Размещено на http://www.allbest.ru/

Пензенский государственный педагогический университет им. В.Г. Белинского

кафедра биохимии

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ МСМ СЫВОРОТКИ КРОВИ БОЛЬНЫХ АЛКОГОЛИЗМОМ НА АКТИВНОСТЬ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ Н И ФМСФ-ИНГИБИРУЕМОЙ КАРБОКСИПЕПТИДАЗЫ

А.К. КОРНЕВА,

А.Г. БОБЫЛЁВ,

А.В. КУЗНЕЦОВА,

М.Т. ГЕНГИН

В эксперименте из проб сывороток крови больных алкоголизмом и больных, подвергшихся терапевтическому лечению, двумя разными методиками были выделены по две фракции пептидов - термостабильные молекулы средней массы (t - МСМ) и осаждённые трихлоруксусной кислотой (ТХУ - МСМ), способные проявлять различную биологическую активность. Исследовано их влияние на активность карбоксипептидазы Н (КП Н) и фенилметилсульфонилфторид - ингибируемой карбоксипептидазы (ФМСФ - КП). Выявлена зависимость изменения активности данных ферментов при воздействии выделенных из сыворотки крови больных фракций от стадии заболевания и от эффективности терапии.

Источником образования молекул средней массы в организме считается белковая деградация [10]. Результатом протеолиза является образование продуктов деградации белков - молекул средней массы (с молекулярной массой 300-5000 Да.). [6] Многие авторы [12] [13] получили и идентифицировали группу веществ, относящихся к МСМ. Во всех случаях концентрация МСМ в плазме людей с определённой патологией оказалась выше, чем в плазме здоровых лиц, что стало обоснованием предположения о возможном возрастании их концентрации у больных алкоголизмом [11]. Так как отдельные фракции МСМ обладают нейро- и психотропным свойствами, представляет интерес изучение влияния МСМ сыворотки крови больных алкоголизмом на активность основного фермента синтеза нейропептидов - карбоксипептидазы Н, а так же на активность такого фермента обмена биологически активных пептидов, как ФМСФ-КП.

Материал и методика

Во фракциях, полученных кипячением сыворотки крови (t - МСМ) больных алкоголизмом по сравнению с контрольной группой здоровых людей обнаружено повышение ИИ у больных алкоголизмом. Наиболее выражено увеличение индекса интоксикации у больных с тяжелыми формами алкоголизма (депрессии, психические расстройства и т.п.) (рис.1).

а. б.

Рис. 1. Значения индекса интоксикации в разных группах. Контроль - группа клинически здоровых людей; группа 1 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами - проявления алкогольного делирия (АД); группа 2 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами - проявления алкогольно-абстинентного синдрома (ААС).

сыворотка кровь фракция пептид

Индекс интоксикации больных алкоголизмом, оцененный по определению поглощения фракции ТХУ - МСМ после диализа оказался почти вдвое ниже, чем у контрольной группы здоровых людей (рис.1 б). Вероятно, при диализе были удалены некоторые низкомолекулярные пептиды, содержащие ароматические аминокислоты и влияющие на поглощение при 280 нм.

ФМСФ - ингибируемая карбоксипептидаза (ФМСФ - КП) - фермент, открытый в лаборатории М.Т. Генгина в лаборатории биохимии ПГПУ им.В.Г. Белинского [3, 4, 7, 9], вероятно относится к классу сериновых карбоксипептидаз. Было показано, что уровень ФМСФ - КП коррелирует с распределением биологически активных пептидов - гормонов. Предполагается, что этот фермент вовлечен в биосинтез и процессинг нейропептидов [2, 7, 8]. Так как многие проявления алкоголизма (возбуждение, эйфория, депрессии и т.п.) напрямую связаны с нарушением баланса нейропептидов, представляет интерес изучение влияния фракций МСМ сыворотки крови больных алкоголизмом на активность ФМСФ - КП.

Фракции МСМ, полученные разными методами, оказывали различное действие на активность ФМСФ - КП. Наибольшие различия наблюдались при использовании фракции t - МСМ. Термостабильная пептидная фракция сыворотки крови здоровых людей оказывала значительное ингибирующее влияние на активность ФМСФ - КП (остаточная активность - 30 %, рис.2 а).

Вероятно, в сыворотке крови здоровых людей присутствуют ингибиторы протеиназ, контролирующие активность ферментов и уровень активных нейропептидов. При алкоголизме уровень этих ингибиторов снижается. Так, при добавлении термостабильной фракции сыворотки крови (t - МСМ) больных алкоголизмом в острой стадии алкогольного абстинентного синдрома (ААС) (группа 2) мы наблюдали лишь незначительное снижение активности ФМСФ - КП (остаточная активность - 85 %). В условиях терапии (ноотропы, седативные препараты, витамины и т.д.) ингибирующее влияние сыворотки крови больных алкоголизмом восстанавливалось, но не достигало высоких ингибирующих значений контрольной группы здоровых людей (рис. 2 а, группа 4).

а. б.

Рис.2. Влияние термостабильной фракции (t - МСМ) и ТХУ - МСМ фракции средних молекул сыворотки крови на активность ФМСФ - КП. Группа 1 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами - проявления алкогольного делирия (АД); группа 2 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами - проявления алкогольно-абстинентного синдрома (ААС); группа 3 - больные хроническим алкоголизмом с выраженными соматическими проявлениями (обострение хронических заболеваний, гепатоз, гепатит); группа 4 - больные, прошедшие курс комплексной терапии (инфузионная, антиседативные препараты, витамины, ноотропы, гепатопротекторы); контроль - группа клинически здоровых людей.

Отдельно среди наркологических больных была выделена группа людей с сочетанными патологиями - хронический алкоголизм, отягощенный гепатитом, почечной и сердечной недостаточностью (рис.2 а, группа 3). Фракция t - МСМ сыворотки крови больных 3 - й группы оказывала наибольший ингибирующий эффект на активность ФМСФ-КП (остаточная активность - 20 %). Вероятно, при длительном употреблении алкоголя нарушаются белок - синтезирующие функции печени, что приводит к дестабилизации компенсаторных механизмов, имеющих место в остром периоде заболевания.

На рис.2 б приведены результаты исследований по влиянию на активность ФМСФ - КП диализованной фракции сыворотки крови здоровых людей и больных алкоголизмом (ТХУ - МСМ). ТХУ - МСМ сыворотки крови здоровых людей оказывали активирующее влияние на ФМСФ-КП. Фракции ТХУ - МСМ сыворотки крови больных алкоголизмом снижали активность ФМСФ - П в среднем на 20 % (рис.2 б).

Таким образом, фракции МСМ сыворотки крови, полученные разными способами (осаждение белков ТХУ и кипячение) не однозначно влияли на активность ФМСФ - КП.

Возможно, пептидные фракции сыворотки крови, полученные после осаждения белков разными способами, отличаются по соотношению пептидов различных молекулярных масс. Диализованнная ТХУ - МСМ - фракция содержит меньше низкомолекулярных пептидов (до 1000 кДа), чем недиализованная t - МСМ (удаление белков кипячением).

Также неоднозначно действуют МСМ - фракции сыворотки крови на активность карбоксипептидазы Н. КП Н - основной фермент процессинга нейропептидов, относится к классу карбоксипептидазо - В - подобных ферментов, катализирует реакцию отщепления положительно заряженных аминокислот с С - конца пептидов [2, 5, 8].

У здоровых людей фракция t - МСМ, содержащая преимущественно низкомолекулярные пептиды, оказывала ингибирующее действие на активность КП Н (остаточная активность - 29,7 %, рис.3 а), а диализированная фракция ТХУ - МСМ активировала КП Н (остаточная активность - 120 %, рис 3 б). Влияние t - МСМ сыворотки крови больных алкоголизмом на активность КП Н прослеживалась более четко, чем влияние диализованных ТХУ - МСМ. У больных с проявлениями алкогольно - абстинентного синдрома наблюдается сильная активация КП Н при исследовании фракций t - МСМ, активация по сравнению с контролем прослеживается и у больных с АД, но гораздо слабее (рис.3 а, группы 2 и 1).

а. б.

Рис. 3. Влияние фракций t - МСМ и фракций ТХУ - МСМ сыворотки крови на активность КП Н. Группа 1 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами - проявления алкогольного делирия (АД); группа 2 - больные алкоголизмом с выраженными симптомами - проявления алкогольно - абстинентного синдрома (ААС); группа 4 - больные, прошедшие курс комплексной терапии (инфузионная, антиседативные препараты, витамины, ноотропы, гепатопротекторы); контроль - группа клинически здоровых людей.

Выводы