Размещено на http://www.allbest.ru/

Медицинский университет Астана

Кафедра Молекулярной биологии и медицинской генетики

Самостоятельная работа

Тема: Основные принципы лечения наследственной болезни генной терапии

г. Астана 2012г.

Содержание

Введение

1. Генная терапия

1.1 Перспективы, общие сведения

1.2 Генная терапия: три стратегии

1.3 Генная терапия: спектр возможных для лечения болезней

2. Генная терапия: два пути введения генетической информации больному

2.1 Генная терапия: вставка здорового гена в дефектные клетки

2.2 Генная терапия: усиление иммунного ответа

2.3 Генная терапия: практические проблемы

3. Генная терапия: средства доставки трансгенов в клетку

3.1 Генная терапия: применение антисенс-олигонуклеотидов

3.2 Генная терапия: наследственные болезни

Заключения

Введение

В этом очерке мы познакомимся с основными принципами, на которых основывается важнейший элемент медицины 21 века - генная терапия. Мы посмотрим, как генная терапия развивается в направлении лечения наследственных заболеваний, приобретенных заболеваний таких, как рак или атеросклероз и инфекционных заболеваний, таких как СПИД.

Мы познакомимся со способами введения генов в больные клетки и организмы для того, чтобы компенсировать генетический дефект, делающий клетку больной, или, если это раковая клетка, то чтобы придать ей свойства, достаточные для уничтожения этой и подобных клеток иммунной системой.

Мы познакомимся с двумя основными стратегиями генной терапии - ex vivo и in vivo. Узнаем, что когда сегодня говорят о генной терапии, то имеют ввиду генную терапию соматических клеток. Увидим, что генная терапия и трансгеноз тесно связаны, но при генной терапии, в отличие от трансгеноза, трансгены не вводят в зародышевые линии клеток. Я хотел бы, чтобы было понятно, что генная терапия находится в самом начале своего пути. Поэтому обращайте внимание на основные принципы. Результаты же - впереди.

Откроем Science,269, от 25 Августа 1995 и прочтем: "В последнем сентябре, когда Ашанти Де Сильва, приветливая 8-летняя девочка появилась перед Научным Советом, председатель, в то время конгрессмен Джордж Браун, сказал: "Перед нами доказательство того, что чудо свершилось". О каком же чуде здесь идет речь? Эта девочка страдала наследственным заболеванием - недостаточностью аденозиндезаминазы, и в сентябре 1990 года ее начали лечить с помощью генной терапии. И вот она жива здорова и ходит в школу. Простим американскому конгрессмену использование термина "чудо", ибо сказано: "Чудеса нельзя приводить в доказательство" (Талмуд). Противопоставим ему следующую пословицу: " Если случилось чудо, значит оно не чудо". И действительно - чуда не случилось. Просто настало время, когда незримые для тех, кого мы называем широкой публикой или, если угодно, налогоплательщиками, исследования генетики, молекулярной биологии биоорганической химии, биохимии концентрированно проявляются в зримом каждому, социально значимом результате - на наших глазах рождается медицина 21-века. Об этом мы поговорим более подробно позже, а сейчас вот такие цифры: (Nature,378,#6558, 655,1995). Институты Национального Института Здоровья в США (NIH) в 1995 израсходовали на генную терапию 181.5 миллионов долларов из 11.3 миллиардного бюджета. Из них 50 миллионов израсходовано на фундаментальные исследования. Одобрено 136 клинических протоколов. 910 субъектов подверглись переносу генов в США и 1024 - в мире. Нужно сразу сказать, что пока нет однозначных результатов. В значительной степени исследования в этой области продолжают оставаться фундаментальными. Но то, что происходит, означает, что в короткий срок генная терапия перестала быть просто фантазиями энтузиастов, а стала реальностью. Что же такое генная терапия?

Концепция генной терапии существует уже на протяжении последних десятилетий. Она заключатся в том, что наиболее радикальным способом борьбы с разного рода заболеваниями, вызываемыми изменениями генетического содержания клеток, должна быть обработка, направленная непосредственно на исправление или уничтожение самой генетической причины заболевания, а не ее следствий. Причиной может быть мутация в зародышевой линии клеток, которая передается по наследству при наследственных заболеваниях, это может быть соматическая мутация, которая вызывает, например, рак, или это может быть изменение вследствие появления в клетке чужеродного генетического материала, например, в результате вирусной инфекции. Способ же борьбы с этими генетическими изменениями заключается в искусственном введению в пострадавшую клетку новой генетической информации, призванной поправить ту, с которой связана болезнь. Эта концепция, по-видимому, появилась сразу после осознания механизмов трансформации клеток опухолеродными вирусами. Они, эти вирусы, осуществляли стабильное внедрение генетического материала в геном клетки хозяина, и поэтому тогда же было предложено использовать их, как векторы для доставки желаемой генетической информации в геном клеток, чтобы в случае необходимости поправлять клеточные дефекты и лечить болезни генома. Однако это были только общие идеи. Предстояло решить массу технических и этических проблем, прежде чем достичь сегодняшних успехов и надежд. Серьезным уроком и предостережением послужила крайне неудачная попытка вылечить талассемию с помощью введения гена. Это было сделано в 1980 году. Исторически генная терапия нацеливалась на лечение наследственных генетических заболеваний, но впоследствии поле ее применения, по - крайней мере теоретически, расширилось таким образом, что она стала рассматриваться, как потенциально универсальный подход к лечению практически всего спектра болезней, начиная от инфекционных, включая так называемые болезни современного общества такие как рак, атеросклероз, диабет и кончая классически генетическими, наследственными заболеваниями.

1. Генная терапия

Генная терапия -- совокупность генно-инженерных (биотехнологических) и медицинских методов, направленных на внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток человека в целях лечения заболеваний. Это новая и бурно развивающаяся область, ориентированная на исправление дефектов, вызванных мутациями (изменениями) в структуре ДНК, или придания клеткам новых функций.

Технологии генодиагностики и генотерапии базируются на мировых достижениях в расшифровке генома человека. Технологии генодиагностики включают разработку приемов точной локализации генов в геноме человека, ответственных за наследственные и соматические заболевания, а также методологии пренатальной и доклинической диагностики. Их важной составляющей является сравнительный анализ структуры генома в норме и патологии.

Среди технологий генотерапии в настоящее время актуальны следующие: генотерапия соматических клеток, генотерапия репродуктивных (половых) клеток, генотерапия с использованием рибозомов и антисенс-ДНК.

1.1 Перспективы, общие сведения

Существует несколько способов введения новой генетической информации в клетки млекопитающих. Это позволяет разрабатывать прямые методы лечения наследственных болезней - методы генотерапии.

Используют два основных подхода, различающиеся природой клеток-мишеней:

- фетальную генотерапию, при которой чужеродную ДНК вводят в зиготу или эмбрион на ранней стадии развития; при этом ожидается, что введенный материал попадет во все клетки реципиента (и даже в половые клетки, обеспечив тем самым передачу следующему поколению),

- соматическую генотерапию, при которой генетический материал вводят только в соматические клетки и он не передается половым клеткам.

Есть и третий подход - активация собственных генов организма с целью полного или частичного преодоления действия мутантного гена. Яркий пример такого подхода - использование гидроксимочевины для активации синтеза гемоглобина F у больных с серповидноклеточной анемией и талассемиями.

1.2 Генная терапия: три стратегии

генный терапия болезнь клетка

Стратегии генной терапии можно разделить на три крупных блока.

Одна из них используется в тех случаях, когда клетки, которые нужно вылечить, потеряли функцию какого-либо гена, и для лечения нужно эту функцию восстановить. Тогда в клетку организма, которая страдает от этой потери функции, нужно доставить ген, способный обеспечивать недостающую функцию. Это приходится делать, например, при рецессивных наследственных заболеваниях.

Наоборот, часто болезнь вызывается избыточной функцией, несвойственной нормальной клетке. Это происходит при инфекциях или опухолевых трансформациях. Тогда генному терапевту следует озаботиться тем, чтобы эту излишнюю функцию подавить. Эти две стратегии можно считать истинно-генно-терапевтическими. Они нацелены на коррекцию дефекта клетки генными модификациями этой же клетки.

К генно-терапевтическим подходам теперь относят также и такие подходы, когда клетки модифицируют, чтобы усилить иммунный ответ организма на нежелательные явления, вызванные инфекцией или возникновением опухолей. Модификация также осуществляется введением новой генетической информации либо в клетки, против которых хотят увеличить иммунный ответ, либо в клетки иммунной системы, с помощью которых хотят усилить этот эффект. Хотя строго говоря эта стратегия не совсем вписывается в классическое понятие генной терапии.

1.3 Генная терапия: спектр возможных для лечения болезней

В настоящее время более 4500 болезней классифицируется как генетические заболевания. Только небольшая часть из них сортирована и для еще меньшей установлен биохимический механизм, с помощью которого ген осуществляет свою функцию.

Рецессивные генетические болезни, такие как муковисцидоз и недостаточность аденозиндезаминазы, проявляются в том случае, если повреждены оба аллеля гена.

В доминантных аутосомных болезнях, такой является болезнь Хантингтона, эффект больного гена проявляется, даже если другой аллель здоров.

Наконец, заболевания, сцепленные с Х-хромосомой, проявляются у мужчин, тогда как дамы, как правило, как в случае синдрома хрупкости Х-хромосомы, болеют не всегда, и носят в себе ген, передавая его потомкам и награждая своих сыновей болезнью.

Генная терапия может применяться и для монофакторных, т.е. вызванных одним геном, и для полифакторных, т.е. происходящих вследствие вовлеченности многих генов, заболеваний. Большинство монофакторных генетических заболеваний встречаются относительно редко.

Большинство наиболее обычных болезней современного общества, такие как рак, атеросклероз, нейропсихиатрические болезни имеют существенный генетический компонент и также могут рассматриваться, как объекты классической генной терапии. Но, конечно, в последнем случае дело обстоит много более трудно и нужно разбираться в генетике болезни, что непросто.

2. Генная терапия: два пути введения генетической информации больному

Существует два принципиальных способа введения генетической информации в больной организм.

В первом из них берут клетки из организма, вводят в них требуемую генетическую информацию и затем возвращают в тот же организм. Это свои клетки, иммунная система их не отторгает, так, по крайней мере, можно надеяться, и они далее синтезируют нехватающий организму продукт. Не все клетки годятся для этого способа. Годятся, только те, которые могут существовать долго, лучше всего на протяжении всей жизни организма.

Это стволовые клетки. Определим этот способ, как ex vivo генную терапию. Экс значит вне. Вне организменная генная терапия. Эта терапия представляет собой развитие методов лечения, основанных на трансплантации органов и тканей.

Другой подход - доставка генов прямо в организм, ничего из него не вынимая. Это называется in vivo генная терапия. Прямо, значит, в организме. Выбор стратегии определяется той медицинской задачей, которую решает генная терапия в каждом конкретном случае.

Наконец, чтобы закончить с определениями, надо сказать о следующем. Принципиально наследственные болезни можно было бы лечить раз и навсегда, вводя здоровые гены взародышевую линию клеток, так чтобы они передавались по наследству. Мы это делали в случае трансгенных животных. Это была бы генная терапия зародышевых клеток. Но человек не мышь и не корова, и здесь возникает столько проблем, и технических и главным образом этических, что такой подход сегодня просто не рассматривается. Речь всегда идет о введении генетической информации в соматические клетки. Мы имеем дело с соматической генной терапией.

2.1 Генная терапия: вставка здорового гена в дефектные клетки

Понятно, что логически подходы генной терапии должны заключаться во введении в клетку здорового гена и создания условий для его экспрессии в надежде, что его продукт будет компенсировать генетический дефект. Идеальным случаем было бы убрать больной ген или его больную часть и заменить его, или эту часть, здоровым. Это можно было бы сделать с помощью таргетинга. Возможно, мы уже близки к осуществлению такого способа. Это называется генетической коррекцией (correction). Но пока осуществляется не нацеленное введение генов. Больной ген продолжает существовать, но вводят дополнительный здоровый ген, который увеличивает количество недостающего клетке или организму продукта. Этот способ будем называть пополняющей (augmentative) генной терапией.

При таком случайном введении будут происходить точно такие же события, как при трансгенозе. В ряде случаев будет происходить инсерционный мутагенез и экспрессия трансгена будет с высокой вероятностью не очень подходяще регулироваться. Такой трансген иногда называют эктопическим (ectopic).

Таким образом можно вылечить болезни рецессивного типа. Доминантный же тип проявляется и в присутствии здорового гена, и в этом случае нужно поразмыслить, как быть. Можно пробовать, например, не вводить здоровый ген, а наоборот инактивировать больной.

2.2 Генная терапия: усиление иммунного ответа

Во многих случаях можно подумать о том, что нежелательный эффект возникает, потому что иммунная система недостаточно активно узнает "не свои" антигены. Допустим, опухолевые клетки имеют характерные опухолевые антигены. Но этого оказывается недостаточно, чтобы клетки иммунной системы стимулировались и эффективно уничтожали опасные раковые новообразования. Можно попробовать усилить иммунную реакцию, создавая "противоопухолевые вакцины", представляющие собой опухолевые клетки с дополнительной генетической информацией, программирующей синтез поверхностных антигенов, которые, будучи выставлены на поверхность опухолевой клетки, усилят ее идентификацию, как чуждую и вызовут полноценный иммунный ответ. Или каким- то образом можно модифицировать геном клеток иммунной системы, чтобы заставить их более энергично уничтожать опасные клетки.

2.3 Генная терапия: практические проблемы

Какую бы стратегию вы не использовали, для целей генной терапии надо решить несколько практических задач.

-Как доставить требуемый ген в организм?

-Как обеспечить его экспрессию в нужных тканях?

-Как обеспечить его нужную регуляцию?

-Как добиться его пожизненного существования и экспрессии?

Нужно сказать, что принципиально все эти проблемы решаются очень похоже на то, как это делалось в случае трансгенных животных. Однако в генной терапии очень существенное значение придается безопасности операций и поэтому важнейшую роль играют средства доставки трансгенов в клетку.

3. Генная терапия: средства доставки трансгенов в клетку

Вирусные вектора

Ретровирусные векторы

Ретровирусные векторы в генной терапии

Аденовирусные векторы

Аденоассоциированные векторы

Герпесвирусные вектора

Генная терапия: Вирусные векторы и клетки-мишени: резюме

Ретровирусные векторы используются в работах с трансгенными животными. Для генной терапии используют очень похожие векторы. Количество генетической информации, которое может быть перенесено с помощью этих векторов не очень велико - до 9000 пар оснований. Это либо небольшой эукариотический ген, либо кДНК.

Было показано, что в ряде систем, основанных на использовании стволовых клеток, например в клетках костного мозга, фибробластах, гепатоцитах, кератиноцитах и других, ретровирусы позволяют трансгенам экспрессироваться достаточно долго. Некоторые нюансы связанны с проблемами их использования для целей лечения человека.

Хоть человек и животное, но при этом он все таки человек! Понятно, что введение требуемого гена со своими собственными регуляторными элементами осмысленно только, если удается осуществить экспрессию трансгена в нужной ткани. Использование ретровирусных векторов для пополняющей терапии ограничивается болезнями, где поврежденный ген в нормальном организме регулируется не очень сложно.

Существует несколько трудностей и опасностей для пациентов в использовании ретровирусных векторов для целей генной терапии.

Во-первых, количество псевдовирусных частиц, получаемых из пакующей клеточной линии мало, примерно #106 в миллилитре среды, в которой растут клетки. Этого более или менее достаточно для целей ex vivo генной терапии. Но этого очень мало, когда нужно применить стратегию in vivo. Этот недостаток пытаются ликвидировать, но пока еще рано говорить об стабильном успехе в этом направлении.

Во-вторых, проникновение ретровирусной частицы в клетку абсолютно зависит от наличия на поверхности этой клетки специфического для данного ретровируса рецептора. Поэтому не все клетки так просто инфицируются.

Например пакующая линия клеток, которая была получена первой, так называемая пси2 # пакующая линия, содержит интегрированный в геном клетки геном вируса лейкемии мышей Молони (Moloney murine leukemia virus). Это был экотропый вирус, т.е. он инфицирует только мышиные клетки. Почему это так?

А потому что его ENV белок узнает только мышиные рецепторы. Поэтому была изобретена пакующая линия клеток (#am, в которой последовательности, кодирующие родной экотропный белок оболочки вируса Молони, были замещены геном оболочки из другого, амфотропного, вируса Молони. Т.е. вируса, который способен поражать более широкий спектр хозяев. В результате получаемые псевдовирусные частицы приобрели способность проникать в человеческие клетки.

В дальнейшем такие амфотропные пакующие линии были усовешенствованы, чтобы увеличить выход вирусных частиц и уменьшить вероятность рекомбинации дефектного ретровируса с клеточными эндогенными ретровирусами.

В-третьих, также как в трансгенных животных, уровень экспрессии интегрированного в геном хозяйской клетки случайным (более точно, квазислучайным) образом ретровирусного трансгена зависит от эффекта положения. В клеточной популяции трансфецированной ретровирусным вектором разные клетки очень сильно отличаются друг от друга по уровню экспрессии трансгена, поскольку он оказывается в них в разных положениях. Было бы хорошо осуществлять таргетинг векторов к определенному положению в геноме. Работа в этом направлении проводится. Хотя, часто экспрессия достигается достаточно продолжительная нередки и случаи, когда после непродолжительного периода, экспрессия резко снижается или даже полностью подавляется. Иногда это связано, например, с метилированием ДНК. В некоторых случаях провирусные последовательности теряются из генома или перегруппировываются. Иммунная система хозяина может начать отлавливать клетки, которые экспрессируют трансген. Ведь мы не провели его через эмбрион, а ввели в соматические клетки, и иммунная система вполне может решить, что эпитопы, выставленные на поверхности клеток, экспрессирующих трансген - чужие. Существует и такая опасность: интеграция ретровируса в некоторые клетки может инактивировать ген-супрессор опухолеобразования. Это, конечно, очень редкое, но вполне возможное событие. Но, возможно, опасность его не нужно переоценивать, учитывая что для возникновения реальной опухолевой клетки требуется нескольеко мутационных событий.

Наконец, может быть главная неприятность заключается в том, что возможна рекомбинация между дефектным ретровирусом, который сам по себе не опасен, и каким либо из эндогенных ретровирусных элементов в паковочной линии клеток. Геном млекопитающих буквально начинен такими остатками былых инфекций наших предков окружающими их ретровирусами. В результате рекомбинации может возникнуть компетентный инфекционный ретровирус. Поэтому стараются получить такие пакующие клеточные линии, продуцирующие ретровирусный вектор, в которых рекомбинации были бы сведены к минимуму.

Хотя опасность всех этих событий низка, исследователи должны с ней считаться, ведь они конструируют эти системы для лечения людей. Заканчивая рассказ о ретровирусных векторах для генной терапии, напомню еще один их недостаток, о котором мы говорили в лекции по трансгенозу. Ретровирусы интегрируют в делящиеся клетки. Это также ограничивает спектр их применения.

Аденовирусные векторы эффективно переносят гены как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки, не встраиваются в геном, обеспечивают высокие титры рекомбинантного вируса и высокий уровень экспрессии вводимых генов. Однако используемые в настоящее время аденовирусные векторы вызывают неспецифическое воспаление и антивирусную реакцию клеточного иммунитета, что сокращает длительность экспрессии до недель или месяцев.

Недостатки ретровирусных векторов, побуждают искать другие векторные системы. Наибольшие надежды возлагают на аденовирусы и герпесвирусы. Геномы у этих вирусов представлены двухцепочечными ДНК и достаточно велики: 36 кб у адено- и 150 кб у герпесвирусов. Обычно они не интегрируют в геном клетки хозяина (хотя для герпесвирусов и сообщалось об интеграции отдельных частей вирусной ДНК).

Многие обычные серотипы аденовирусов являются патогенами человека, инфицирующими верхние дыхательные пути. Интактные аденовирусы использовались для целей вакцинации и в результате накопилась большая информация касательно безопасности этой системы для человека. Аденовирусы могут получаться с очень высокими титрами, до 10¹² инфекционных частиц в миллилитре культуральной среды. Для целей генной терапии на сегодняшний день в качестве векторов использовали два аденовирусных серотипа, 2 и 5. Аденовирусы проникают в клетку, взаимодействуя с двумя рецепторами. Они хорошо приспособлены для целей терапии in vivo, поскольку дают высокие титры вирусных частиц. Аденовирусы способны реплицироваться и в делящихся и в неделящихся клетках. Они не интегрируют в геном клеток-хозяев и остаются эпихромосомными. Это уменьшает опасность инсерционного мутагенеза, о которой мы говорили в случае ретровирусов. Инфекция пермиссивных клеток аденовирусом приводит к их лизису. Схематически аденовирусный геном представлен на Рис. 3. Аденовирусный геном может быть превращен в дефектный по репликации путем делеции Е1 области. (Здесь следует оговориться, что требование Е1 гена для репликации не является абсолютным. При высокой множественности инфекции некоторая репликация все же наблюдается и у дефектных по Е1 области аденовирусов. Однако эта способность очень сильно подавлена). Вместо Е1 области может быть вставлен трансген примерно того же размера, что и в случае ретровирусных векторов, т.е. до 10 кб. Для того чтобы обеспечить рост таких репликационно дефектных рекомбинантных вирусов, созданы специальные рекомбинантные клетки, содержащие экспрессирующиеся гены Е1. Это очень похоже на ту хитрость, которую использовали в случае ретровирусов. Эти клетки комплементируют дефект аденовирусного вектора и позволяют ему размножаться и образовывать вирусные частицы, которые не могут реплицироваться в некомплементирующих клетках. На рис. 3 показаны места, в которые может быть встроен трансген. Это области Е1а,Е1b, и Е3. Аденовирусные векторы были использованы недавно для эффективной доставки генов в эпителиальные клетки верхних дыхательных путей in vivo. Этот эпителий является природным местом инфекции для большинства аденовирусов, поэтому в данном случае аденовирусы имеют преимущество перед ретровирусами, поскольку последние, хотя и могут реплицироваться в эпителии, не могут быть получены в достаточно высокой концентрации для целей терапии in vivo. Однако, эпихромосомная локализация имеет и недостатки - продолжительность экспрессии трансгена невелика - недели, в лучшем случае месяцы. А хотелось бы побольше, хотелось бы на всю жизнь, ведь мы чаще всего имеем дело с наследственными, т.е. пожизненными болезнями. В результате аденовирусные векторы придется вводить пациентам не один раз и навсегда, а регулярно. Выдержит ли организм такое насилие?

Аденоассоциированный вирус (ААV) представляет собой маленький вирус, содержащий одноцепочечную ДНК. При инфекции клеток он интегрирует свою ДНК в геном хозяйской клетки со значительной специфичностью к определенному участку хромосомы 19 человека. Плохо только, что именно эта область хромосомы вовлечена в хромосомные перегруппировки, связанные с возникновением хронической В-клеточной лейкемии. Поэтому может быть лучше бы ему интегрироваться неспецифично? Но мы с вами пока не знаем связаны ли с этой специфической интеграцией какая либо опасность. Поэтому будем ждать информации. Вообще же AAV выглядит очень привлекательным вектором, и он способен также инфицировать неделящиеся клетки.

ГЕРПЕС ВИРУС (HSV): клетки-мишени: Неделящиеся клетки, Дифференцированные нейроны, Дифференцированные гепатоциты

ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

· Доступны мутанты дефектные по репликации,

· Доступны пакующие системы,

· Высокие титры,

· Широкий спектр клеток-хозяев,

· Высокая эффективность инфекции,

· Инфицирует клетки, неинфицируемые ретровирусами,

· Биология хорошо изучена,

· Высокая емкость - до 30кб.

ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

· Упаковка происходит с низкой эффективностью,

· Репликационно-дефектные мутанты цитотоксичны,

· С вирусным геномом трудно создавать векторные конструкции,

· Сложная регуляция.

Генная терапия: Вирусные векторы и клетки-мишени: резюме

РЕТРОВИРУС: клетки-мишени: Фибробласты, Эндотелиальные клетки, Миобласты, Гладкомышечные клетки, Гепатоциты, Гематопоэтические клетки, Стволовые клетки

ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

· Непатогенен,

· Интегрирует в геном,

· Относительно простое манипулирование,

· Биология хорошо изучена

ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

· Относительно низкие вирусные титры,

· Ограниченная емкость для внедрения трансгена ((10 кб),

· Не инфицирует неделящиеся клетки,

· Экспрессия трансгена м.б. непродолжительной

· Не очень хорош для in vivo терапии

АДЕНОВИРУС: клетки-мишени: Гепатоциты, Эпителий верхних дыхательных путей, Лимфоидные, гематопоэтические и миелоидные клетки

ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

· Доступны непатогенные дефектные мутанты,

· Человек - природный хозяин,

· Высокие титры,

· Высокая эффективность при in vivo инфекции,

· Инфицирует как делящиеся так и неделящиеся клетки, неинфицируемые ретровирусами,

· Биология хорошо изучена,

· Существуют паковочные клеточные линии

ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

· Не интегрирует в геном,

· Конструкция вектора более сложна, чем у ретровирусов,

· Может рекомбинировать с природными аденовирусами.

· .......

АДЕНО-АССОЦИИРОВАННЫЙ ВИРУС: клетки-мишени: Гематопоэтические клетки, Фибробласты, Эпителиальные клетки

ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

· Непатогенен,

· нецитотоксичен,

· Человек - природный хозяин,

· Предпочтительный сайт интеграции на хромосоме 19,

· Способен устанавливать латентное состояние,

· Относительно простое конструирование вектора.

ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

· Относительно низкие титры,

· Малая емкость (4кб),

· Инфекционность относительно низка,

· Требует аденовирус в качестве помощника для инфекции,

· Биология не очень хорошо изучена.

......

ГЕРПЕС ВИРУС (HSV): клетки-мишени: Неделящиеся клетки, Дифференцированные нейроны, Дифференцированные гепатоциты

ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

· Доступны мутанты дефектные по репликации,

· Доступны пакующие системы,

· Высокие титры,

· Широкий спектр клеток-хозяев,

· Высокая эффективность инфекции,

· Инфицирует клетки, неинфицируемые ретровирусами,

· Биология хорошо изучена,

· Высокая емкость - до 30кб.

ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ СВОЙСТВА:

· Упаковка происходит с низкой эффективностью,

· Репликационно-дефектные мутанты цитотоксичны,

· С вирусным геномом трудно создавать векторные конструкции,

· Сложная регуляция.

Невирусные подходы к доставке генов развивают многие лаборатории. Привлекает в них несколько вещей. Во-первых - это не вирусы, и, значит, опасности, о которых мы говорилось в разделе о вирусных векторах, пациентам не грозят. Это простые системы и в них можно помещать сколь угодно большие ДНК. Естественно, тут же возникают проблемы доставки. Куда-то надо ее, эту невирусную систему, вводить пациенту, и при этом, чтобы она попала в то место, в те клетки, где она нужна. Допустим, как она будет вести себя в крови? Что с ней будет вытворять иммунная система? ДНК должна быть упакована в таком виде, чтобы она связывалась с клетками мишенями и желательно не связывалась с другими клетками.

Успешная доставка длинной нестабильной полианионной молекулы ДНК в клетку-мишень через три липидных бислоя, т.е. клеточную мембрану и двойную ядерную мембрану требует специальных ухищрений.

Во-первых, надо создать условия, при которых ДНК не подвергалась бы деградации, механической и энзиматической.

Во-вторых, сделать так, чтобы эта ДНК выживала перед тем, как она доберется до клеточного ядра, Это значит, что когда ДНК попадает в клетку, она должна избежать эндосом и лизосом и найти путь к ядру.

И конечно, нужно обеспечить долговременную экспрессию генов, содержащихся в ДНК. В основном для этих целей используют две главные стратегии.

В первой из них образуют катионные липидсвязанные комплексы с ДНК в составе липосом. Эти комплексы положительно заряжены. Они связываются с клетками мишенями. Они содержат липиды со свойствами сплавляться с клеточными мембранами и облегчать проникновение ДНК в клетки. В частицах не содержится информации, направляющей их прямиком в ядро. Поэтому большая часть генного материала, проникшего в клетку оказывается связанной с цитоплазматическими органеллами и уничтожается. Только небольшая часть избегает этой участи.

Во второй стратегии используют имитацию вирусов. В этом случае ДНК вводят в комплекс с поликатионом (например, полилизином), лигандом для связывания с клеткой и эндоцитоза (таким лигандом может быть, например, трансферрин или антитело, специфичное к какому-либо поверхностному белку клетки) и специальным агентом, облегчающим высвобождение ДНК из этого комплекса и эндосом в цитоплазме. Такие агенты называют эндосомолитическим. Ими могут служить репликационно-дефектные аденовирусные частицы, влючаемые в комплекс. Для увеличения безопасности таких систем пытаются использовать аденовирусы животных, не способные реплицироваься в человеческих клетках. Лиганд, введенный в комплекс, определяет клеточную специфичность доставки ДНК.

При явных достоинствах, системы невирусной доставки имеют и серьезные недостатки. Они малоэффективны. Требуется очень высокая концентрация частиц, чтобы перенос гена осуществился. Пока неясно, как обстоит дело с проблемами безопасности при их использовании. Пока эти системы испытывались на людях только в стратегии in vivo. Многие склонны считать, что идеальным для целей генной терапии соматических клеток был бы вектор, имитирующий хромосому человека. Такие векторы могли бы быть созданы по образу и подобию природных хромосом, также как созданы дрожжевые искусственные хромосомы - YAC. Для этого они должны содержать три функциональных элемента: Участок, обеспечивающий репликацию (origin of replication) Последовавтельность, обеспечивающую митотическую стабильность - центромеру. Последовательность, обеспечивающую правильную репликацию и устойчивость к нуклеазам - теломеры. Полагают, что такие искусственные хромосомы для клеток млекопитающих появятся в ближайшее время [ Обозрение 1995 ].

3.1 Генная терапия: применение антисенс-олигонуклеотидов

Антисенс-олигонуклеотиды еще один подход к генной терапии [Agrawal ea 1996].

В 1978 году было показано, что 13 звенный олигонуклеотид, комплементарный мРНК вируса саркомы Рауса, может ингибировать репликацию вируса. Это было начало нового подхода, направленного на модификацию экспрессии гена.

Олигонуклеотид, комплементарный к определенной мРНК проникает в клетку и связывается с этой мРНК. Только с нею, и ни с какой другой. В результате трансляция этой мРНК ингибируется специфически. Это может быть вирусная мРНК, и тогда репликация вируса будет ингибирована. Это может быть мРНК онкогена, экспрессия которого приводит к опухоли и т.д. Идеологически подход похож на стратегию, используемую, когда экспрессию гена подавляют с помощью антисенс РНК. Но есть и существенная разница. Антисенс РНК в генно-терапевтическом смысле постоянно экспрессируется клеткой, в которую для этого вводится специальная генетическая конструкция. Ген этой антисмысловой РНК после введения в клетку становится частью ее генома и поэтому подавляет синтез смысловой РНК изнутри. Антисмысловой же олигонуклеотид приходит в клетку из вне. Его постоянно нужно добавлять, чтобы сделать его действие эффективным. Однако, поскольку действие олигонулеотида также направлено на продукт экспрессии гена внутри клетки, этот подход можно рассматривать, как генно- терапевтический.

В принципе подход очень прост и привлекателен. Он не требует сложных конструкций для своего осуществления. Можно надеяться на высокую специфичность благодаря тому, что можно синтезировать олигонуклеотиды с последовательностями, встречающимися всего один раз во всем геноме и, следовательно, абсолютно специфически взаимодействующие с мРНК заданного гена.

Однако подход сталкивается со многими проблемами. Так часто бывает: казалось бы, вот он, простой и симпатичный метод, а начинаешь его разрабатывать и видишь: и тут не так, как думалось, и там не этак. Оказалось, что олигонуклеотиды природной структуры недостаточно стабильны, когда вводятся в организм, возникают проблемы с проницаемостью клеток для олигонуклеотидов, возникают проблемы со специфичностью связывания с нужной мишенью, поскольку олигонулеотиды могут свзываться не только со строго комплементарными последовательностями, но и с частично комплементарными и т.д.

Тем не менее, и это тоже часто бывает, находятся пути обхода этих сложностей. В частности, модифицированные олигонуклеотиды, содержащие серу в сахаро-фосфатном остове вместо кислорода, так называемыке фосфотиоаты, оказываются устойчивыми к разрушительному действию ферментов в организме. В настоящее время они проходят клинические испытания, как средства лечения различных заболеваний. В результате надеются получить информацию относительно безопасности и эффекиивности модифицированных олигонуклеотидов, которая, возможно, позволит создать более совершенные конструкции.

3.2 Генная терапия: наследственные болезни

Многие болезни крови связаны с унаследованными мутациями. Так, замена одного нуклеотида ведет к появлению гемоглобина S и развитию серповидноклеточной анемии. Точечные мутации лежат также в основе наследственных иммунодефицитов, например тяжелого комбинированного иммунодефицита вследствие недостаточности аденозиндезаминазы.

Введение в стволовые клетки крови генов, восстанавливающих нормальную функцию клеток, должно оказывать лечебное действие - например, введение гена аденозиндезаминазы может обеспечить нормальное развитие Т- и В-лимфоцитов. Широкому применению этого метода сегодня мешает несколько сложностей, одна из которых - слабая и непродолжительная экспрессия введенных генов в клетках крови.

То, что мы рассказывали во введении про девочку, представляет собой пример лечения одной из наследственных болезней метаболизма - недостаточности аденозиндезаминазы. Примеры наследственных болезней метаболизма многочисленны. О некоторых вы наверняка много раз слышали: фенилкетонурия, галактозэмия, семейная гиперхолестеролэмия, уже упоминавшийся синдром Леша-Нихана. Они связаны с дефицитом того или другого фермента, возникающим вследствие повреждения соответствующего гена. Как правило, эти болезни встречаются не часто, но следствия их крайне неприятны. Они в большинстве своем рецессивны.

Пример с аденозиндезаминазой показывает, как недостаток всего одного фермента приводит к острой иммунной недостаточности вследствие того, что в процессе метаболизма пуринов накапливаются токсичные промежуточные продукты, аденозин и 2'-дезоксиаденозин, которые селективно уничтожают Т-клетки. Генно-терапевтическая стратегия в этих случаях облегчается тем, что обычно для нормального существования организма не обязателен 100% нормальный уровень фермента, отсутствующего у больного. Уровень фермента 5- 25% от нормы часто вполне достаточен для совершенно здорового существования.

Например, гемофилия В, происходящая от резкой недостаточности сериновой протеазы, фактора свертывания крови IX, протекает в очень острой форме, если больные имеют менее 1% этого фермента от нормы. Но те, которые имеют от 1 до 10%, чувствуют себя вполне удовлетворительно. Поэтому можно достаточно просто осуществить пополняющую генную терапию. Особенно учитывая рецессивность большинства дефектов метаболизма.

Генотерапия фетальная

Большинство методов фетальной генотерапии разработаны на трансгенных мышах. Чужеродную ДНК вводят в оплодотворенные яйцеклетки, полученные от мышей, у которых была искусственно стимулирована овуляция. Затем яйцеклетки имплантируют в матку приемной матери. С помощью этого метода удалось заметно улучшить состояние мышей с наследственным дефицитом СТГ, наследственным дефицитом основного белка миелина и наследственным дефицитом бета-цепи глобина. В подобных экспериментах получена важная информация о регуляции экспрессии генов и патогенезе наследственных болезней.

Однако трансгенные животные получаются только из 15-20% яйцеклеток с инъецированной ДНК, причем лишь у 20-30% животных введенный ген экспрессируется. Более того, из-за случайного встраивания чужеродной ДНК в геном есть опасность повреждения гена хозяина (инсерционный мутагенез), приводящего к дефициту белка или нарушению регуляции, что может стать причиной злокачественного новообразования.

Таким образом, фетальная генотерапия пока неприменима для лечения наследственных болезней человека. Однако методы, разработанные в экспериментах с эмбриональными клетками, можно использовать для пренатальной диагностики. Это дает очень много - разумеется, лучше выявить наследственное заболевание на ранней стадии внутриутробного развития, чем прибегать к такому рискованному и ненадежному пока методу, как введение чужеродной ДНК.

Генотерапия соматическая

Если фетальная генотерапия пока неприменима для лечения наследственных болезней человека, то соматическая генотерапия наследственных болезней проходит клинические испытания.

Есть разные методы введения чужеродной ДНК в клетки-мишени, и выбор метода частично зависит от заболевания. Доставку генетического материала производят с помощью вирусных векторов (ретровирусы, не способные к самостоятельной репликации; аденовирусы; аденоассоциированные вирусы; герпесвирусы и др.) или невирусных систем (липосомы, конъюгаты ДНК-белок и ДНК-белок-дефектный вирус). Существуют два подхода: ex vivo - сначала генетический материал вводят в клетки, выращиваемые в культуре, а затем трансгенные клетки вводят реципиенту, и in vivo - вектор, несущий нужный ген, вводят непосредственно в организм реципиента ( рис. 67.2 ).

Первый подход особенно эффективен, если для доставки используют стволовые кроветворные клетки и другие клетки, которые удается вырастить в культуре в больших количествах; второй же устраняет проблему введения значительного числа клеток в орган-мишень.

В любом случае важно учитывать количественные стороны - какой уровень экспрессии необходим для улучшения состояния больного и достаточны ли уровень экспрессии в трансгенных клетках и их число.

При испытаниях соматической генотерапии чаще всего используют вирусные векторы. Каждый из них имеет свои преимущества и недостатки.

Использование ретровирусных векторов, не способных к самостоятельной репликации, обеспечивает эффективное встраивание чужеродной ДНК в геном и постоянство генетических изменений. Однако эти векторы встраиваются только в делящиеся клетки, могут вызывать инсерционные мутации, дают сравнительно низкие титры рекомбинантного вируса, а экспрессия встроенного гена часто уменьшается до очень низкого уровня через несколько месяцев.

Аденовирусные векторы эффективно переносят гены как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки, не встраиваются в геном, обеспечивают высокие титры рекомбинантного вируса и высокий уровень экспрессии вводимых генов. Однако используемые в настоящее время аденовирусные векторы вызывают неспецифическое воспаление и антивирусную реакцию клеточного иммунитета, что сокращает длительность экспрессии до недель или месяцев.

Таким образом, используемые сейчас вирусные векторы имеют существенные недостатки. Чтобы соматическая генотерапия стала эффективной, нужно значительно усовершенствовать вирусные векторы, как и другие системы доставки генов.

Число заболеваний, при которых можно использовать соматическую генотерапию, растет. Опыт, накопленный при использовании обычных методов лечения, следует учитывать и при разработке методов генотерапии. Важно учитывать патогенез заболевания, начинать лечение до развития необратимых повреждений, обеспечивать правильное и регулируемое взаимодействие нового белка (продукта вводимого гена) с другими элементами пораженной системы гомеостаза.

Клинические испытания методов соматической генотерапии проводят не только при моногенных заболеваниях, но и при злокачественных новообразованиях, ВИЧ-инфекции и других заболеваниях.

Разрабатываемые методы лечения злокачественных новообразований включают:

- изменение опухолевых или здоровых клеток больного, с тем чтобы посредством стимуляции синтеза цитокинов или других молекул изменить реакцию организма на злокачественное новообразование;

- экспрессию антигенов (например, аллогенных антигенов HLA) на опухолевых клетках с целью вызвать на них иммунный ответ;

- введение генов-супрессоров опухолевого роста или других генов, замедляющих пролиферацию клеток;

- введение в здоровые клетки (например, клетки костного мозга) генов, обеспечивающих устойчивость к противоопухолевым средствам, для проведения более активной химиотерапии.

Ближайшие перспективы соматической генотерапии пока не ясны. Это многообещающий метод, но для того, чтобы он стал по-настоящему эффективным, нужна еще большая работа.

Заключение

Генная терапия - это здорово, но!

Помните, что конечно генная терапия это очень здорово. Но она еще далека от широкого практического использования. Пока основные успехи достигнуты на моделях.

Но человек это не просто большая мышь, как написал автор обзора [ Crystal ea 1995 ]. Накапливается много примеров разных откликов человека и экспериментальных животных на одну и ту же обработку. Отклонения могут быть, как в сторону, благоприятную для человека, так и наоборот. Например, когда аденовирусные векторы вводят экспериментальным животным, у них в крови быстро появляются антивирусные антитела. А у человека они не появляются. По крайней мере в двух случаях, когда пациентам с муковисцидозом вводили в дыхательные пути (airways) этот вектор. Это хорошо. Но вот у одного из пациентов с муковисцидозом, которому аденовирусный вектор с кДНК CFTR вводили в легкие, возник воспалительный процесс (inflammatory syndrom), хотя у мышей не наблюдалось никакой токсичности этого репликационно-дефектного вектора при 1000 кратно больших дозах. Или вот такой комментарий по поводу успехов в лечении опухолей [Jain ea 1996]: Примерно четверть всех смертных случаев в США вызвано раковыми опухолями. Более 85% из них являются твердыми опухолями. Причина смерти обычно метастазы, хотя и первичная опухоль тоже может быть фатальной. В последнее время появились новые подходы к лечению, включающие моноклональные антитела, цитокины, антисенс олигонуклеотиды, ген-направленные векторы и генетически реконструированные клетки. Эти подходы были объявлены, как магическая пуля и были с энтузиазмом восприняты политиками, инвесторами и публикой. Однако клиничкеские испытания на сегодгняшний день не дали ожидаемых высоких результатов. Главной проблемой является преодоление барьеров для проникновения терапевтического агента в опухоль с минимальной токсичностью для здоровых клеток. Модели дают очень обещающие результаты, однако даже с лучшими животными моделями остается проблема перехода к человеку, который отличается и биохимически и физиологически от модели. Так что имейте это ввиду.

Неудача генной терапии.

17 сентября 2000 г. в Университете Пенсильвании умер 17-летний Джесси Гелзингер (Jesse Gelsinger), которого пытались вылечить путем генной терапии от наследственного заболевания печени недостаточность орнитинтранскарбомилазы (OTCD). Он умер вследствие гиперреакции имунной системы на ввод в печень генноинженерного аденовируса. Смерть наступила вследствие острого респираторного синдрома и выхода из строя множества органов. Гелзингер был здоровее большинства людей, страдающих OTCD, которая вызывает повышение концентрации аммиака в крови. Течение его болезни можно было частично контролировать диетой с низким содержанием белков и препаратами помогающими выводить аммиак. Смерть Джесси стала тревожным сигналом для многих медицинских центров, начинающих генную терапию, т.к. в 30% случаях для доставки генов используются аденовирусные вектора.

FDA немедленно запретила 2 следующих эксперимента, включающих инъекцию аденовирусов в печень. Оказалось, что еще до смерти Гелзингер от инъекций аденовирусов умирали обезьяны, но RAC (Recombinant Advisory Committee) не был извещен. Кроме того, оказалось, что у добровольцев по лечению OTCD еще до смерти Гелзингер, получавших более низкие дозы вирусу, наблюдалась сильная интоксикация печени. Если бы это было сообщено в FDA эксперименты были бы заморожены. Кроме того оказалось, что Гельзингер вообще не должен был быть включен в список для эксперимента, т. к. по протоколу для эксперимента приглашались женщины, как менее подверженные действию OTCD. Но тем не менее непонятно почему умер Гелзингер. Он мог иметь не выявленное инфекционное заболевание паповавирусом, которое повысило его чувствительность к аденовирусу. Возможно у введенного аденовируса имелись мутации, которые дали такой эффект. Из 17 пациентов до Гелзингера только у трех после генноинженерной процедуры наступило улучшение. Таким образом этот случай заставляет пересмотреть вообще все подходы с вирусной доставкой трансгена.

Размещено на Allbest.ru

...