Классификация плазмид

Спектиномицин

-//-

Изменения в транспорте антибиотика

N-ацетилтранс-феразаO-фосфотранс-феразаO-нуклеотид-Трансфераза.

Неомицин, канамицин,Гентамицин и др.

-//-

-//-

O-аденилтранс-фераза.Ацетилтранс-Фераза.

Фузидовая кислота.

Ингибирование фактора элон-гации в бел-ковом синте - зе на уровне рибосомы.

Непроницаемость клетки для антибиотиков.

Ацетилтранс-фераза.

Ферментативная инактивация антибиотика происходит в среде за пределами клетки. Одиночные клетки поэтому беззащитны. Ферменты b-лактамазы инактивируют

B-лактамные антибиотики путем гидролиза еще до того, как они успеют проникнуть через клеточную мембрану и достичь пенициллинсвязывающих белков в ЦПМ.

Изменение сайтов-мишеней в качестве механизма резистентности показаны с случае многих антибиотиков. Однако прямое отношение доказано лишь в случае эритромицина и линкомицина. Механизмы резистентности к этим антибиотикам заключаются в специфическом N6-диметилировании 2-х адениновых остатков в рРНК, в результате чего, такие рибосомы в значительно меньшей степени связываются с антибиотиком (такое связывание привело бы к ингибированию белкового синтеза).

Efflux-механизм характерен для резистентности к тетрациклинам. Он связан с удалением из клетки этого антибиотика. Не исключено, что пониженное действие тетрациклина связано как с пониженным его восприятием клеткой, так и с efflux-механизмом.

Обходные механизмы лежат в основе плазмидной резистентности к сульфонамидам и триметоприму. Плазмиды обеспечивают клетки новым ферментом, заменяющий подавленный и нечувствительный к ингибирующему действию антибиотика.

Кроме всего перечисленного плазмиды определяют также и резистентность к тяжелым металлам и др.

Резистентность к ртути и ртутьорганическим соединениям. Токсичность ионов ртути для бактериальной клетки определяется тем, что они очень легко связываются с сульфгидрильными группами мембранных белков и ферментов, ингибируя синтез макромолекул и др. действия ферментов.

Резистентность к кадмию, который, связываясь с сульфгидрильными группами мембранных белков, прекращает клеточное дыхание.

Резистентность к серебру (действует в том же направлении, что и кадмий).

А также ко многим другим веществам (медь, висмут,

Свинец, бор, хром, кобальт, никель, соединения цинка).

Мутации внехромосомных факторов резистентности

Эписомные элементы (плазмиды), обладающие способностью поддерживать собственное автономное состояние и независимость скорости репликации от регуляторных механизмов клетки-хозяина, также независимо могут мутировать, либо не влияя на поведение бактериальной клетки, либо в какой-то мере изменяя ее физиологические функции.

Обычно принято считать, что эписомные детерминанты контролируют невысокую резистентность; однако в действительности имеется немало наблюдений, противоречащих такому представлению. Наблюдался четко выраженный мутаторный эффект у штамма Salmonella typhi, выделенного от больного; штамм этот характеризовался наличием разных типов R-факторов: Sin, Тс, только Тс, или Тс, Sm. Культуры бактерий Salmonella typhi, Salmonella typhimurium и E. coli, инфицированные этими факторами, проявляли генетическую нестабильность и мутабельность детерминантов резистентности к высоким концентрациям антибиотиков. Высокая резистентность передавалась реципиентам при последующей конъюгации со скоростью, типичной для трансмиссивных элементов. Внехромосомная локализация детерминантов, контролирующих высокую резистентность, подтверждалась возможностью их элиминации. Генетический анализ мутаций у полирезистентных штаммов довольно сложен прежде всего потому, что в них могут сосуществовать независимые друг от друга комплексы детерминантов резистентности со своими автономными факторами передачи, и каждый такой комплекс может видоизменяться в результате разнообразных событий - мутаций, сегрегации или рекомбинаций. Фенотипическое выражение подобного рода изменений в состоянии генома бактериальной клетки часто взаимно маскируется и с трудом поддается дифференцированному тестированию.

Часто имеет место мутационное изменение генов, контролирующих репликацию самого фактора резистентности в естественных условиях. Такие мутации могут увеличить копийность плазмиды, что часто усиливает резистентность к большим концентрациям лекарственных и других веществ.

Иногда в мутациях затрагиваются регуляторные механизмы, контролирующие проявления конъюгативности бактерий. При этом может, например, сниматься репрессия донорской активности.

Роль бактериального генома у сальмонелл нередко проявляется в ограничении функций внехромосомных элементов, в том числе и факторов трансмиссивной устойчивости к лекарственным веществам. Известно, например, что сальмонеллы обладают низкой реципиентной активностью. R-факторы воспринимаются ими, как правило, с незначительной частотой, что связывается с ограничением, контролируемым клеткой-хозяином. Под влиянием мутагенов можно получить мутанты R-факторов, способные преодолевать это ограничение. Такие мутанты были получены путем воздействия нитрозогуанидина на Salmonella typhimurium c R-фактором дикого типа; способность R-мутантов преодолевать ограничения представляется функцией, независимой от реципиентных свойств бактерии-хозяина.

Мутации по устойчивости к хлорамфениколу наблюдали еще в 1969г. у штамма Klebsiella c устойчивостью к пяти антибиотикам. При конъюгации маркеры резистентности передавались реципиентам из различных систематических групп грамотрицательных бактерий - эшерихий, шигелл, протеев и др., а также путем трансдукции с фагом Рlс из E. coli. Проявление мутационного эффекта только в отношении резистентности к одному антибиотику свидетельствует об индивидуальной генетической реакции отдельных детерминантов резистентности на воздействие мутагенов.

Это далеко не исчерпывающее описание возможных мутаций, котрых у плазмид может наблюдаться огромное множество.

Элиминация R-факторов.

Лекарственная устойчивость бактерий, детерминируемая трансмиссивными генетическими элементами, представляет серьезную угрозу ее неограниченного распространения, принимающего масштабы подлинной «пандемии» в микро мире, связанной с экологией человека и животных. Поэтому в настоящее время придается чрезвычайно важное значение исследованиям, направленным на изыскание путей предотвращения или по крайней мере существенного ограничения распространения лекарственной устойчивости у бактерий, составляющих микрофлору нестерильных полостей макроорганизма - человека, животных, птиц и даже возможных переносчиков бактериальных возбудителей инфекции.

Многими исследователями было замечено, что признаки устойчивости к лекарственным веществам у грамположительных и грамотрицательных бактерий, контролируемые внехромосомными детерминантами, нередко утрачиваются спонтанно или закономерно исчезают после обработки определенными соединениями, обладающими избирательной ДНК-тропностью. Этот феномен, обозначаемый термином «элиминация», связанный с утратой генетических детерминантов, в том числе плазмид и факторов резистентности, используется как одно из доказательств их внехромосомной локализации.

Изучение сущности и механизмов этого явления представляет большой не только теоретический, но и практический интерес, хотя до настоящего времени не удалось еще достигнуть такого эффекта элиминации, чтобы его можно было использовать в клинических целях. Задача поиска эффективных средств элиминации эписомных детерминантов резистентности осложняется, еще и тем обстоятельством, что большинство известных элиминирующих соединений является либо мутагенами, либо, кроме того, и канцерогенами, что налагает дополнительную ответственность на испытателей при оценке эффективных средств и практических рекомендаций. В качестве элиминирующих агентов наиболее широко используются при теоретических исследованиях акридиновые красители (акрихин, акридиновый оранжевый). При элиминации происходит необратимая утрата генетических элементов, локализованных вне хромосомы.

Механизмы, лежащие в основе элиминирующего действия акридиновых красителей, во многом остаются нерасшифрованными, однако методами генетического анализа четко показано, что при действии акридинов на бактерии, обладающие трансмиссивной резистентностью к антибиотикам, происходит полное подавление генетических и физиологических функций ее детерминантов. возможно, элиминация связана с блокированием репликации эписом либо нарушения участка ее инициирования, либо из-за нарушения прикрепления эписомных реплик к центрам бактериальных мембран, отвечающих за сегрегацию генетического материала в дочерних клетках.

Novick (1963) показал, что спонтанные пенициллиночувствительные варианты стафилококка с полной утратой пенициллиназной активности не мутируют ни спонтанно, ни после обработки мутагенами в направлении восстановления устойчивости к пенициллину. Эти же формы не дают и рекомбинантов дикого типа при скрещивании друг с другом, а также с мутантами, сохранившими низкий уровень образования этого фермента.

Факторы трансмиссивной резистентности к лекарственным веществам, как отмечено ранее, ведут себя подобно другим внехромосомным элементам, которые в автономном, состоянии могут быть подвержены эффективному действию элиминирующих агентов. Поэтому некоторые общие положения, выявленные на других системах, могут быть приняты и для резистентных бактерий.

Отсутствие эффекта полной элиминации определенных внехромосомных детерминантов может быть следствием того, что в одной клетке имеется несколько различных R-факторов с различными наборами генов резистентности.

Помимо акридиновых красителей, за последнее время выявлены другие соединения с высокой элиминирующей активностью. Одним из таких соединений оказался бромид этидиума. Показано, что это соединение в низких концентрациях (5 ё 10 * Ю6 М, рН 7,2) вызывало у энтеробактерий практически полную элиминацию факторов R4, R22, в то время как другие, хорошо передающиеся при конъюгации факторы (R15 и R8) не элиминировались вообще. Причина, лежащая в основе этого различия, пока остается невыясненной. У стафилококков с пенициллиназной активностью также удалось с довольно высокой эффективностью (8-100%) освобождать клетки от плазмид, причем устойчивость к сулеме и образование пенициллиназы утрачивались одновременно, но без потери устойчивости к эритромицину. Примечательно, что на пенициллиназных плазмидах Staphylococcus aureus может находиться детерминант, определяющий устойчивость к этому препарату. Другим высокоактивным препаратом оказался додецилсульфат натрия, который не только приводил к элиминации R-факторов, но и вообще был более токсичен по отношению к R+ - клеткам, чем к клеткам без R-факторов. Это служит еще одним примером лекарственной конверсии клеток. Аналогичным действием обладал 4-нитрохинолин-1-оксид.

С действием додецилсульфата натрия можно также сравнить действие пенициллина, который в суббактериостатических концентрациях вызывает устранение R-факторов из клеток Salmonella paratyphi (R)

В качестве элиминирующих агентов может выступать большое число соединений, в том числе и такие, которые являются естественными метаболитами (гуанин, глюкоза и некоторые детергенты освобождают клетки Staphylococcus aureus от плазмид с пенициллиназной активностью).

Большое число работ касается данных об элиминирующем действии повышенной температуры на культуры стафилококка с пенициллиназной активностью. Отмечается, что условия повышенной температуры вызывали не только появление негативных вариантов, но и селективно способствовали более быстрому росту последних.

Нужно учесть, что некоторые элиминирующие химические агенты в определенных концентрациях могут не только вызывать утрату устойчивости, но в силу своего мутагенного потенциала могут индуцировать ее в некоторых случаях. Учитывая, что все акридины являются в определенных условиях мутагенами, нельзя исключить подобный эффект, особенно при анализе свойств одномаркерных факторов резистентности, где фенотипическое выражение «элиминация» в действительности может отражать мутационное изменение, характеризующееся повреждением генов, контролирующих чувствительность к определенному веществу.

Лекарственная конверсия.

Детерминанты устойчивости вызывают в клетках бактерий изменения, затрагивающие самые разнообразные признаки и известные в литературе как проявление «лекарственной конверсии». Приводятся сведения о более высокой выживаемости бактериальных клеток, инфицированных некоторыми R-факторами, поле УФ-облучения. Лекарственная конверсия может затрагивать также фаготип сальмонелл

как при эписомной, так и хромосомной локализации детерминантов устойчивости и влиять на эффективность развития большого числа фагов в клетках E. coli К12 как с fi+, так и с fi - R-факторами

Б. А. Шендеров (1970), исследовавший активность некоторых оксидоредуктаз дизентерийных бактерий (Shigella flexneri и Shigella Sonne), воспринявших R-факторы в опытах in vitro от E. coli, отмечал у них повышение каталазной и пероксидазной активности. Само по себе присутствие плазмиды резистентности сообщает клеткам высокую чувствительность к названным препаратам. В то же время замечено, что, R-фактор, по-видимому, сообщает клеткам и более высокую мутабельность по резистентности к лекарственным веществам.

Сейчас все же приходится констатировать, что работ, отражающих существенный прогресс в изучении путей предотвращения или ограничения распространения множественной лекарственной устойчивости бактерий, еще очень мало.

Продление чувствительности к лекарствам.

Упорядочивание использования антибиотиков и строгий контроль.

Прекращение использования клинически ценных антибиотиков в качестве кормовых добавок.

Поиск ингибиторов на ингибиторы действия лекарств.

Поиск новых антибиотиков, резистентных к ферментам плазмид.

Плазмиды бактериоциногении.

Бактериоцины - вещества, летальные для клеток бактерий. Их названия определяются названиями микроорганизмов-продуцентов. Это термостабильные белки, массой от 10000 до 90000 дальтон.

Плазмиды колициногении (col) наиболее изучены. Они содержатся в 20% штаммов E. coli. Колицины подразделяют на группы: A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, S1, S2, S3, S4, S5, V. Группа E делится на E1, E2, E3 и тд. E1 вносит непоправимые изменения в цитоплазматическую мембрану. E3 разрушительно воздействует на рРНК, E2 вызывает деградацию ДНК.

Плазмиды тоже делятся на 2 группы: I (col E1, col E2, col E3, …E4, …E5, …E6, …E7, …E8, ..E9, col N, col K, col A) и II (col Ib, col B, col V)

Среди плазмид колициногении встречаются как конъюгативные, так и неконъюгативные. Некоторые способны мобилизовать хромосомные гены. Все плазмиды колициногении постоянно находятся в автономном состоянии.

Колицины действуют только на близкие по виду клетки, адсорбируясь на специальных рецепторах на их поверхности. Для того, чтобы убить чувствительную клетку достаточно нескольких молекул колицинов.

Бактериоцины продуцируются и другими клетками. Так Bacillus megaterium продуцируют три вида мегатериоцинов: A, B, C.

Плазмиды и патогенность бактерий.

Патогенность - комплексный полигенный (мультифакторный) признак бактерий, представляющий собой биохимические механизмы, посредством которых бактерия вызывает болезнь макроорганизма. В любом случае участие в патогенности принимают плазмиды.

Атрибуты патогенности

Способность к адгезии (позволяет конкурировать с бактериями-комменсалами за колонизацию эпителиальных поверхностей). Обеспечивается адгезинами и клеточными рецепторами. Бактериальный адгезин - белковая структура, на поверхности клетки бактерии. Он взаимодействует с рецептором соматической клетки. В качестве адгезинов часто выступают обычные пили или фимбрии.

Факторы инвазивности - гемолизины, гиалуро-нидаза, протеаза, ДНК-аза, лецитиназа.

Антифагоцитарные свойства - капсула и др.

Токсины.

Плазмиды и патогенность E. coli

Характерная особенность клеток энтеропатогенных штаммов E. coli в том, что они способны к колонизации на поверхности кишечника, покрытой эпителием и обычно свободной от бактерий. Колонизация обеспечивается адгезией. Клетки этих штаммов обладают антигенами K, и способность к колонизации связана с наличием поверхностного К-антигена - белковых фимбрий.

Антиген адгезии у E. coli в разных серогруппах.

Адгезин	O-серогруппа	Источник
K88	08,045,0138,0141,0149,0157	Поросенок
K99	08, 09, 020, 0101	Теленок, овца
K99	064,0101,015,025,063,078	Порос., человек
CFAII	06, 08	Человек
F41	09, 0101	Теленок
987P	09, 020, 0141	Поросенок

Для бактерий энтеропатогенных и непатогенных штаммов характерно наличие фимбрий, вызывающих гемагглютинацию эритроцитов. Фимбрии I типа позволяют бактерии прикрепляться к эритроцитам, лейкоцитам, эпителиальным клеткам и др. Они вызывают гемагглютинацию, ингибируемую D-маннозой. Фимбрии другого типа есть только у энтеропатогенных штаммов. Они обеспечивают специфическую адгезию на клетках эпителия кишечника и специфичны для видов эритроцитов, подвергающихся гемагглютинации, которая не ингибируется D-маннозой.

То, что адгезия бактерий энтеропатогенных штаммов действительно контролируется плазмидой, было доказано в эксперименте. Было показано, что E. coli E2348/69 содержат плазмиду адгезии. После элиминации последней, бактерии теряли способность к адгезии. А при введении этой плазмиды обратно в клетки способность восстанавливалась.

Энтеротоксигенные штаммы рассматриваемых эшерихий способны продуцировать LT и St токсины. Lt - термолабильный, ST - термостабильный. Плазмиды Ent контролируют их синтез. Многие из этих плазмид - F-подобные. Токсин LT детерминируется плазмидой, распространенной среди E. coli, вызывающих диарею у людей. А ST - у человека и животных. Плазмиды, детерминирующие синтез обоих токсинов встречается у O-серогрупп: 06, 08, 015, 020, 025, 063, 078, 0115, 0128, 0148, 0159. Фенотип LT+ST часто коррелирует с наличием факторов колонизации.

Связь между токсигенностью и

Наличием антигенов колонизации.



K-антиген	Энтеротоксин
ST	LT	ST+LT
K87	+	+	+
K99	+	-	-
CFAI	+	+	+
CFAII	-	-	+
38FP	+	-	-
F41	+	-	-

Хотя корреляция токсигенной и гемолитической активности (детерминируемой плазмидой Hly) отмечалась многими исследованиями, большого значения гемолитическим свойствам не придавалось. В лаборатории Кудлай Д. Г. были получены данные, свидетельствующие о том, что введение фактора Hly увеличивает патогенность бактерий (это было доказано методом внутрибрюшинного введения белым мышам токсигенных E. coli до и после инфицирования бактерий плазмидой Hly). Многие клетки Hly+ в той или иной степени токсигенны, хотя однозначной зависимости нет. Передача непатогенным E. coli J62 Hly сообщала им способность вызывать дермонекрозы у кроликов. Патогенность бактерий Hly+ вероятно вызвана не самой способностью вырабатывать гемолизины, а тем, что эта плазмида также детерминирует синтез некоторых токсических веществ (гемотоксинов).

Весьма неприятны случаи комбинированных плазмид, контролирующих и R-признаки и токсигенность, т. к. штаммы, обладающие обусловленной ими токсигенностью, будут распространяться в условиях, когда часто использование антибиотиков в качестве кормовых добавок. Большинство штаммов E. coli, выделяемых при уроинфекциях, менингите, перитонитах и бактериемиях обладают вирулентными свойствами, контролируемыми такими плазмидами. В клетках E. coli, выделяемых при госпитальных инфекциях, обнаруживаются с большой частотой плазмиды Col. Col V обеспечивает повышение вирулентности, резистентность к бактерицидному действию крови. Плазмиды R могут повышать резистентность к сыворотке крови (R6-5). R100 отрицательно влияет на формирование комплемента.

Бесконтрольное использование антибиотиков может привести к селекции и распространению бактерий, обладающих не только резистентностью, но и вирулентностью.

Плазмиды и патогенность других бактерий

Бактерии родов Shigella и Salmonella - инвазивны. Факторы инвазивности детерминируются соответствующими плазмидами. Наличие R-плазмид в них сильно повышает их вирулентность. Переживание в инфицированных соматических клетках обеспечивается у шигелл синтезированием плазмидного гемолизина. В случае сальмонелл установлено, что плазмиды - обитатели наиболее патогенных штаммов. Считают, что плазмиды не нужны для инвазии соматической клетки, они необходимы для пролонгированного переживания сальмонелл в клетках.

Бактерии рода Yersinia - инвазивные. Их вирулентность определяется плазмидой pYV, которая имеет несколько вариантов.

Доказано, что продукция энтеротоксина S. aureus контролируется внехромосомным генетическим элементом. Показан плазмидный контроль их эксфолитивного токсина (кожный синдром у новорожденных). Устойчивость к антибиотикам обеспечивает эпидемичность распространения.

У стрептококков плазмиды контролируют:

Конъюгативную активность.

Резистентность к лекарственным веществам.

Гемолизины.

Бактериоцины и чувствительность к ним.

Утилизация углеводов (лактоза, сахароза).

Синтез М-белка.

Из рассмотренного видно, какую большую роль играют плазмиды в существовании бактерий и, следовательно, человека.

Актуальные задачи генетики микроорганизмов в настоящее время невозможно представить без систематического изучения роли и механизмов действия внехромосомных факторов наследственности. Исследование генетической природы, молекулярной структуры и регуляции функций плазмид представляет собой одну из фундаментальных проблем современной биологии.

Популярность внехромосомных факторов наследственности микроорганизмов в качестве экспериментальной модели для исследований в разных аспектах объясняется широтой распространения явлений, контролируемых ими и не укладывающихся в рамки хромосомных мутаций, относительной простотой методических приемов идентификации внехромосомных элементов, неограниченной возможностью манипуляций с целью генетического моделирования и четкостью результатов физико-химического анализа их структуры и физиологических функций.

Перспектива использования плазмид и эписом в связи с их исключительной биологической пластичностью оценивается молекулярными биологами трезво и объективно. Интенсивно ведется изучение в области генной инженерии. Исследователи отчетливо понимают сложность таких исследований, которые могут привести к непредсказуемым результатам. Природа может «отомстить» за слишком свободное вмешательство в ее секреты. Именно поэтому важно знать диапазон природных вариаций в формировании заведомо вредных для человека форм микроорганизмов, условия, способствующие стабилизации вновь создаваемых биологических систем или ограничивающие ее.

Объективное представление об истинном значении в этих процессах конъюгативных плазмид, эписом, умеренных фагов и полноценных вирусов бактерий можно получить только с учетом особенностей их экологии, для которой типично формирование стабильного микробиоценоза в нормальных условиях обитания организма.

Представляется оправданным более широкий фронт исследований, направленных на изучение взаимодействия плазмид с целью создания стабильных генетических систем, обеспечивающих более высокую конкурентоспособность (приживляемость в условиях живого организма) обладающих ими бактерий хозяев.

Вполне реально конструирование штаммов-продуцентов, несущих целенаправленные сочетания дерепрессированных плазмид со свойствами специфического ингибирования репликации и передачи факторов патогенности. По-видимому, в недалеком будущем на повестку дня станет создание комплексных бакпрепаратов, соответствующих задачам коррекции определенного типа микробиоценоза и дисбактериозов, сопряженных с периодическим доминированием условно патогенных и патогенных микроорганизмов.

Такие задачи естественно возникают при анализе замкнутых экосистем, а также при разработке теоретических проблем эволюции микроорганизмов.



Список использованной литературы

1. Д.Г. Кудлай «Внехромосомные факторы наследственности и их значение в инфекционной патологии» Москва, «Медицина», 1977 г.

2. Д.Г. Кудлай, В.Ф. Чубуков, М.Г. Оганесян «Генетика лекарственной устойчивости бактерий» Москва, «Медицина», 1972 г.

3. З.А. Шабарова, А.А. Богданов, А.С. Золотухин «Химические основы генетической инженерии» Москва, издательство МГУ, 1994 г.

4. «Лекарственные средства» Москва, «Русская книга»,1993 г.

5. Пехов А.П. «Основы плазмидологии» Москва, издательство Российского Университета Дружбы Народов, 1996 г.

6. «Микробиология» 1992 №4 Лукин С.А., Прозоров А.А. «Конъюгационный перенос плазмидной ДНК между бактериями в почве».

7. Канапина А.Ш. «Изучение природы плазмид B. subtilis» Москва, РАН Институт Общей Генетики имени Н. И. Вавилова, 1995 г.

8. «Молекулярная генетика, микробиология, вирусология» 1994 №5 Петровская В.Г., Бондаренко В.Н. «Роль хромосомы и ее взаимодействие с внехромосомными детерминантами в процессе генетического контроля патогенности бактерий».

Размещено на Allbest.ru

...