Экспрессия циклин-зависимой киназы р27 в низкодифференцированной аденокарциноме желудка

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЭКСПРЕССИЯ ЦИКЛИН-ЗАВИСИМОЙ КИНАЗЫ р27 В НИЗКОДИФФЕРЕНЦИРОВАННОЙ АДЕНОКАРЦИНОМЕ ЖЕЛУДКА

Кравцов В.Г., Шахмуров М.Г.,

Сукманов О.В., Зайратьянц О.В.,

Ширин Н.И.

Клеточный цикл деления клетки, как известно, включает в себя серию последовательных фаз:

- G1 - подготовки клетки к синтезу ДНК;

- S - синтез ДНК;

- G2 - подготовки клетки к делению;

- М - деления клетки.

Смена фаз регулируется группой циклин-зависимых киназ (cyclin dependent kinases - CDK). CDK, в свою очередь, зависимы от белков-циклинов (cyclins), которые связываются с CDK и образуют комплекс cyclin-CDK, активирующий процессы удвоения ДНК и деления клетки. В нормальных условиях деление клетки останавливает другая группа белков - циклинов-ингибиторов (cyclin dependent kinase inhibitors - CDI). В клеточном цикле выделяют ответственные моменты (checkpoints) перехода клетки от одной фазы к другой, также момент проверки веретена клетки (spindle checkpoint). Наиболее важным моментом считают checkpoint между G1 и S фазами, когда происходит удвоение ДНК. Именно в этот момент структура ДНК наиболее подвержена влиянию неблагоприятных воздействий. В различных опухолях в момент между G1 и S фазами найдены разнообразные отклонения от нормы. Соответственно этому многие химиотерапевтические препараты направлены именно на этот checkpoint клеточного цикла. В настоящее время выявлено, что CDI играют важнейшую роль в делении клетки, а также в онкогенезе. По строению и функции CDI разделяют на две основные группы. Первую группу называют Cip/Kip ингибиторы, в которую входят гены и соответствующие белки р21 и р27, экспрессия которых исследована в настоящей работе, и р57. Вторую группу называют Ink4, и включают в нее гены и белки р18, р15, р16 и р19. Cip/Kip связываются и сопровождают работу следующих киназ и комплексов циклинов и киназ:

1) циклин D-CDK 4/6 и циклин Е-CDK2, работающие в фазе G1 клеточного цикла;

2) циклин А-CDK2, работающий в фазе S клеточного цикла;

3) комплекс циклин В-CDK1, работающий в фазе М клеточного цикла.

Исходя из вышесказанного, CDI должны играть функцию опухолевых супрессорных генов (Tumor suppressor genes) и, соответственно, снижение или отсутствие их активности играет ключевую роль в онкогенезе. Эта гипотеза основана на исследованиях, проведенных на мышах со специфической мутацией CDI, и на иммуноморфологическом изучении различных злокачественных опухолей, в которых выявлено снижение экспрессии CDI. Например, снижение экспрессии р27 обнаружено в опухолях три- и гомозиготных мышей. Снижение или отсутствие р27 описаны как плохой прогностический фактор в различных опухолях, включая раки желудка.

Целью работы явилось изучение экспрессии циклин-зависимой киназы р27 в низкодифференцированной аденокарциноме желудка.

Исследованы 37 наблюдений (операционный материал и гастроскопические биологические этапы желудка, полученные в ходе гастроскопии) из архива института Патологии Медицинского Центра Е. Вольфсона, Холон, Израиль за 1999-2000 гг. Материал исследования включал в себя 21 случай низкодифференцированной аденокарциномы желудка:

- участками перстневидно-клеточной дифференцировки;

- 11 случаев хронического атрофического гастрита с пилорическим хеликобактером;

- 5 случаев неизмененной слизистой оболочки желудка.

У 21 пациента с аденокарциномой желудка средний возраст составил 67,7 лет (от 35 до 86 лет), из них 9 мужчин и 12 женщин. Все больные находились в стадии Т3 N1-2 M0, лечение включало предоперационную химиотерапию, частичную или тотальную резекцию желудка и последующее химиотерапевтическое и лучевое лечение. Пилорический хеликобактер был выявлен только у 3 из 21 (14,28%) пациентов, причем в слизистой оболочке желудка вне пределов опухоли. Продолжительность жизни больных после установления диагноза и проведенного комплексного лечения значительно колебалась: двое умерли на первом году, 5 - на втором, 3 - на третьем и 2 - на четвертом (в течение первых 5 лет умерли 12 из 21 пациентов - 57,14%). 9 пациентов до настоящего времени живы.

Гистологические препараты были исследованы двумя врачами-патологоанатомами для подтверждения диагноза, наличие или отсутствие пилорического хеликобактера в слизистой желудка, а также стадии заболевания. Для иммуноморфологического исследования дополнительные срезы толщиной 4 мкм были депарафинизированы в ксилене и дегидратированы в этаноле. Дополнительная обработка срезов производилась в EDTA Buffer pH-8 (Zymed Laboratories inc. San Francisco, USA) с помощью микроволновой печи в течение 15 минут. Окраска производилась моноклональными мышиными антителами к р27 в разведении 1:500 - Kip1/p27 antibody (Transduction laboratories Lexigton Ky, USA) по модифицированной стрептавидиной технике (Modified labeled streptavidin technique) в аппарате системы Вентана (Ventana autostainer NEXES, Ventana, Tuscon Arizona, USA) с использованием хромогена AEC (AEC Ventana). Дополнительная окраска производилась гематоксилином Маера. Как позитивный контроль использовали препараты щитовидной железы и рака молочной железы, для негативного контроля применяли препараты, не инкубированные с антителами. Иммуноморфологическая окраска клеточных ядер определялась в 10 полях зрения на большом увеличении (х400), минимум в 1000 клеток препарата.

Анализировали два параметра:

а) интенсивность окраски в позитивных клетках в баллах от 0 до 3;

б) процент позитивных клеток от 0 до 100%.

Затем подсчитывался индекс путём сложения умноженной интенсивности окраски клеточных ядер на процентное соотношение и деления на 100.

Положительная окраска цитоплазмы в дополнение к положительной окраске ядра оценивалась по тем же вышеперечисленным критериям. Полученные результаты обрабатывались статистически по методу Tukey HSD, ANOVA и Chi-square.

Сравнительная оценка экспрессии белка р27 была проведена для опухолевых клетках желудка в сравнение с эпителиальными (поверхностными и фавеолярными) клетками неизмененной слизистой оболочки желудка и при хроническомм атрофическом гастрите на фоне пилорического хеликобактера.

Результаты исследования показали резкое снижение экспрессии р27 в клетках изученных аденокарцином по сравнению с вышеуказанными группами сравнения, причем была выявлена достоверная статистическая корреляция (таблица). Однако статистически достоверной корреляции с прогнозом больных с аденокарциномами экспрессии р27 не обнаружено.

Таблица - Индекс экспрессии р27 в клетках аденокарциномы желудка, неизмененном эпителии желудка и при хроническом атрофическом гастрите:

Таким образом, в соответствии с существующими моделями канцерогенеза, полагают, что злокачественная трансформация клеток связана с нарушением регуляторных белков клеточного цикла.

Множество злокачественных опухолей, в частности, желудочно-кишечного тракта (пищевода, желудка и кишечника) отличаются сниженной экспрессией р27. клетка желудок иммуноморфологический

В настоящей работе выявлено снижение р27 в низкодифференцированной аденокарциноме желудка в стадии Т3 N1-2 M0, но не выявлено статистически достоверной корреляции с прогнозом больных.

Размещено на Allbest.ru