурального продукту, в багатьох країнах заборонено їх використання з цією метою (Rama et al., 2022).

Для визначення вмісту залишків стрептоміцинів в меді запропоновано багато різноманітних аналітичних та імунохімічних методів (Ferguson et al, 2002; Horie et al, 2004; Granja, 2008; Schuchet al., 2008; Alfredo et al. 2009; Rodrogo et al, 2009; Bohm et al., 2012; Wei et al, 2019). Мікробіологічні методи та Charm-тест описуються як слабо специфічні та недостатньо чутливі для такої матриці, як мед (Cara et al, 2013; Araby et al, 2020). Оскільки ні стрептоміцин, ні дигідрострептоміцин не мають сильної хромофорної групи, здатної до поглинання в ультрафіолеті, то метод високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ) з флуоресцентним детектуванням передбачає попередню очистку зразків твердофазним екстрагуванням та післяколонкову дериватизацію (Van Bruijnsvoort et al, 2004; Berrada et al, 2010).

Тому для проведення подальших досліджень нами вибрано метод імуноферментного аналізу на тест-системах Рідаскрін® Стрептоміцин виробництва фірми Р-Біофарм (Німеччина). Метод був валідований на рівні 10 мкг/кг та впроваджений в роботу лабораторії ще у 2004 році. У наступні роки у зв'язку з підвищенням вимог до контролю меду, вказаних у контрактах фірм-експортерів цього продукту, а, відповідно, і зниженням рівня вмісту стрептоміцину у зразках, нами була проведена валідація методу на рівні 5 мкг/кг. Застосований метод на високому рівні забезпечує контроль експортних партій українського меду у країни Європейського Союзу та Америки.

У 2022 р. китайською фірмою Квінбон Біотек запропоновано тест-набір для визначення залишкових кількостей стрептоміцину/дигідрострептоміцину у зразках меду методом імуноферментного аналізу (НА01904Н).

Метою нашої роботи була верифікація нового тест-набору виробництва фірми Квінбон Біотек Стрептоміцин та вивчення можливостей його впровадження у роботу виробничих лабораторій для проведення вхідного контролю зразків меду, що надходять на первинний контроль.

Матеріали і методи. Реактиви. Метанол (for HPLC, Sigma-Aldrich), вода високоочищена бідистильована (система Milli-Q, Millipore), натрієва сіль гептан-1 - сульфонової кислоти (Sigma-Aldrich), натрій ортофосфат, натрій хлорид, натрій дигідрофосфат дигідрат, (Sigma-Aldrich), колонки для твердофазної екстракції С18 (Рідаскрін, фірми Р-Біофарм).

Стандарти. Розчин стандартного зразка стрептоміцину надається у наборі у концентрації 1 мг/л.

Обладнання. Основне лабораторне обладнання для пробопідготовки зразків, спектрофотометр (рідер), оснащений фільтром на 450 нм.

Приготування зразків. Дослідження проводили на зразках меду, попередньо перевірених на вміст аналітів. Для проведення імуноферментного аналізу зразки меду готували згідно з методиками, наданими виробниками тест-наборів Рідаскрін (Німеччина) та Квінбоне Біотек (Китай).

За інструкцією до німецького набору, зразки меду ретельно розчиняють у екстракційному буфері з рН 2,0, очищають та концентрують методом твердофазного екстрагування на октадециловій колонці С18 (ТФЕ). Після очистки зразки додатково концентрують висушуванням елюату у ротаційному випарювачі до сухого залишку. Фактор концентрування - 2. Аналіз підготовлених зразків проводять згідно з інструкцією, наданою виробником набору.

Згідно з інструкцією до китайського набору, зразки меду ретельно розчиняють у деіонізованій воді, осаджують тверді частинки центрифугуванням та розводять у екстракційному буфері, який надається у наборі. Аналіз підготовлених зразків проводять згідно з інструкцією набору.

Результати й обговорення. Мед вважається дієтичним натуральним чистим продуктом з лікувальними властивостями, тому, відповідно, до Директиви 2001/110/ЄС, він не повинен містити залишків жодного антимікробного ветеринарного препарату. Застосування у бджільництві препаратів, дозволених для лікування тварин та птиці, створює потенційні загрози для імпорту меду до країн Європейського Союзу. У зв'язку з такою ситуацією, лабораторією з 2002 року впроваджено скринінг-контроль зразків меду, призначених для експорту, на визначення залишкових кількостей антибіотиків групи стрептоміцинів тест-набором Рідаскрін®Стрептоміцин. Специфічність набору до стретоміцину складає 100%, а до дигідрострептоміцину - 69%. Валідацію набору проводили у 2002 р. за методом «додано-отримано»: дослідження контрольних (чистих) зразків меду та контрольних зразків, навантажених стандартним розчином стрептоміцину на рівні Ц встановленої на той час Мінімально Необхідної Межі Визначення (МНМВ) - 10 мкг/кг, а у 2016 р., у зв'язку з посиленням контролю за безпечністю меду, була проведена повторна валідація набору на рівні 5 мкг/кг, передбаченому Планом державного моніторингу залишків ветеринарних препаратів та забруднювачів. Результати валідації методики представлено у таблиці 1.

Таблиця 1. Результати оцінки придатності методики набору Стрептоміцин для визначення залишкових кількостей стрептоміцину у зразках меду тест-набором фірми Р-Біофарм на рівні 5,0 мкг/кг, (n=20)

Зміна вимог щодо безпеки меду у Європейських країнах, та, відповідно, і у контрактах фірм - експортерів меду, а також модифікація тест-набору виробниками, призвели до необхідності проведення валідації набору на рівні 2 мкг/кг. Отримані результати представлено у таблиці 2.

Таблиця 2. Результати оцінки придатності методики набору Стрептоміцин для визначення залишкових кількостей стрептоміцину у зразках меду тест-набором фірми Р-Біофарм на рівні 2,0 мкг/кг, (n=20)

Дані табл. 1 та 2 підтверджують придатність тест-набору для дослідження експортних партій меду на вміст антибіотиків групи стрептоміцину як на рівні 5 мкг/кг, так і на рівні 2 мкг/кг з витягом 86,4 та 99,7%, відповідно, що забезпечує високу якість проведення аналізу на цьому рівні.

Однак, підготовка зразків передбачає довготривалий процес очистки екстракту аналіту від складного матричного впливу компонентів меду із використанням додаткових засобів, що значно здорожчує цей процес. Тому для полегшення моніторингових досліджень зразків меду на вміст стрептоміцинів для проведення вхідного контролю виробничими лабораторіями фірм-експортерів меду нами було проаналізовано тест-набір Стрептоміцин фірми Квінбон Біотек. Тест-набір дає можливість визначати залишкові кількості стрептоміцину зі специфічністю 100% та дигідрострептоміцину - зі специфічністю 106% у зразках меду та маточного молочка. Межа виявлення аналітів складає, згідно з інструкцією, 1 та 1,5 мкг/кг, відповідно. Підготовка зразків меду, згідно з інструкцією виробників, значно простіша, ніж у німецького набору, і передбачає тільки розведення зразків деіонізованою водою та подальше перерозчинення у екстракційному буфері, який надається в наборі.

Перевірку роботи набору проводили за двома методиками підготовки зразків для аналізу: подвійним розведенням зразків (за інструкцією виробника набору) та з попередньою очисткою твердофазним екстрагуванням, концентруванням шляхом висушування (за інструкцією до набору Р-Біофарм). В роботі використано контрольні (чисті) зразки меду, перевірені методом імуноферментного аналізу набором Стрептоміцин фірми Р-Біофарм, та контрольні зразки меду, навантажені на рівні 2 та 5 мкг/кг стандартним розчином стрептоміцину, що надається у наборі. Результати проведених випробувань представлені в таблицях 3 та 4.

Таблиця 3. Результати оцінки придатності методики набору Стрептоміцин фірми Квінбон Біотек для визначення залишкових кількостей стрептоміцину у зразках меду (спосіб підготовки зразків виробника) на рівні 2,0 мкг/кг, (n=10)

Таблиця 4. Результати оцінки придатності методики набору Стрептоміцин фірми Квінбон Біотек для визначення залишкових кількостей стрептоміцину у зразках меду (спосіб підготовки зразків виробника) на рівні 5,0 мкг/кг, (n=10)

Як видно з даних таблиць 3 та 4. застосування спрощеної підготовки зразків, згідно з інструкцією до набору, дає можливість визначати вміст стрептоміцину у чистих зразках меду, навантажених на рівні 2 та 5 мкг/кг стандартним розчином стрептоміцину. Витяг складає 120,3% та 134,3%, відповідно. Високий відсоток витягу не співпадає з задекларованою виробником величиною (90+15%), однак не має значного впливу на проведення вхідного контролю зразків меду, отриманих безпосередньо від пасічників. Коротка методика підготовки зразків дає можливість швидко та якісно відсікати потрапляння позитивних по стрептоміцину та дигідрострептоміцину зразків при формуванні експортних партій меду.

Для перевірки способу підготовки зразків за інструкцією виробника також було використано природньо забруднені зразки меду на рівні 2 та 5 мкг/кг. Відсоток витягу аналіту для таких зразків складав 112,9 та 122,7, відповідно. Це однозначно підтверджує можливість використання набору фірми Квінбон Біотек для моніторингу великої кількості зразків меду та незначними часовими затратами.

Перевірку можливості застосування тест-набору Квінбон Біотек для аналізування експортних партій меду проводили з використанням пробопідготовки з ТФЕ очисткою зразків на колонках С18 за методикою, наданою для набору фірми Р-Біофарм. Результати визначення здатності набору визначати залишки стрептоміцину у зразках, навантажених на рівні 2 та 5 мкг/кг, представлено в таблиці 5 та на рисунку.

Таблиця 5. Результати оцінки придатності методики набору Стрептоміцин фірми Квінбон Біотек для визначення залишкових кількостей стрептоміцину у зразках меду (спосіб підготовки зразків з очисткою ТФЕ) на рівні 5,0 мкг/кг, (n=12)

Як видно з отриманих результатів, використання твердофазного екстрагування зменшує вплив матриці на результат імуноферментного аналізу майже у 5 раз як для контрольних зразків (вплив матриці меду на рівні 0,3 мкг/кг при використанні ТФЕ проти 1,65 мкг/кг за пробопідготовкою виробника наборів), так і для навантажених розчином стандарту стрептоміцину на рівні 5 мкг/кг (визначений вміст аналіту становив 4,4 мкг/кг проти 8,7 мкг/кг без проведення ТФЕ). Відповідно витяг аналіту з урахуванням впливу матриці для такого варіанту дослідження склав 81,8% проти 134,3% у випадку повного відтворення методики, наданої виробником набору.

Результати валідації підтверджують здатність набору до визначення аналіту на рівні 5 мкг/кг у зразках меду, витяг складає 81,8%, що забезпечує якість проведених випробувань на вказаному рівні. За отриманими експериментальними даними було розраховано здатність виявлення (CCP) - 0,5 мкг/кг та фактор відсікання запропонованої методики - 3,5 мкг/кг.

Визначення здатності виявлення стрептоміцину (ССР) у зразках меду, навантажених на рівні 2 мкг/кг (а) та 5 мкг/кг (б)

експортний мед контроль антибіотик

Як видно з рисунка, набір дозволяє визначати залишки стрептоміцину на рівні 2 та 5 мкг/кг з високою ймовірністю. Відсоток витягу аналіту для зразків, навантажених на рівні 2 мкг/кг складає 93,9, а для навантажених на рівні 5 мкг/кг - 81,8. Отримані дані підтверджують можливість використання набору фірми Квінбон Біотек для проведення досліджень експортних партій меду за використання підготовки зразків з очисткою та концентруванням твердофазним екстрагуванням.

1. Для покращення системи контролю безпечності меду за показниками вмісту антибактерійних препаратів, у даному випадку - залишкових кількостей стрептоміцину, було верифіковано та валідовано тест-набір Стрептоміцин фірми Квінбон Біотек (Китай). Перевірку набору проведено двома способами підготовки зразків меду: запропонованим розробниками набору та попередньою очисткою та концентруванням аналіту твердофазним екстрагуванням на колонках С18. Оцінку придатності проводили за принципом «додано-одержано»: чисті контрольні зразки меду, попередньо перевірені на наявність залишків стрептоміцинів на рівні 2 та 5 мкг/кг.

2. Отримані дані підтвердили можливість використання цього тест-набору для проведення вхідного контролю меду з використанням підготовки зразків, запропонованої фірмою виробником, а також дослідження експортних партій меду, застосовуючи підготовку зразків з твердофазним екстрагуванням.

Перспективи досліджень. Розробка підтверджуючого УЕРХ-МС/МС методу визначення аміноглікозидів у меді, зокрема стрептоміцину та дигідрострептоміцину, придатного для контролю зразків меду, згідно з вимогами українського та європейського законодавства.

Література

1. Alfredo, M., Montes, Nino (2009). Determination of streptomycin residues in honey by liquid chromatography-tandem mass spectrometry Analytica Clinica Acta 637, 64-67

2. Araby, E, Nada, HG, Abou, El-Nour SA, Hammad, A. (2020). Detection of tetracycline and streptomycin in beef tissues using Charm II, isolation of relevant resistant bacteria and control their resistance by gamma radiation. BMC Microbiol 20 (1), 186. DOI.org/10.1186/s12866-020-01868-7.

3. Berrada, H, Molto, JC, Manes, J, Font, G. (2010). Determination of aminoglycoside and macrolide antibiotics in meat by pressurised liquid extraction and LC-ESIMS. J Sep Sci. 33 (4-5) 522-529 DOI: 10.1002/jssc.200900682.

4. Bohm, D.A., Stachel, C.S., Gowik, P. (2012). Confirmatory method for the determination od streptomycin and dihydrostreptomycin in honey by LC-MS/MS. Food Additives and Contaminants: Part A 28 (2). 189-196 DOI: 10.1080/19440049.2011.635347.

5. Cara, M.C., Dumitrel, G.-A., Mirel, G., Carmen, M., Silaghi-Peiju, D. (2013) Thermal degradation of streptomycin residues in honey during storage. Food technology and Biotechnology 51 (3), 429-433.

6. Commission Decision of 12 August 2002 (2002/657/EC) implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results.

7. Commission Implementing Regulation (EU) 2021/808 of 22 March 2021 on the performance of analytical methods for residues of pharmacologically active substances used in food-producing animals and on the interpretation of results as well as on the methods to be used for sampling and repealing Decisions 2002/657/EC and 98/179/EC. Official Journal of the European Union. 2021, L180, 84-109.

8. European Union. (2010). Directive 2010/37/EC of the European Parliament and of the Council of 22 December 2009 on pharmacologically active substances and their classification regarding maximum residue limits. Journal of the European Communities. Page (L15): 1-72.

9. Ferguson, J.P., Baxter, G.A., McEvoy, J.D.G., Stead, S., Rawings, E., Sharman, M. (2002). Detection of streptomycin and dihydrostreptomycin residues in milk, honey and meat samples using an optical biosensor. Analyst 127 (7), 951-956 DOI.org/10.1039/B200757F.

10. Granja, R.H.M.M. (2008) Determination of streptomycin residues in honey by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Conferenc Euroresidue VI Edmond aan Zee. 3.

11. Horie, M., Saito, H., Natori, T., Nagata, J., Nakazawa, H. (2004). Determination of streptomycin and dihydrostreptomycin in honey by liguid chromatography-electrospray mass spectrometry. J. of liguid Chromatography and related technologies 27 (5) 863-874

12. Rama, A., Harizi, I., Miftari, I., Zuka, A., Zhuri, B., Lafiti. A., Hasani, D., Latifi, F. (2022). Determination of Streptomycin residues in imported and locally produced honey in Kosovo. Intern. J. of Food Contamination 9.

13. Rodrogo, HMM. Granja, Alfredo, M. Montes, Nino, Roberto, A.M. Zucchetti, Rosario, E. Montes Nino, Raj, Patel, Alessandro, G. Salerno (2009). Determination of streptomycin residues in honey by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta 637 (1-2) 6467. DOI.org/10.1016/j.aca.2009.01.006.

14. Schuch, R., Mayerhofer, G., Schwaiger-Nemirowa, I., Kuhn Th. (2008). Determination of streptomycin in honey by means of LC/MS-MS. Australian Agency for Health and Food Safety (AGES). Test procedure CC_VIE_TAHO_230. Version 01. 1-13.

15. Van Bruijnsvoort, M, Ottink, SJM, Jonker, KM, De Boer, E (2004). Determination of streptomycin and dihydrostreptomycin in milk and honey by liquid chromatography with tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A 1058 (1-2), 137-142. DOI.org/10.1016/j.chroma.2004.07.101

16. Zai, I.U.M, Rehman, K, Hussain, S.A. (2013) Detection and quantification of antibiotics residues in honey samples by chromatographic techniques. Middle-East J. Sci. Res 14 (5), 683-687. DOI.org/10.5829/idosi.mejsr.2013.14.5.2114.

17. Wei, L., Liu, Y., Sun, L., Cheng, Z., Su, S., Zhao, Y. (2019). Determination of streptomycin and dihydrostreptomycin residues in honey by hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Chines. J. of Chromatography 37 (7) 735-741

Размещено на Allbest.ru