Размещено на http://www.allbest.ru/

Порівняльна характеристика методів одержання і промислових способів виробництва стрептоміцину

1. Отримання найбільш активних штамів стрептоміцетів

Отримання найбільш активних штамів стрептоміцетів - продуцента стрептоміцину. Селекція найбільш продуктивних штам-штамів S. grieus - одна з першорядних завдань в справі збільшеннявиходу стрептоміцину. Якщо раніше тільки що виділеніштами продуцента стрептоміцину утворювали не більше 50-100 мкг / мл антибіотика, то тепер отримані штами, які виробляють до 20000 мкг / мл стрептоміцину.У промислових умовах використовують штами здатні синтезувати до 10-20 тис. мкг / мл антибіотика. Таким чином, тільки за рахунок селекції антибіотична продуктів-продуктивність цих штамів у порівнянні з вихідними підвищилася в 100-200 разів. Важливу роль в селекції продуцентів стрептоміцину грають індукований мутагенез і ступінчастий відбір. Для отримання мутантів широко застосовують мутагенні фактори: рентгенівськеі ультрафіолетове випромінювання. Зазвичай для отримання мутантів з підвищеним утворенням стрептоміцину використовується метод багаторазового опромінення суперечка стрептоміцетами ультрафіолетовим світлом з доведенням загальноїдози до 10000-20000 ерг/мм? з подальшим застосуванням видимого світла.В результаті були отримані нові штами, що зберігають високу антибіотичну активність:

Середня Штам активність, мкг / мл

ЛС-січень 3000

«Новий 66» 4000

Новий варіант штаму «Новий 66» 4500.

2. Шляхи біосинтезу

Формула стрептоміцину виражається наступною структурою:

А: СНТ - «СН2ОН в дигідрострептоміцин

Б: СН3 - «СН2ОН в гідроксістрептоміціне

В: Н - «маноза в маннозідострептоміціне

Г: СН3 - «Н в N-деметілстрептоміціне

При гідролізі стрептоміцину розведеними кислотами він розпадається на стрептідін і стрептобіозамін:

C21H39O12N7 + Н2О - «C8H18O4N6 + CI3H23O9N.

Стрептоміцин стрептідін стрептобіозамін. Стрептідін (II) - 1,3 - дігуанідіно - 2,4,5,6 - тетраоксіцікло-гексан - сильне підставу, що не володіє антибіотичною активністю. Стрептобіозамін (III) - своєрідний дисахарид, в його складі є азотовмісними частина - N-метил-глюкозамін (IV) і частина, яка не містить азоту, - стрептоза (V).Встановлена просторова конфігурація молекули стрептоміцину (Г), залишок стрептобіозаміна приєднаний до 4-го угвуглецевого атома стрептідіна глікозидної зв'язком. Розглядаючи хімічну структуру стрептоміцину, неважко зауважити, що стрептідіновая частина сильно насичена азотом, в ній відношення азоту до вуглецю в 2,5 рази вище, ніж в білках (у білках це відношення дорівнює приблизно 0,30, в стрептідіне - 0,75, у всій молекулі стрептоміцину - 0,33). Ці дані дозволяють розглядати стрептідін як своєрідний колектор надлишкового азоту, накапливаемого в процесі життєдіяльності стрептоміцетами. Виходячи з цієї гіпотези нами ще в 1949 р. було зроблено перед-припущення, що споживання в процесі життєдіяльності стрептоміцетами речовин, перевантажених азотом в порівнянні з білками і містять азот у вигляді гуанідинових угруповань, повинно підвищувати вихід стрептоміцину. В якості таких речовин були взяті з'єднання, що включають гуанідинових угруповання: ар-аргінін (VI), N: С = 0,66, креатин (VII), N: С = 0,75, гуанідин (VIII), N: С = 3, а також сечовина (IX), N: С = 2. Крім того, використаний інозит (X) - сполука, що входить в молекулу стрептідіна і є ціклогексітоловим кільцем:

Результати дослідів, проведених на синтетичному середовищі з малоактивним штамом S.griseus ВНІЇПО-10, показали, що при додаванні до середовища 0,05% L-аргінінмоногідрохлоріда біосинтез стрептоміцину зростає більш ніж в 2,3 рази. Але якщо аргінін додавати одночасно з інозитом, то біосинтез антибіотика збільшується майже в 3 рази. Посилення освіти стрептоміцину відбувається і в тому випадку, якщо в середу додати креатин, гуанідин або сечовину, рівноцінні аргініну по кількості азоту. У всіх випадках кращий стимулюючий ефект спостерігався при додаванні до середовища названих речовин разом з інозитом. Таким чином, додаючи до середовища для культивування С. пзеіз звичайні (немічених) гуанідінсодержащі з'єднання (Аргінін, гуанідин), сечовину і інозит, вдалося показати, що вони значно підвищують вихід стрептоміцину. Наступними дослідженнями із застосуванням в дослідах мічених сполук були розшифровані основні шляхи біогенезу молекули стрептоміцину. Перш за все було показано, що всі вуглецеві атоми молекули антибіотика за виняткоматомів вуглецю гуанідинових груп утворюються за рахунок глюкози. При культивуванні на середовищі з соєвим борошном і міченої глюкозою було встановлено, що радіоактивна A4С) глюкоза включається в молекулу стрептоміцину. Розкладання отриманого таким чином стрептоміцину на складові його угруповання показало, що радіоактивність спостерігається в, стрептозі і в 1Ч-метил-Ь глюкозаміну (табл. 1).Глютамин і D-глюкозамін - джерела аміногруп стрептаміна.

Таблиця 1

D-стрептоза утворюється з D-глюкози в результаті рядуїї перетворень. М-метил-глюкозамін в молекулі стрептоміцину утворюється також з D-глюкози. При застосуванні О-1-14С-глюкози основна частина міченоїглюкози включалася в вуглецевий ланцюг аміносахара по першому углероду. При використанні Про-6-14С-глюкози накопичення мітки спостерігалося в 6-му вуглецевому атомі аміносахара. Таким чином, можна припускати, що можливий механізм перетворення асиметричних вуглеців D-глюкози - один з багаточисленних способів епімерізаціі. застосування міченого метіоніну A4СН3-Ь-метіонін) показало, що N-метил групи глюкозаміну синтезується з L-метіоніну. Вуглець гуанідинових груп стрептоміцину утворюється з вуглецю СО2. При використанні радіоактивного СО2било з'ясовано, що майже весь вуглець СО2 включається в гуанідинових бічних ланцюжків:

При цьому було встановлено, що більш інтенсивне включення радіоактивного вуглецю СО2 відбувається в тому випадку, якщо СО2 додається через 2 або 3 доби після посіву стрептоміцетами. При додаванні до середовища хлоргидрата L-аргініну (по 200 мг на колбу) помітно знижується включення 14С в молекулу стрептоміцину, хоча вихід стрептоміцину значно не збільшується. Останнє підтверджує наші висновки про те, що присутність аргініну в багатих за складом середовищах може не так помітно стимулювати біосинтез антибіотика. По-видимому, аргінін грає роль донора гуанідинових груп або груп сечовини при біосинтезі стрептоміцину. Можливо, що L-аргінін - проміжне з'єднання при біосинтезі гуанідінової частини молекули стрептоміцину, що цілком узгоджується з нашими уявленнями. У дослідах з відмитим міцелієм стрептоміцетами показано, щоречовини, що містять гуанідинові угруповання (L-аргінін, креатин, креатинін, гуанідин) або легко перетворюються в такі сполуки (цитрулін, орнітин), переводяться клітинамиS.griseus в з'єднання, має принаймні одну гуанідинове угруповання. Це з'єднання потім використовується продуцентом у процесі біосинтезу стрептоміцину.

Гуанідинових групи L-аргініну, мічені по вуглецю, беруть безпосередню участь у біосинтезі молекули стрептоміцину. Вся радіоактивність стрептидіна локалізується в гуанідинових угрупованнях.

Мабуть, процес утворення гуанідинових груп стрептоміцину зводиться до того, що під дією ферментів трансамідинова група-С-NH2 переноситься донором NH L-аргініну на молекулу акцептора. За даними ряду авторів, у продуцента стрептоміцину виявлена трансамідіназна активність, безпосередньо пов'язана з біосинтезом антибіотика. Трансамідиназну активність мають лише ті штами стрептоміцетів, які здатні синтезувати стрептоміцин або гідроксістрептоміцін. Подібна ситуація спостерігається при біосинтезі деяких пірольних похідних антибіотиків, наприклад ундецілпродігіозіна, продукованого певними штамами стрептоміцетів і має наступну будову:

Пролін

У мутанта S. coelicolor - одного з продуцентів названого антибіотика з порушеним процесом катаболізму проліну - відбувається істотне зниження освіти ундецілпродігіозіна. Показано, що біосинтез продгіозіна служить потенційної «пасткою» для проліну. Іншими словами, якщо при розвитку продуцента антибіотика не відбувається використання в метаболізмі проліну і він залишається незатребуваним і знаходиться в надлишку, то зазначена амінокислота йде на біосинтез ундецілпродігіозіна, підвищуючи його вихід. І навпаки, при зниженні освіти проліну і його інтенсивному включенні в конструктивні процеси, стрептоміцетами спостерігається зниження біосинтезу антибіотика. Участь інозиту (мезоінозіта) в біосинтезі молекули стрептоміцину встановлено прямими дослідами; використання в дослідах інозиту, рівномірно міченого 14С, який додавався до 96-годинний культурі S.griseus, показало, що в стрептоміцин, утворився за 24 год, основна кількість 14С концентрується в ціклогексітоловом кільці стрептідіна. У гуанідинових ланцюжках 14С повністю був відсутній (табл. 2).

Таблиця 2

Ці висновки підтверджуються даними ряду дослідників, які також показали, що інозит і особливо інозит в комбінації з аргініном збільшують вихід стрептоміцину. Отже, можна припускати, що інозит - попередник стрептідіна.

Встановлено, що хінонова і шикімова кислоти:

Хінонова Шикімова

Підвищення біосинтезу стрептоміцину при добавці аргініну до синтетичному середовищі відбувається і у високопродуктивногоштаму стрептоміцетами ЛЗ-1. Однак це підвищення по порівняно з контролем менше, ніж у слабоактивними продуцента. Стимулювання біосинтезу стрептоміцину відбувається за рахунок катодного фракції азотовмісних частини кукурудзяного екстракту, що складається переважно з основних амінокислот: аргініну, гістидину і лізину. Суміш вказаних кислот, узята в же співвідношеннях, що і в кукурудзяному екстракті, володіє майже таким же дією. Аргінін і гістидин збільшують вихід стрептоміцину у стрептоміцетами (штам ЛЗ-1) на 50-100% при розвитку його на синтетичному середовищі з сульфатом амонію. Гідролізат білка міцелію стрептоміцетами, інтенсивно синтезуючого антибіотик, містить значно менше основних амінокислот (особливо аргініну), ніж гідролізат білка міцелію з низькою здатністю до синтезу антибіотика. Аргінін використовується переважно на побудову молекули стрептоміцину, а не на побудову білка міцелію.

Кислотний гідролізат білка сої, що є єдиним джерелом азоту в середовищі, сприяє утворенню певного, хоча й не дуже високого в порівнянні з соєвим борошномкількості стрептоміцину. При видаленні з гідролізату (аргініну, лізину і гістидину) біосинтез антибіотика при цілком нормальному зростанні стрептоміцетами знижується приблизно на 50%. Фракції, що містять підстави і пролін, найбільш сприятливі для біосинтезу антибіотика, а фракції моноамінокислот - для зростання стрептрміцета. При використанні високоактивного штаму продуцента стрептоміцину фракція основних амінокислот кислотного гідролізату білка сої більш сприятливо впливає на біосинтез стрептоміцину, ніж фракція моно амінокислот.

Таблиця 3

За впливом на процес утворення стрептоміцину амінокислоти можна розділити на три групи:

Перша група. Амінокислоти, які не впливають на ріст стрептоміцета, але стимулюючі біосинтез антибіотика (аргінін, гістидин, лізин, гліцин, а-аланін, валін, фенілаланін, ізолейцин).

Друга група. Амінокислоти, які не впливають на освіту антибіотика (аспарагінова кислота, серії, треонін, метіонін, тирозин, лейцин).

Третя група. Амінокислоти, що пригнічують зростання стрептоміцета й гальмують біосинтез стрептоміцину (цистин, триптофан). Ензиматичні екстракт, виділений із зруйнованого лізоцимом міцелію S. пзеіз, здатний утворювати глюкозамін в дослідах в пробірці. У цьому екстракті виявлена уреназна активність, ніж, мабуть, пояснюється стимулюючий вплив сечовини як донора аміногруп у синтезі глюкозаміну. Освіта N-метильної групи в Глюкозамін пов'язано з процесом метилування. Відомо, що основним донором метильної групи при біосинтезі багатьох біологічно активних речовин є амінокислота метіонін:

Разом з тим дані показують, що вітамін В12стимулює процес біосинтезу ряду речовин, що містять метальними групу. Вітамін В12в поєднанні з метіоніном сприяє підвищенню виходу стрептоміцину культурою S. griseus (штам ЛЗ-1) до 25% (табл. 4) Аналізуючи експериментальні результати, можна констатувати, що встановлені послідовні етапи освіти стрептидіна, з'ясовано основні шляхи синтезу стрептози. Узагальнюючи дані по біосинтезу молекули стрептоміцину культурою S., можна запропонувати наступну схему:

При вивченні шляхів біосинтезу ряду антибіотичних речовин широко застосовуються мутанти мікроорганізмів із зміненими властивостями, пов'язаними з блокуванням деяких ланок в ланцюзі утворення молекули антибіотика. Такий підхід до вивчення біосинтезу антибіотиків дає можливість розкривати і пізнавати системи регуляції биосинтетической активності мікроорганізмів. При вивченні біогенезу стрептоміцину були використані різні мутанти неактивні (не здатні утворювати антибіотик) і малоактивні варіанти високопродуктивного штаму. Спільне культивування неактивного мутанта 1200 і малоактивного мутанта 1211 сприяє відновленню порушеною в процесі мутагенезу біосинтетичної активності у мутанта 1200 стрептоміцетами.

Фільтрати використовувалися з добової культури і додавалися до добової культури актиноміцетів.

Дані показують, що у неактивного мутанта 1200 біосинтез стрептоміцину здійснюється під впливом якогось речовини (або речовин), що міститься в культуральній рідині малоактивного мутанта 1211; це речовина неферментного природи, тобто при кип'ятінні воно не інактивується. Стимулюючий ефект з боку штаму 1211 спостерігається в тому випадку, якщо 24-48-годинна культуральна рідина додається до однодобового мицелию стрептоміцетами (штам 1200).Використовуючи метод спільного культивування активних і неактивних мутантів продуцента стрептоміцину, А.С. Хохлов з співробітниками (Л.Н. Анісімової, П.П. Решетовим, І.І. Товарової та ін.) ще в першій половині 60-х рр. XX сторіччя вперше відкрили і детально вивчили так званий А-фактор, а потім та інші біорегулятори метаболізму стрептоміцетов. А-фактор специфічно стимулює біосинтез стрептоміцину антибіотичні неактивним мутантом, бере участь в освіті стрептідіновой частини молекули стрептоміцину і впливає на процес спороутворення, відновлюючи споруляціі стрептоміцетами. Додавання стимулюючого фактора до мутанту, не утворюючому стрептоміцин, сприяє початку процесу трансамідінірованія Трансамідіназная активність міцелію передує біосинтезу стрептоміцину приблизно на 10 ч. По-видимому, дія активатора пов'язано з індукцією трансамідіназа.

А-фактор виділений з культуральної рідини (штам751); йому дана первинна характеристика, визначені молекулярна маса C42) і емпірична формула (С13Н22О4).У 1976 р. Е.М. Клейнер з співробітниками встановили структурну формулу А-чинника, що забезпечує нормальний розвиток

і біосинтез їм стрептоміцину, а в 1977 р. здійснили хімічний синтез рацемічного А-фактора і його гомологів. Ті ж автори показали, що синтезований біорегулятор володіє такою ж біологічною активністю, як і природний фактор. Два гомолога А-фактора мають наступну будову:

штам антибіотик стрептоміцин аргінін

А-фактор представляє собою 28-ізокапрілоіл-38-оксиметил-7-бутіролактон. Стрептоміцетами одночасно синтезує двагомолога. А-фактор у стрептоміцетів - це своєрідний авторегулятор метаболізму, він не тільки стимулює біосинтез стрептоміцину у відсутніх по А-фактору мутантів.

Механізм його дії пов'язаний з дерепресія певних ділянок ДНК стрептоміцетов, що здійснюють запуск різноманітних процесів, необхідних в кінцевому рахунку як для морфогенезу, так і для біосинтезу антибіотика. Порушення утворення А-фактора впливає на процеси, пов'язані з біосинтезом молекули стрептоміцину: різко знижується активність амідінотрансферази - ферменту, що в стрептоміцинові.

У цитоплазмі виявлений білок, що зв'язує А-фактор. В інших видів стрептоміцетів, неутворюють стрептоміцин, виявити такий білок не вдалося. До теперішнього часу у різних родів актиноміцетів (Nocardia і споріднених їм актиноміцетів) встановлено більше десяти регуляторів розвитку - аналогів або гомологів А-фактора. Причому у різних видів актиноміцетів гени, відповідальні за біосинтез А-фактора, локалізовані або на хромосомі E. coelicolor), або на плазміді E. пзеіз). Ауторегулятори, подібні А-фактору стрептоміцетов, виявлені у представників інших видів мікроорганізмів, які здатні регулювати різні процеси.

Отримано мутант продуцента стрептоміцину, блокований по біосинтезу стрептідіна (такі мутанти називають ідіотрофамі). Вироблення антибіотика цим мутантом відбувається лише в тому випадку, якщо до середовища доданий стрептідін. Зі збільшенням концентрації доданого стрептідіна синтез стрептоміцину зростає. Кількість доданого стрептоміцину стрептідіна, мкг / мл на 5-ту добу, мкг / мл

250 62

500120

1000 350

Це вказує на те, що стрептідін цілком включається в молекулу стрептоміцину, тобто є її попередником. У культуральній рідині стрептоміцетами, що розвивається без А-фактора, синтезується інша речовина регуляторного характеру, здатне індукувати перехід розвитку мікроорганізму у стадію активного утворення стрептоміцину. Отримано ряд мутантів з блоками біосинтезу стрептідіна на різних етапах. Виділено мутанти продуцента стрептоміцину, блоковані по біосинтезу стрептобіозаміна. Додавання стрептобіозаміна в среду, де розвиваються отримані мутанти, сприяло збільшенню вироблення стрептоміцину в 3-6 р. Стрептобіозамін використовується на відносно пізніх стадіях розвитку стрептоміцетами. Аналогічні прийоми, широко застосовуються при вивченні процесів біосинтезу антибіотиків, отримали назву мутосінтеза, або мутаційного синтезу (Докладніше див С. 409-410). Ці результати показують, що в процесі утворення стрептоміцину бере участь ряд регуляторних механізмів, виявлення яких за допомогою мутантних штамів допоможе розкрити дійсні шляхи механізму біосинтезу молекули стрептоміцину.

Размещено на Allbest.ru