Протонофорные и антиоксидантные свойства новых органических гетероциклических соединений

Размещено на http://www.allbest.ru/

• Раздел 1. Аналитический обзор
• 1.1 Электронпереносящая цепь
• Дыхательную цепь в упрощенном виде можно представить в виде четырех относительно независимых комплексовУ 1-НАДНУ убихинон-оксидоредуктаза, 2 - сукцинат У убихинон-оксидоредуктаза; 3 - убихинолУ цитохром с-оксидоредуктаза; 4 - цитохром с У О₂-оксидоредуктаза, объединяемых функционально чрезвычайно липофильным убихиноном и весьма гидрофильным цитохромом с. Перенос электронов от субстратов цикла трикарбоновых кислот к кислороду, сопровождающийся образованием воды, осуществляется сложной полиферментной системой, локализованной во внутренней мембране митохондрий.

Митохондриальный НАД в основном сосредоточен в жидкости матрикса, где он служит связующим звеном между окисляемыми субстратами и электронпереносящей цепью. Прохождение образующегося в цитоплазме НАДН через внутреннюю мембрану митохондрий печени практически невозможно. Повторное окисление НАДН совершается по челночному механизму.

Повторное окисление НАДН совершается по челночному механизмуУ какое-то вещество может восстанавливаться цитоплазматическим НАДН и образовавшаяся восстановленная форма этого вещества может пересекать митохондриальные мембраны, окисляться там ферментом, связанным с электронпереносящей цепью, и затем возвращаться в цитоплазму для повторения всего процесса. Многочисленные данные указывают на то, что в клетках печени действует малат-аспартатный челночный механизм, совершающий в конечном итоге перенос восстановительных эквивалентов от НАДН цитоплазмы к НАД⁺ в митохондрии. Действие такого челнока становится возможным благодаря присутствию малатдегидрогеназы и глутамат-аспартатаминотрансферазы как в цитозоле, так и в митохондриях, а также двух антипереносчиков - одного для глутамата и аспартата.

1.2 Окислительное фосфорилирование

Важнейшее значение процессов окисления углеводов и жирных кислот состоит в том, чтобы сделать доступной для клеток выделяющуюся свободную энергию окисления путем ее преобразования в форму, физиологически пригодную для использования в клеточных эндергонических процессах, а именно в форму АТФ. Окисление молекулы HАДН одним атомом кислорода в митохондриях сопряжено с чистым выходом трех молекул АТФ, т.е. отношение Ф/о или Ф/2е^- равно трем. Установлено, что одна молекула АТФ образуется во время передвижения пары электронов от НАДН к убихинону, вторая- когда восстановленный убихинон восстанавливает феррицитохром с, и третья - во время окисления феррицитохрома с посредством О₂.

Многие различающиеся по химическим свойствам реагенты разобщают фосфорилирование и митохондриальный транспорт электронов, который в таком случае протекает с максимальной скоростью, но не сопровождается

Рис. 2. Общая схема окислительного фосфорилирования посредством протондвижущего механизма.

образованием АТФ. Дыхание митохондрий животного или растения осуществляется с максимальной скоростью только в том случае, когда сопрягающий механизм нарушен и синтез АТФ ослаблен или полностью прекращен.

При соответствующей физической организации компонентов внутренней митохондриальной мембраны клетки используют движение протонов в направлении электрохимического градиента (вниз по градиенту) для того, чтобы совершать такую работу, как синтез АТФ или передвижение других растворенных веществ против их концентрационных градиентов без образования ковалентно связанных с окислительно-восстановительными парами мембраны промежуточных высокоэнергетических соединений. Для осуществления окислительного фосфорилирования в системе должны происходить процессы, схематически показанные на рисунке.

Полагают, что белки переносящей электроны цепи расположены в мембране таким образом, чтобы система работала в одном каком-то направлении (векторно); это означает, что в качестве неотъемлемой части процесса восстановления и последующего окисления последовательных электронных переносчиков протоны без сопровождающих анионов выталкиваются с наружной стороны мембраны, т.е. в межмембранное пространство. В результате может произойти как понижение рН в жидкости межмембранного пространства, так и возникновение электрического потенциала ДШ на мембране; причем внутренняя сторона ее заряжается отрицательно. Возвращение протонов в обратном направлении через мембрану осуществляется через тот мембранный белок к которому присоединен F₁-АТФ-синтетаза (обратимая АТФ-аза) с активным центром на внутренней матриксной стороне. Направление и силу этому потоку протонов придают как отрицательный заряд на внутренней, матриксной стороне мембраны, так и разность концентраций протонов (ДрН) на обеих сторонах мембраны. Именно этот поток протонов - двигательная сила реакции

АДФ³⁺+Р^-_і>АТФ^4-+Н₂О

Мембрана митохондрий также содержит F₀-гидрофобную структуру, состоящую, по крайней мере, из четырех полипептидных цепей. Встраивание F₀ в липиды мембраны объясняется его гидрофобной природой. Считается, что F₁ специфически прикреплен к F₀. Удаление F₁ из мембраны делает F₀ ''проницаемым'' для внешних протонов. Очевидно, простирающийся через толщу мембраны F₀ и представляет собой тот канал, через который протоны переходят к активному центру АТР-синтетазы.

1.3 Разобщители

Механизм действия многих классических разобщителей окислительного фосфорилирования может быть объяснен с позиций протондвижущей гипотезы. В присутствии разобщителей синтез АТР не происходит, тогда как скорость окисления субстрата и потребления кислорода максимальны. Разобщители могут мигрировать через липидную фазу мембраны как в ионизированной, так и в неионизированной форме. При этом они замыкают протонный ток, переправляя протоны непосредственно через липидную фазу мембраны. Пример таких соединений - динитрофенол:

Эти соединения представляют собой липофильные слабые кислоты, которые могут мигрировать через липидную фазу мембраны как в ионизированной, так и в неионизированной форме. При этом они замыкают протонный ток, переправляя протоны непосредственно через липидную фазу мембраны.

Существуют также истинные ингибиторы окислительного фосфорилирования, из числа которых особенно примечательны ДЦКД иантибиотик олигомицин. ДЦКД реагирует с F₀, блокируя перемещение протонов через мембрану. Олигомицин каким-то подобным образом реагирует с "ножкой", связывающей F₁ с мембраной, так что становится невозможным как синтез АТР, так и перемещение протонов. Торможение потока протонов сопровождается таким сдвигом равновесия реакций между протонсекретирующими компонентами электропереносящей цепи, в условиях которого вообще не могут осуществляться ни синтез АТР, ни движение потока электронов (дыхание).

1.4 Свободнорадикальное окисление липидов

Около 90 % потребляемого человеком молекулярного кислорода вовлекается в реакции окислительного фосфорилирования, вместе с тем, во всех живых организмах протекают процессы с образованием активированных кислородных метаболитов (АКМ): O₂? , ¹O_2, H₂O₂, HO·, OCl?, RO₂ и др., многие из которых являются свободными радикалами, т.е. имеют неспаренный электрон. Применительно к биологическим системам понятия "свободные радикалы" и "АКМ" не совпадают - неспаренный электрон может быть локализован, кроме кислорода, на атомах углерода, серы, азота; для живых организмов важное значение имеют тиильные радикалы глутатиона или радикалы мочевой кислоты с локализацией электрона на атомах S и N. С другой стороны, такие кислородсодержащие молекулы, как перекись водорода, синглетный кислород, гипогалогениты не являются радикалами, хотя и взаимодействуют с органическими молекулами через радикальные механизмы [1]. В настоящее время отмечается возросший интерес к АКМ со стороны биохимиков и биофизиков, физиологов, патофизиологов, иммунологов. Опубликовано большое количество обзорных и экспериментальных работ, в которых подробно рассмотрены химические свойства кислорода и его органических производных; роль АКМ в поражении тканей, органов, клеток и молекул; в потенцировании повреждающего действия ксенобиотиков; поражении, вызванном ишемией-реперфузией; в реализации функций фагоцитов и лимфоцитов; при воспалительных процессах; бактериальных и вирусных инфекциях; онтогенезе и клеточной пролиферации; канцерогенезе; старении и возрастных патологиях; а также при множестве других состояний организма и действии различных факторов. При этом следует отметить, что если до середины 90-х годов прошлого века АКМ рассматривались преимущественно как цитотоксические деструктивные молекулы, то в течение последнего десятилетия отношение к ним изменилось, им стала отводиться роль регуляторных соединений [14, 15], например, в индукции апоптоза [16, 17], регуляции клеточной энергетики [18] и пролиферации [19], а также в регуляции тонуса сосудов, микроциркуляции и коагуляции [20]. Во многих организмах, начиная от бактерий и заканчивая человеком, показано участие АКМ в регуляции экспрессии больших групп генов [15,21].

Молекулярных кислород в основном состоянии - бирадикал с двумя неспаренными электронами с параллельными спинами, расположенными на разрыхляющих молекулярных р*-орбиталях, что делает его относительно инертной молекулой. Молекулярный кислород активно взаимодействует с органическими радикалами, имеющими неспаренный электрон, при этом константа скорости присоединения О₂ к радикалам слабо зависит от природы окисляемого субстрата и определяется преимущественно диффузией, приближаясь к 10⁹ М^-1·с^-1. Высокая агрессивность молекулярного кислорода в отношении органических радикалов лежит в основе развития цепных процессов свободнорадикального окисления [22]. Этому процессу подвержены практически все биополимерные молекулы живой клетки, но особенно он развит в мембранных структурах, принимая во внимание их максимальную распространенность и доступность для кислорода, который легко диффундирует в мембранный липидный бислой.

На сегодняшний день все физико-химические аспекты развития процессов свободнорадикального перекисного окисления липидов (ПОЛ) биологических мембран изучены достаточно хорошо. ПОЛ - вырожденно-разветвленный цепной процесс, условно разделенный на стадии: зарождение цепей, развитие цепных реакций и их разветвление, обрыв цепей. Регуляция процесса возможна на всех его стадиях - при инициировании это достигается применением ловушек свободных радикалов (фенольные антиоксиданты, токоферолы, и пр.); при разветвлении - устранением высокоактивных и часто токсичных промежуточных продуктов с помощью как низкомолекулярных антиоксидантных компонентов (например, глутатион, аскорбиновая кислота,

Схема 1. Характерные реакции, протекающие при окислении углеводородов ( RH) в присутствии кислорода и ингибитора (InH)

ионы металлов переменной валентности в определенных концентрациях или их связывающие соединения и пр.), так и различные антиоксидантные ферменты (СОД, глутатионпероксидаза, каталаза и пр.). Наконец, обрыв цепи возможен с помощью дисмутации радикалов или их замены на менее реакционноспособные радикалы ингибиторов. В настоящее время описано множество природных антиоксидантов с известными свойствами, как правило, являющихся ловушками свободных радикалов.

1.5 Исследование антиоксидантной активности новых гетероциклических соединений

Учитывая важность ПОЛ как в возникновении и развитии различных патологических состояний, так и в регуляции нормальных процессов жизнедеятельности организма на всех его уровнях, не утрачен интерес к разработке новых препаратов, способных тем или иным способом оказывать направленное действие на протекание ПОЛ в клетке. К новым препаратам, активным в отношении ПОЛ, прежде всего, обычно предъявляется требование ингибировать развитие реакций этого процесса в качестве ловушек свободных радикалов кислорода. Однако, в связи с многовекторностью действия различных антиоксидантных систем, можно определить ряд потенциально полезных мембранопротекторных свойств даже для нецеленаправленно получаемых новых веществ. К ним относится, во-первых, гидрофобность молекулы вещества, то есть способность его легко проникать сквозь мембрану, что позволит соединению, как минимум проникнуть в липидный бислой, а при определенных свойствах нового вещества и стабилизировать его (так называемый структурный антиоксидант). Во-вторых, наличие фенольных структур в его составе может придать соединению свойства фенольного антиоксиданта, который обладает прямой антирадикальной активностью. В-третьих, при определенных условиях гетероциклические соединения с различными функциональными заместителями могут служить переносчиками электронов, что особенно важно при функционировании дыхательных цепей внутриклеточных мембран (митохондриальной, микросомальной и т.д.) как для регуляции, так и для нормализации их работы при утрате нормальной концентрации естественных акцепторов свободных электронов. И наконец, синтетические органические вещества, имеющие в своем составе эссенциальные микроэлементы, вероятно, при определенных условиях могут выступать в качестве транспортных форм для этих элементов, прежде всего -для Se, необходимого для функционирования одного из ключевых антиоксидатных ферментов -глутатионпероксидазы, особенно с учетом их гидрофобных свойств и низких эффективных концентраций. Однако, все эти предположения, безусловно, требуют экспериментального подтверждения.

На первом этапе наших исследований были изучены антиоксидантные свойства 18 новых гетероциклических соединений. Целью этого этапа было выделение из общего количества исследуемых гетероциклических веществ соединений с максимальными антиоксидантными свойствами.

На данном этапе ставилась задача выявления антиоксидантной активности, проявляющейся в снижении образования продуктов ПОЛ (малонового альдегида) в модельной системе с лецитином яичного желтка, который служил элементарным субстратом для процессов ПОЛ. Измерения проводились с помощью общепризнанного унифицированного метода, как описано в [23]. Лецитин является самым распространенным компонентом биологических мембран, однако в данной постановке опыта, он, естественно, не включен в липидный бислой, а находится в растворе. Таким образом, оценивались антиоксидантные свойства препаратов, связанные с их непосредственной способностью инактивировать свободнорадикальные формы кислорода в среде с субстратами липопереокисления. Кроме того, метод позволял определить концентрацию изучаемых веществ, вызывающую 50%-ое ингибирование ПОЛ в модельной системе по сравнению с классическим синтетическим антиоксидантом ионолом, IC₅₀ [24].

2. Методы исследования

2.1 Полярографический метод исследование скорости дыхания и фосфорилирования митохондрий печени крыс

2.1.1 Подготовка полярографической установки к работе

За 15-20 мин до начала работы необходимо включить ультратермостат полярографической установки, налить в коническую колбу реакционную среду и поставить ее в термостат. С помощью аквариумного компрессора через среду продувать в течение 10-15 мин. воздух для ее насыщения кислородом. Для подготовки к работе установки включить УПТ, самописец и магнитную мешалку. Прогреть 10 мин. Ручку ''чувствительность'' установить в крайнее левое положение и ручкой ''смещение'' на УПТ установить перо самописца в крайнее правое положение. В ячейку доверху налить реакционную среду, опустить остеклованную магнитную мешалочку, вставить кислородный электрод и включить вращение мешалки. Ручкой ''чувствительность'' установить перо самописца в левое положение, за 10-15 мм до края разметки диаграммной ленты. Выключить мешалку и убедиться, что перо смещается при этом вправо на 20-50 мм (в зависимости от толщины мембраны на электроде). Установить скорость движения диаграммной ленты- 1800 мм/час. Установка готова к работе.

2.1.2 Определение интенсивности дыхания и его сопряжения с окислительным фосфорилированием

Необходимо выделить митохондрии из печени крысы. Промыть ячейку полярографа и заправить ее реакционной средой из конической колбы, стоящей в термостате. Опустить магнитную мешалочку и вставить электрод. Выступившие излишки среды удалить фильтровальной бумагой. Включить магнитную мешалку, движение диаграммной ленты и ручкой ''чувствительность'' скорректировать положение пера самописца - за 10-15 мм до левого края разметки диаграммной ленты.

Затем необходимо записать два типа кривых, каждый из которых прописывается несколько раз. Для этого в среду последовательно делаются добавки У

Кривая 1

Сукцинат или -20 мкл, С_к=6мМ

Митохондрии -50 мкл,

АДФ -20 мкл , С_к=0,15 мМ

Где С_к-конечная концентрация добавки в ячейке, если принимать объем ячейки равным 2 мл.

По кривой 1 потребления кислорода рассчитывается интенсивность дыхания в метаболических состояниях 3 и 4 (по Чансу), величина дыхательного контроля (ДК) и эффективность фосфорилирования- коэффициент АДФ/0У

V₄=500*l₄/H*белок Мх в ячейке (1)

V₃=500*l₃/H*белок Мх в ячейке (2)

ДК=V₃/V₄ (3)

Примечание У объем ячейки-2 мл, концентрация кислорода в среде 500 мкА (250 мкМ O₂). Величина Н выражена в мм, l- в мм/мин.

2.1.3 Выделение митохондрий печени крысы

Для выделения митохондрий необходимо декапитировать крысу, быстро вырезать печень и положить ее на 3 мин. на сахарозный лед для охлаждения. Затем осушить печень фильтровальной бумагой, взвесить 3-4 г и продавить через пресс. Первоначально измельченную ткань гомогенизировать в 12 мл среды выделения (СВ) 40 с. при 1 тыс. об. мин. ,затем добавить еще 13 мл СВ и гомогенизировать 20 с. при 1 тыс. об./мин.

Полученный супернатант центрифугируют 10 мин. при 1,8 тыс. об. мин., сливают надосадочную жидкость и центрифугируют ее 15 мин. при 6 тыс. об./ мин. для осаждения фракции митохондрий. После первого центрифугирования в осадок выпадают обрывки клеток, ядра (ядерная фракция, которую необходимо удалить). После второго центрифугирования необходимо слить надосадочную жидкость, оставить осадок и просуспендировать его в 1 мл среды промывания (СП), добавить еще 15-20 мл СП и процентрифугировать 15 мин. при 6 тыс. об. / мин. Затем оставляют осадок и суспендируют его в 0,5 мл СП, таким образом получают исходную суспензию митохондрий печени крыс. Для гомогенизации печени пользуются гомогенизатором Поттера с механическим приводом, состоящим из пробирки с плотно пригнанным пестиком из стекла или тефлона. Гомогенизация - разрушение ткани и плазматической мембраны и получение суспензии отдельных субклеточных органелл. Важен выбор скорости гомогенизации, так как при очень большой скорости разрушается много митохондрий, а при малой - происходит неполное разрушение клеток и малый выход митохондрий. Дифференциальное центрифугирование применяется для последовательного удаления из гомогената различных популяций частиц путем их осаждения в центробежном поле. При постоянном центробежном ускорении скорость седиментации частиц прямо пропорциональна объему частицы и разности между значениями плотности частицы и среды. В то же время она обратно пропорциональна вязкости среды. Центрифугирование идет при охлаждении до 0-4?С. Отделение фракции митохондрий от надосадочной жидкости должно происходить как можно быстрее, чтобы свести к минимуму время соприкосновения частиц с присутствующими в гомогенате растворимыми ферментами, которые потенциально способны нарушать их целостность. Поэтому важен правильный выбор времени и скорости центрифугирования, чтобы избежать перекрестного загрязнения фракций [4].

2.2 Фотоколориметрическое определение концентрации белка митохондрий по методу Бредфорда

Реактивы:

1.Раствор красителя кумасси G-250.

2. Стандартный раствор белка 0,2-1,0 мг/мл.

В спектрофотометрическую кювету с длиной оптического пути 1 см вносят 0,1 мл раствора белка в 0,1 н NaOH, добавляют 2 мл раствора кумасси, перемешивают при комнатной температуре 2-3 минуты и быстро измеряют оптическую плотность смеси при 595 нм, используя в качестве контроля кювету, содержащую 0,1 мл 0,1 н NaOH и 2 мл красителя [43].

2.3 Концентрации исследуемых веществ

В предварительной скрининговой серии опытов был определен порядок эффективных концентраций исследуемых веществ, после чего проводилось изучение их свойств с применением трех действующих концентраций - 2, 8 и 20 мкМ.

2.4 Определение общей антиоксидантной активности (АОА) гомогенатов печени крыс

Общую антиоксидантную активность (АОА) гомогенатов печени крыс определяли по их способности тормозить накопление ТБК-активных продуктов ПОЛ в суспензии желточных липопротеидов, как описано в [26], и выражали в процентах ингибирования окисления желточных липопротеидов.

3. Результаты и обсуждение

3.1 Исследование антиоксидантных свойств новых гетероциклических соединений

Как видно из данных, представленных в таблице 1, все исследуемые вещества в модельном эксперименте проявили антиоксидантную активность в той или иной мере. Вместе с тем, 50 %-ое ингибирование образования малонового диальдегида в системе с лецитином яичного желтка наблюдалось при разных концентрациях препаратов, которые размещены в таблице в порядке убывания их активности. Максимальную активность, соответствующую величине IC₅₀ ? 2 мкМ проявили 8 веществ, расположенные в начале таблицы - KDA-150, DVD-2521, KDA-132, BO-20, NAA-85, DVD-8843, DVD-2808, DVD-26. Препарат сравнения - традиционно использующийся в качестве искусственного антиоксиданта ионол (2,6-ди-трет-бутил-4-метилфенол), показал несколько бoльшую антиоксидантную активность, чем испытуемые вещества. После определения наиболее перспективных с точки зрения антиоксидантной активности соединений и установления величины их оптимальной концентрации для простой модельной системы, представлялось целесообразным изучить поведение этих веществ в опытах in vitro, включающих более сложный объект _ природные биологические мембраны.

В качестве подобного объекта мы использовали микросомы печени крыс _ выделенные с помощью дифференциального центрифугирования мембраны эндоплазматического ретикулума, поскольку эта структура богата субстратами ПОЛ - моно- и полиненасыщенными жирными кислотами; в ее составе функционируют цепи переноса электронов, что создает условия для образования радикальных форм кислорода; многие ферменты микросом относятся к металлопротеинам, т.е. связаны с металлами переменной валентности, что также играет роль в активации ПОЛ. Использование микросом позволяет в определенной мере стандартизовать условия проведения опыта. Полученные результаты приведены в таблице 2. Постановка эксперимента была общепринятой [25] и заключалась в искусственном индуцировании перекисного окисления липидов мембран микросом с помощью аскорбиновой кислоты и ионов железа (соль Мора). Добавление этих компонентов в реакционную среду способствовало образованию активированных кислородных метаболитов (гидроксильных радикалов, пероксидных радикалов жирных кислот и т.д.). После инкубации в течение 20 минут в пробах спектрофотометрически определялось количество вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида. По уровню его накопления судили об антиоксидантной активности добавляемых в реакционную среду исследуемых веществ. Для сравнения использовали ионол. Контролем служили образцы без активных веществ, но с добавлением растворителя (ДМСО), который сам обладает некоторым антиоксидантным эффектом.

Таблица 1 Зависимость антиоксидантной активности (АОА) синтетических гетероциклических соединений от концентрации (по показателям ингибирования образования МДА в модельной системе с лецитином) n=6

Как видно из приведенных данных, преимущественное большинство соединений, показавших в предыдущем опыте антиоксидантный эффект обнаруживало подобную активность и в более сложной системе. Однако были и исключения. В общем, подобное поведение антиоксидантов не является неожиданным. Известно, что усложнение системы, в которой проводятся испытания антиоксидантных свойств приводит иногда к снижению эффективности препарата [24]. (Именно этим фактом мы руководствовались, применяя в опыте концентрации веществ несколько более высокие, чем полученные для них величины IC₅₀.) Более того, в исключительных случаях может изменяться сама направленность эффекта - с антиоксидантной до прооксидантной. Это связано с синергическим эффектом при взаимодействии нескольких слабых факторов в живом объекте, приводящим к их резкому усилению. Например, в клетке в определенных условиях может значительно возрастать энергия слабых радикальных соединений, их превращение в активаторов ПОЛ, тогда как в норме сами по себе они являются ингибиторами ПОЛ именно из-за своих радикальных свойств и не представляют опасности из-за низкой энергетичности. Это показано, в частности, в опытах с применением витамина Е [1]. Разумеется, в каждом подобном случае причины изменения эффектов одного и того же соединения в разных условиях опыта могут быть совершенно различны, но все они, безусловно, связаны с взаимодействием того или иного соединения с какими-то структурами в изучаемой системе.

Как и в первой серии опытов, соединения KDA-150, DVD-2521, KDA-132, BO-20, NAA-85, DVD-8843, DVD-2808, DVD-26 проявили антиоксидантную активность, причем, в данном случае _ в присутствии микросом. Это говорит о том, что, как минимум, эти вещества могут быть ловушками свободнорадикальных форм кислорода. Следовательно, их можно отнести к истинным антиоксидантам. Остальные вещества не обнаружили антиоксидантного эффекта на микросомах, что, вероятно, можно объяснить следующим образом.

В нашем случае вещество Л-8 (№12) проявило при инкубировании с микросомами отчетливый прооксидантный эффект, т.е. активировало ПОЛ (более чем на 40 %), тогда как в опытах с лецитином это вещество ингибировало липопереокисление, по-видимому, за счет улавливания и инактивации свободнорадикальных форм кислорода. Принимая во внимание структуру данного соединения, можно сделать вывод, что Л-8 действительно может связывать свободнорадикальные формы кислорода. В растворе лецитина это вызывает их инактивацию, поэтому процесс ПОЛ ингибируется, причем с примерно одинаковой эффективностью при разных концентрациях вещества, т.е. лимитирующим фактором, вероятно, является концентрация радикалов в среде. Однако при наличии мембранного липидного бислоя гидрофобная и довольно громоздкая молекула Л-8 проникает вглубь мембраны, задерживаясь там вместе со связанными кислородными радикалами. При встраивании молекулы Л-8 структура мембраны становится более рыхлая, радикалы кислорода получают свободный доступ к ненасыщенным жирным кислотам мембранных фосфолипидов, т.е. к субстратам ПОЛ. Проще говоря, мы считаем, что Л-8 может не только связывать, но и транспортировать радикальные формы кислорода в липидный бислой, встраиваясь в него и механически дестабилизируя его. Однако, для доказательства этого предположения целесообразно было бы сравнить влияние Л-8 на ПОЛ в лецитиновых липосомах. В подобной постановке лецитин находился бы не просто в растворе, а в составе липидного бислоя, состоящего исключительно из молекул лецитина.

Аналогичные выводы можно сделать, анализируя поведения соединения DVD-0749. Следует отметить лишь, что его молекула по величине почти в 2 раза меньше Л-8, но также не является компактной молекулой. Вместе с тем, очень похожее визуально на DVD-0749 соединение DVD-4702 проявляет умеренно антиоксидантные свойства в обоих случаях - и в простой безмембранной системе с субстратом ПОЛ лецитином, и при наличии этого же компонента (наряду с другими) в составе мембран микросом. Очевидно, что структурные отличия являются причиной разного поведения этих соединений, однако на данном этапе исследований не представляется возможным объяснить, каким образом.

Таблица 2 Влияние новых синтетических гетероциклических соединений на индукцию аскорбат-зависимого ПОЛ в микросомах печени крыс X±Sx; n=6

Соединения DVD-3779 и ВО-35 также, как и три вышеописанных, вероятно, являясь ловушками свободнорадикальных форм кислорода, вероятно, могут переносить их в липидный мембранный бислой с разной степенью эффективности и в зависимости от типа этого бислоя.

Отдельно следует сказать о соединениях, которые были растворимы в воде - NAA-23 и NAA-177. Они показали слабую антиоксидантную активность. Причем в случае с NAA-177 она не зависела от концентрации вещества в растворе с лецитином. В системе с микросомами препараты не функционировали как антиоксиданты. Вероятно, это связано с непроницаемостью для них липидного мембранного бислоя за счет их заряженности. Возможно, эти соединения могут проявить себя в другом биологическом качестве, например, они вполне могут действовать как нуклеофилы, участвуя в разобщении процессов дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях. Мы планируем проверить это предположение в следующих опытах.

Таким образом, из 18 исследуемых соединений 8 продемонстрировали выраженные антиоксидантные свойства, их IC₅₀ оказался в области 2 мкМ. При концентрации 10 мкМ эти соединения показывали антиоксидантный эффект не только в модельной системе с субстратом ПОЛ лецитином, но и в среде с микросомами - биологическими липидными бислойными мембранами. Кроме того, возможно проявление и иных биологически свойств этих соединений - способности связываться с липидами мембранного бислоя, выступая в качестве мембранных зондов; влиять на процессы переноса электронов в дыхательных цепях микросом и митохондрий; влиять на активность антиоксидантных ферментов. Однако, все эти предположения требуют отдельных исследований.

3.2 Влияние новых гетероциклических соединений с антиоксидантными свойствами на функциональную активность митохондрий

Исследование функциональных характеристик митохондрий мы проводили по общепринятой методике полярографического определения скорости поглощения кислорода митохондриями в среде, содержащей ионы фосфата неорганического и магния, с использованием добавок различных веществ, тем или иным образом регулирующих работу дыхательной цепи внутренней мембраны митохондрий.

В первой серии опытов в ячейку полярографа добавляли последовательно реакционную: среду (представляющую собой буферную систему на базе раствора сахарозы с добавлением ионов фосфата и магния), митохондрии до конечной концентрации 1 мг белка на 1 мл. В течение 5 минут мы фиксировали скорость потребления кислорода митохондриями и производили следующую добавку - АДФ, которая инициировала процесс фосфорилирования, образования АТФ, митохондриями. В течение 5 минут также фиксировали скорость потребления кислорода митохондриями в процессе сопряжения дыхания с окислительным фосфорилированием. Аналогичные процедуры мы повторяли уже на фоне добавления исследуемого нового вещества в ячейку полярографа.

Из результатов, представленных в таблице 1, видно, что скорость дыхания митохондрий при данной постановке опыта без применения новых веществ довольно велика и равна 63 мкмоль кислорода на 1 мг белка за 1 мин в положении V₃ и 19,5 - в положении V₄ по Чансу, коэффициент дыхательного контроля равен 3,3.

Учитывая биоэнергетический смысл показателей таблицы 1 можно сделать определенные выводы о влиянии изучаемых веществ на состояние внутренней мембраны миохондрий и сопряженность процессов дыхания и окислительного фосфорилирования. Скорость дыхания митохондрий в положении V₄ по Чансу (нефосфорилирующие митохондрии, в среду добавлен только субстрат, в данном случае - сукцинат) свидетельствует о структурном состоянии внутренней мембраны митохондрий, прежде всего о ее целостности.

Принято считать, что чем более прочна мембрана, тем меньше протонов может приникать через ее поврежденные участки в межмембранное пространство и тем ниже будет показатель скорости дыхания V₄.

Влияние низкоинтенсивного лазерного излучения на скорость дыхания митохондрий печени крыс, субстрат - сукцинат

Скорость дыхания митохондрий в положении V₃ по Чансу свидетельствует о скорости дыхания фосфорилирующих митохондрий. В среде, наряду с субстратом, присутствует АДФ, которая при сопряжении процессов дыхания с работой АТФ-синтазы превращается в АТФ. Снижение этого показателя может говорить о блокировании работы АТФ-синтазы. Это может достигаться несколькими способами.

Во-первых, в среде может появляться протонофор, переносящий протоны из межмембранного пространства в матрикс митохондрии непосредственно через мембрану, мимо F₀-субъединицы АТФ-синтазы. Этим самым мембрана лишается электрохимического градиента, энергия которого и используется АТФ-синтазой для синтеза АТФ.

Во-вторых, АТФ-синтаза может непосредственно ингибироваться каким-либо веществом, попавшим в среду.

Некоторые из нами изучаемых новых веществ показывали определенные эффекты, приводящие к изменению биоэнергетических показателей митохондрий печени крыс. Так, увеличивали скорость дыхания фосфорилирующих митохондрий следующие препараты: DVD-8843, NAA-85, NAA-23, Л-15. Приведены препараты в порядке снижения эффекта.

Показателем эффективности фосфорилирования и степени сопряженности дыхания и фосфорилирования является коэффициент дыхательного контроля (ДК). По этой величине названные препараты расположились следующим образом: NAA-23, DVD-8843, NAA-85, NAA-84, Л-15. Очередность несколько поменялась, поскольку внес вклад показатель V₄., свидетельствующий о целостности мембраны.

Вещества ВО-20, DVD-2802, DVD-2521 оказывают резко негативный эффект на процессы образования энергии в митохондриях, разобщая дыхание и фосфорилирование. При этом DVD-2521 и DVD-2802, возможно, являются ингибитором АТФ-синтазы.

Остальные вещества практически не влияли на ход биоэнергетических процессов в митохондриях.

Учитывая наличие антиоксидантных свойств у изучаемых веществ и их способность влиять на ход процессов образования АТФ в митохондриях, можно сделать следующие выводы:

1. В качестве протонофоров можно применять новые гетероциклические соединения DVD-8843, NAA-85, Л-15. Данные соединения также являются антиоксидантами средней активности (сравнимыми с активностью ионола).

2. DVD-2521 и DVD-2802, возможно, являются истинными разобщителями, т.е. ингибиторами АТФ-синтазы.

дыхательный окисление антиоксидантный гетероциклический

Список используемой литературы

1. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б.Меньщикова, В.З.Ланкин, Н.К.Зенков, И.А.Бондарь, Н.Ф.Круговых, В.А.Труфакин. - М.:Фирма "Слово", 2006. - 556 с.

2. Green M. J., Hill H.A.O. Chemistry of dioxygen // Mehtods of Enzymology. - Vol.105. - N.Y.: Acad.Press, 1984. P.3-22.

3. Bast A., Haenen G.R.M.M., Doelman C.J.A. Oxidants and antioxidants: State of the art // Am.J.Med. - 1991. - Vol.91, Suppl. 3C. - P. 2S-13S.

4. Sinha B.K., Mimnough E.G. Free radicals and anticancer drug resistance oxygen free radicals in the mechanisms of drug cytotoxicity and resistance by certain tumours // Free Radic. Biol. Med. - 1990. - Vol.8. - P. 567-581.

5. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. - М.: Медицина, 1989. - 356 с.

6. Moncada S., Palmer R.M.J.,Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology // Pharmacol. Rev. - 1991. - Vol. 43. - P. 109-142.

7. Harris M.L., Schiller H.J., Reilly P.M.P. et al. Free radicals and other reactive oxygen metabolites in inflammatory bowel disease: Cause, consequence or epiphenomenon // Pharmacol. Ther. - 1992. - Vol.53. - P.375-408.

8. Маеда Х., Акаике Т. Оксид азота и кислородные радикалы при инфекции, воспалении и раке // Биохимия. - 1998. - Т.63, вып.7. - С.1007-1019.

9. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. Новосибирск: Наука, 1989. 344 с.

10. Cornwell D.G., Morisaki N. Fatty acid paradoxes in the control of cell proliferation: Prostaglandins, lipid peroxides, and cooxidation reactions // Free Radicals in Biology. - Vol.6. - 1984. - P.96-149.

11. Сидорик Е.П.,Баглей Е.А., Данко М.И. Биохемилюминесценция клеток при опухолевом процессе. - Киев: Наукова думка, 1989. - 218 с.

12. Weitzman S.A., Gordon L.I. Inflammation and cancer ; Role of phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis // Blood. - 1990. Vol.76. - P.655-663.

13. Harman D. Free radical theory of aging // Mutat. Res. - 1992. - Vol. 275. P.257-266.

14. Landar A., Darley-Usmar V.M. Nitric oxide and cell signaling; modulation of redox tone and protein modification // Amino Acids. - 2003. - Vol.25. - P.313-321.

15. Poli G., Leonarduzzi G., Chiarpotto E. Oxidative stress and cell signaling // Current Med. Chem. - 2004. - Vol. 11. - P.1163-1182.

16. Скулачев В.П. Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода // Сорос. образоват. журн. - 2001. - №6. - С.910-912.

17. Simon H.-U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation // Immunol. Rev. - 2003. Vol.193. - P.101-110.

18. Brookes P.S. Yoom Y., Robotham J.L. et al. Calcium, ATP, and ROS; a mitochondrial love-hate triangle // Am. J. Physiol. Cell . - 2004. - Vol.287. - P.817-833.

19. Boonstra J.,Post J.A. Molecular events associated with reactive oxygen species and cell cycle progression in mammalian cells // Gene. 2004. Vol.337. P.1-13.

20. Gregg D., de Carvalho D.D. Kovacic H. Integrins and coagulation: a role for the ROS/redox signaling? // Antioxid. Redox. Signal. - 2004. - Vol. 6. - P.757-764.

21. Esposito F., Ammendola R., Faraonio R. et al. Redox control of signal transduction, gene expression and cellular senescence // Neurochem. Res. 2004. - Vol.29. - P.617-628.

22. Владимиров Ю.А., Азизова О.А., Деев А.И. и др. Свободные радикаля в живых системах // ВИНИТИ, Итоги науки и техники. Сер. Биофизика. 1991. - Т.29. - С.1-249.

23. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкин Ю.О., Комаров О.С., Владимиров Ю.А. Оценка антиоксидантной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов// Лабораторное дело. - 1988. - №5. - С.59-62.

24. Фенольные биоантиоксиданты / Н.К.Зенков, Н.В.Кандалинцева, В.З.Ланкин, Е.Б.Меньщикова и др.. - Новосибирск: СО РАМН, 2003. - 328 с.

25. Лемешко В.В. Система микросомального окисления при развитии старения организма // Биохимия - 1980. - Т.45, №11. - с.1964-1969.

26. Клебанов Г.И., Бабенкова И.В., Теселкин Ю.О. и др. Оценка антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов.// Лабораторное дело. - 1988 - № 5. - С.59 - 62.

Размещено на Allbest.ru