Связь полиморфных маркеров 3111тс и 843тс гена clock с риском развития эссенциальной артериальной гипертензии

Размещено на http://www.allbest.ru/

5

Размещено на http://www.allbest.ru/

Связь полиморфных маркеров 3111тс и 843тс гена clock с риском развития эссенциальной артериальной гипертензии

ВВЕДЕНИЕ

Сердечно-сосудистые патологии относятся к полигенным заболеваниям со сложным формированием фенотипа. В настоящее время отобрано около 50 генов-кандидатов, которые имеют полиморфные сайты и вносят вклад в кардиоваскулярные расстройства. Например, к ним относятся гены ренин-ангиотензиновой системы (ангиотензиногена, ангиотензиноген-превращающего фермента и других), аполипопротеина Е, эндотелиальной NO-синтазы, матриксной металлопротеиназы-3. Однако в качестве генов-кандидатов, играющих роль в развитии сердечно-сосудистых заболеваний ранее не рассматривались циркадные гены. Тем не менее, известно, что практически все физиологические процессы организма, в том числе сердечный ритм, артериальное давление и многие показатели, участвующие в процессах тромбообразования и тромболизиса подвержены суточным колебаниям. [Andrews et al., 1996; Otto et al., 2004]. Обострение сердечно-сосудистых заболеваний, как правило, наблюдается в определенные часы. Например, время начала инфаркта миокарда у людей чаще приходится на период с 6:00 до 12:00, реже - с 3:00 до 6:00 [Cohen et al., 1997]. Это связано с активацией сердечно-сосудистой системы перед пробуждением, в регуляции которой участвуют гены циркадных ритмов.

Суточная периодичность физиологических показателей и процессов сердечно-сосудистой системы обусловлена циркадными изменениями экспрессии многих генов, участвующих в поддержании структурной целостности сосудов и их метаболизма [Rudic et al., 2005]. Суточные колебания экспрессии этих генов регулируются генами циркадных ритмов. Поэтому следует ожидать, что мутации в циркадных генах могут вносить определенный вклад в развитие кардиоваскулярных патологий. На данный момент имеются немногочисленные литературные данные, подтверждающие это предположение. Например, на мышах показано, что мутация гена Clock вызывает патологическое ремоделирование и повреждение сосудов, а нокаут гена Bmal1 приводит к накоплению коллагена в сосудах, повышению чувствительности к тромбозу и дисфункции эндотелия (реактивному ответу на действие вазорелаксантов) [Anea et al., 2009]. Однако роль циркадных генов в развитии сердечно-сосудистых патологий практически не изучена. Также пока не ясны и механизмы, через которые они влияют на формирование этих заболеваний.

Ген CLOCK, кодирующий позитивный транскрипционный фактор CLOCK, относится к числу основных генов циркадных ритмов. Белок CLOCK вместе с обязательным партнёром BMAL1, продуктом гена BMAL1, образует трансактивационный димер, действующий на промотор управляемых генов [von Schantz, 2008].

Ген CLOCK содержит множество полиморфных сайтов, как в транслируемой, так и в нетранслируемой области. Большое число работ посвящено изучению роли полиморфизма 3111ТС 3'-нетранслируемой области (3'-НТО) гена CLOCK. Экспериментально доказана его связь с риском ожирения [Monteleone P. et al., 2008], психическими заболеваниями [Benedetti et al., 2008; Voinescu et al., 2009], бессонницей [Serretti et al., 2003; Benedetti et al., 2007] и предпочтением к тому или иному режиму сна-бодрствования [Katzenberg et al., 1998; Mishima et al., 2005; Friedman et al., 2009]. Функциональная роль этого полиморфизма до сих пор не изучена. Вероятно, он также может влиять и на развитие сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ). В нашей работе мы исследуем влияние этого полиморфизма, а также полиморфизма в транслируемой части гена CLOCK (однонуклеотидная замена в 9 экзоне) на развитие кардиоваскулярных расстройств.

По данным Росстата, в структуре смертности по Республике Карелия в 2009 году 57 процентов составили заболевания сердечно - сосудистой системы. Заболеваемость артериальной гипертонией по Карелии существенно выше, чем в среднем по России.

Карелия является регионом с неблагоприятным световым режимом и высокой смертностью от ССЗ, поэтому изучение влияния генов циркадного ритма на развитие кардиоваскулярных расстройств у жителей этого региона представляется нам особенно актуальным.

Цель настоящей работы - изучение роли полиморфизма 3111ТС 3'-нетранслируемой области гена CLOCK и полиморфизма 843ТС в экзоне 9 гена CLOCK в развитии эссенциальной артериальной гипертензии (ЭАГ) и ишемической болезни сердца (ИБС) у жителей Республики Карелия.

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

полиморфный маркер артериальный гипертензия

В работе использованы образцы крови 261 донора без клинических проявлений и диагнозов ЭАГ и ИБС (контрольная группа), 233 образца крови больных с диагнозом ЭАГ и 226 образцов крови больных с диагнозом ИБС. Диагнозы ЭАГ и ИБС устанавливали в соответствии и с учётом клинических рекомендаций ВНОК. Средний возраст пациентов с диагнозом ЭАГ составлял 59,4±14,1 лет, с диагнозом ИБС - 61,8±13,6 года. Средний возраст людей из контрольной группы составлял 55,0±17,4 года. ДНК выделяли из 200 мкл венозной крови пациентов с помощью набора для выделения геномной ДНК AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit («Axygen», США) согласно инструкциям производителя.

Участок гена СLOCK, содержащий маркер 3111ТC, амплифицировали методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) со следующими праймерами: прямой 5'-tccagcagtttcatgagatgc-3', обратный 5'-gaggtcatttcatagctgagc-3' («Синтол», Россия) [Desan et al., 2000]. Смесь для амплификации содержала по 10 пМ каждого из праймеров, 2мкл 10ЧПЦР буфера, 1 мМ каждого dNTP и 0.5 ед. Taq-полимеразы («Силекс», Россия). ПЦР проводили на приборе Robocycler («Stratagene», США) по программе: 3 мин денатурация при 94°С, а затем 35 повторяющихся циклов в режиме: 94°С - 1 мин, 59°С -1 мин, 72°С - 1мин. Полученный ПЦР продукт (220 п.н.) подвергали обработке рестриктазой MhlI («Сибэнзим», Россия) для идентификации аллелей T (220 п.н.) и C (125 и 95 п.н.) (рис. 1). Условия проведения ПЦР и рестрикции описаны ранее [Desan et al., 2000].

Участок гена СLOCK, содержащий маркер 843ТС, амплифицировали со следующими праймерами: прямой 5'- atttatcaggctttcaaggtca-3', обратный 5'-atgggagtccaggatttatt-3' («Синтол», Россия). Праймеры сконструированы с помощью программы Primer Premier 5. Смесь для амплификации содержала по 10 пМ каждого из праймеров, 2мкл 10ЧПЦР буфера, 1 мМ каждого dNTP и 0.5 ед. Taq-полимеразы («Силекс», Россия). ПЦР проводили на приборе Robocycler («Stratagene», США) по программе: 3 мин денатурация при 94°С, а затем 35 повторяющихся циклов в режиме: 94°С - 1 мин, 62°С -1 мин, 72°С - 1мин. Полученный ПЦР продукт (575 п.н.) подвергали обработке рестриктазой RsaI («Сибэнзим», Россия) для идентификации аллелей T (427 и 156 п.н.) и C (295, 132 и 156 п.н.) (рис. 2).

Продукты рестрикции разделяли в 6%-ном полиакриламидном геле, окрашенном бромистым этидием, и визуализировали с помощью системы Kodak EDAS 290 («Kodak», США). Статистический анализ данных осуществляли с помощью пакета программ MS Excel. Достоверность различий частот аллелей и генотипов в группах оценивали с помощью критерия ч². Достоверным считали уровень значимости p < 0.05. Для оценки риска заболевания рассчитывали соотношение шансов OR.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Впервые получены результаты по частоте однонуклеотидного полиморфизма 3'-нетранслируемой области гена CLOCK у жителей Республики Карелия. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера 3111ТС гена CLOCK у жителей Республики Карелия близко к распределению, характерному для европейского населения [Robilliard et al., 2002]

В настоящей работе обнаружены достоверные различия в распределении частот генотипов полиморфного маркера 3111ТС гена CLOCK в группах больных эссенциальной артериальной гипертензией, ишемической болезнью сердца и контрольной группе (табл. 1, 2). У пациентов с диагнозами ЭАГ и ИБС значительно ниже частота генотипа ТТ и выше частота генотипа ТС. Встречаемость генотипа СС во всех группах практически одинаковая. Однако анализ распределения полиморфного маркера 3111ТС гена CLOCK в зависимости от пола показал, что среди мужчин, страдающих ЭАГ и ИБС, достоверно больше носителей генотипа СС, чем среди мужчин контрольной группы. У женщин, напротив, частота генотипа СС оказалась значительно выше в контрольной группе, чем в группе больных ЭАГ и ИБС.

Таким образом, нами обнаружена взаимосвязь между развитием ЭАГ и ИБС и полиморфным маркером 3111ТС 3'-НТО гена CLOCK у населения Карелии. У мужчин, имеющих генотип СС, достоверно повышен риск возникновения ЭАГ (OR=1,49) и ИБС (OR=1,57). В группе женщин, страдающих данными сердечно-сосудистыми заболеваниями, частота этого генотипа напротив, значительно ниже, чем в контрольной группе.

Подобные результаты были получены в исследовании по изучению взаимосвязи аффективного расстройства и полиморфизма 3111ТС гена CLOCK [Bailer et al., 2005]. При сравнении частот и генотипов у мужчин и женщин, страдающих аффективным расстройством, авторами выявлена тенденция повышения частоты встречаемости аллеля С и генотипа СС у больных мужчин.

Для ряда генов, участвующих в развитии CCЗ, показано, что патологический аллель может проявляться либо у мужчин, либо у женщин. Например, наличие в генотипе аллеля 4 гена аполипопротеина Е может способствовать развитию гиперлипопротеинемии и атеросклероза, причем у женщин в большей степени, чем у мужчин [Heng et al., 1995].

Роль 3111ТС 3'-НТО полиморфного маркера гена CLOCK в развитии кардиоваскулярных расстройств до сих пор не изучена. Более вероятным результатом изменения нуклеотидной последовательности в регуляторной части гена представляется не нарушение структуры и функций кодируемых белков, а изменение уровня транскрипции и трансляции мРНК. Это предположение можно подтвердить данными по влиянию изменения структуры 3'-НТО некоторых генов на уровень их экспрессии [Tiret et al., 2005], на стабильность мРНК [Woo et al., 2009]. В экспериментах на линейных мышах показано, что стабильность мРНК циркадных генов Per2 и Per3 зависит от наличия в 3'-НТО гена сайтов взаимодействия с РНК-связывающим белком PTB, который регулирует деградацию данной мРНК [Woo et al., 2009]. Также имеются данные о том, что регуляторные элементы 3'-НТО играют важную роль в локализации мРНК и посттрансляционных изменениях, например, при синтезе селенопротеина [Hesketh, 2004].

В настоящей работе впервые получены результаты по частоте однонуклеотидного полиморфизма 843ТС в экзоне 9 гена CLOCK у жителей Республики Карелия. В группах больных эссенциальной артериальной гипертензией, ишемической болезнью сердца и контрольной группе обнаружены достоверные различия в распределении частот генотипов полиморфного маркера 843ТС гена CLOCK при практически равных частотах аллелей (табл. 3, 4). У людей контрольной группы значительно выше частота гетерозигот, в то время как в группах пациентов с диагнозами ЭАГ и ИБС повышена встречаемость генотипов ТТ и СС.

Анализ распределения полиморфного маркера 843ТС гена CLOCK в зависимости от пола показал, что среди мужчин контрольной группы частота встречаемости генотипа ТС достоверно выше, чем в группах мужчин, страдающих ЭАГ и ИБС. У мужчин, имеющих генотип СС, достоверно повышен риск возникновения ЭАГ (OR=2,26) и ИБС (OR=2,17). У женщин с диагнозами ЭАГ и ИБС частота генотипа ТТ оказалась почти в 2,5 раза выше, чем у женщин контрольной группы. Однако эти различия оказались не достоверными по критерию ч².

Однонуклеотидная замена тимина на цитозин в положении 843 гена CLOCK представляет собой миссенс-мутацию, которая обусловливает замену аминокислоты в определенном месте цепи полипептида. Миссенс-мутации, как известно, часто приводят к изменению физиологической роли белка [Северин, 2003]. Можно предполагать, что возможное изменение функционирования белка CLOCK вследствие замены аминокислоты может привести к нарушению механизмов циркадной регуляции, которой подвержены многие физиологические показатели и процессы сердечно-сосудистой системы. Важно отметить, что белок CLOCK является одним из основных регуляторов циркадной периодичности, он представляет собой транскрипционный фактор, а также обладает активностью ацетилтрансферазы гистонов [Doi et al., 2006]. Регулирование на уровне хроматина является важным механизмом в изменении генной экспрессии сердечной ткани, эти процессы лежат в основе роста, восстановления и ремоделирования [Backs, Olson, 2006].

В нашем исследовании мы обнаружили взаимосвязь между полиморфизмами 3111ТС и 843ТС и развитием эссенциальной артериальной гипертензии и ишемической болезни сердца. В случае одного и другого полиморфизма, у мужчин, имеющих генотип СС, достоверно повышен риск возникновения ЭАГ и ИБС. Известно, что ген CLOCK расположен на хромосоме 4 и более вероятно, что изучаемый признак не сцеплен с полом. Различие в распределении генотипов по изучаемым полиморфным маркерам у мужчин и женщин в группах больных с диагнозами ЭАГ и ИБС и контрольной группе можно объяснить различным влиянием половых гормонов на проявление этих аллелей. С другой стороны, полиморфные варианты гена CLOCK могут по-разному влиять на содержание эстрогенов и андрогенов. Считается, что эстрогены обладают выраженной протективной способностью при кардиоваскулярных патологиях [Swedberg et al., 1990]. Возможным механизмом их защитного действия на сердечно-сосудистую систему является подавление экспрессии некоторых генов, ответственных за регуляцию кровяного давления, а именно, гена рецептора ангиотензина АТ1 и ангиотензинпревращающего фермента [Swedberg et al., 1990; Reckelhoff, 2005].

Результаты, полученные в настоящей работе, указывают на взаимосвязь между развитием ЭАГ и ИБС и изучаемыми полиморфными маркерами у населения Карелии. Одним из возможных механизмов, посредством которых мутации в циркадных генах влияют на формирование сердечно-сосудистых патологий, является участие этих генов в патологическом ремоделировании и повреждении сосудов. Например, на мышах показано, что мутация гена Clock вызывает патологическое изменение структуры сосудов, а нокаут гена Bmal1 приводит к накоплению коллагена в сосудах, повышению чувствительности к тромбозу и дисфункции эндотелия (реактивному ответу на действие вазорелаксантов) [Anea et al., 2009].

Изменения в структуре генов циркадных ритмов могут влиять на уровень экспрессии генов, белковые продукты которых вовлечены в регуляцию артериального давления и водно-солевого обмена. Известно, что белковый димер CLOCK:BMAL [Maemura et al., 2000] и белок PERIOD2 [Oishi et al., 2009] участвуют в регуляции циркадных колебаний экспрессии гена ингибитора активатора плазминогена PAI-1 в сердечно-сосудистых тканях. PAI-1 - первичный регулятор фибринолитического каскада, его активность и концентрация мРНК изменяются по циркадному типу с пиком в утренние часы [Angleton et al., 1989; Hoekstra et al., 2002], который совпадает со временем наибольшего риска развития инфаркта миокарда [Cohen et al., 1997]. Ритмичность экспрессии гена PAI-1 ослаблена в сердце мышей, мутантных по гену Clock [Minami et al., 2002]. Нокаут гена Bmal1 вызывает у мышей повышение агрегации и адгезии тромбоцитов, увеличение концентрации PAI-1 и фактора свертываемости крови Виллебранда [Somanath et al., 2011].

Мутации в циркадных генах вызывают изменения не только в процессах свёртывания крови, но и в гомеостазе водно-солевого обмена. Например, показано, что экспрессия гена NHE3 (Na⁺/H⁺-транспортёра почечного эпителия) регулируется непосредственно гетеродимерами CLOCK:BMAL1, которые способны связываться с определённой последовательностью ДНК гена NHE3 [Saifur et al., 2005].

Следует отметить, что механизмы, посредством которых часовые гены могут участвовать в формировании сердечно-сосудистых патологий, до конца не изучены. Представленные данные литературы позволяют предположить, что основным механизмом влияния полиморфных вариантов гена CLOCK на развитие сердечно-сосудистых патологий, может быть влияние на уровень экспрессии генов, белковые продукты которых вовлечены в регуляцию артериального давления и водно-солевого обмена.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружена взаимосвязь между развитием ЭАГ и ИБС и полиморфными маркерами 3111ТС и 843ТС гена CLOCK у населения Карелии.

2. У мужчин, носителей генотипа СС по полиморфному маркеру 3111ТС гена CLOCK, достоверно повышен риск возникновения ЭАГ (OR=1,49) и ИБС (OR=1,57).

3. У мужчин, носителей генотипа СС по полиморфному маркеру 843ТС гена CLOCK, достоверно повышен риск возникновения ЭАГ (OR=2,26) и ИБС (OR=2,17).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Северин Е.С. Биохимия: учебник для вузов. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2003. С. 202-203.

2. Andrews N.P., Gralnick H.R., Merryman P., Vail M., Quyyumi A.A. Mechanisms underlying the morning increase in platelet aggregation: a flow cytometry study // J. Am. Coll. Cardiol. 1996. Vol. 28. P. 1789--1795.

3. Anea C.B., Zhang M., Stepp D.W., Simkins B.G., Reed G., Fulton D.J., Rudic R.D. Vascular disease in mice with a dysfunctional circadian clock // Circulation. 2009. Vol. 119, № 11. P. 1510--1517.

4. Angleton P., Chandler W.L., Schmer G. Diurnal variation of tissue-type plasminogen activator and its rapid inhibitor (PAI-1) // Circulation. 1989. Vol. 79. P. 101--106.

5. Backs J., Olson E.N. Control of cardiac growth by histone acetylation/deacetylation // Circ. Res. 2006. Vol. 98. P. 15--24.

6. Bailer U., Wiesegger G., Leisch F., Fuchs K., Leitner I., Letmaier M., Konstantinidis A., Stastny J., Sieghart W., Hornik K., Mitterauer B., Kasper S., Aschauer H.N. No association of clock gene T3111C polymorphism and affective disorders // Eur. Neuropsychopharmacol. 2005. Vol. 15. P. 51--55.

7. Benedetti F., Dallaspezia S., Fulgosi M. C., Lorenzi C., Serretti A., Colombo C., Smeraldi E. Actimetric evidence that CLOCK 3111 T/C SNP influences sleep and activity patterns in patients affected by bipolar depression // Am. J. of Medical Genetics Part B: Neuropsychiatric Genetics. 2007. Vol. 144B. P. 631--635.

8. Benedetti F., Radaelli D., Bernasconi A., Dallaspezia S., Falini A., Scotti G., Lorenzi C., Colombo C., Smeraldi E. Clock genes beyond the clock: CLOCK genotype biases neural correlates of moral valence decision in depressed patients // Genes. Brain Behav. 2008. Vol. 7. P. 20-25.

9. Cohen M.C., Rohtla K.M., Lavery C.E., Muller J.E., Mittleman M.A. Metaanalysis of the morning excess of acute myocardial infarction and sudden cardiac death // Am. J. Cardiol. 1997. Vol. 79. P. 1512--1516.

10. Desan P.H., Oren D.A., Malison R., Price L.H., Rosenbaum J., Smoller J., Charney D.S., Gelernter J. Genetic polymorphism at the CLOCK gene locus and major depression // Am. J. Med. Genet. 2000. Vol. 96, № 3. P. 418--421.

11. Doi M., Hirayama J., Sassone-Corsi P. Circadian regulator CLOCK is a histone acetyltransferase // Cell. 2006. Vol. 125. P. 497--508.

12. Friedman L., Zeitzer J.M., Kushida C., Zhdanova I., Noda A., Lee T., Schneider B., Guilleminault C., Sheikh J., Yesavage J.A. Scheduled bright light for treatment of insomnia in older adults // J. Am. Geriatr. Soc. 2009. Vol. 57. P. 441--452.

13. Heng O.K., Saha N., Toy J. S. Lack of association of apolipoprotein E polymorphism with plasma Lp(a) levels in the Chinese // Clin. Genetics. 1995. Vol. 48, № 3. P. 113---119.

14. Hesketh J. Untranslated regions are important in mRNA localization and translation: lessons from selenium and metallothionein // Biochem. Soc. Trans. 2004. Vol. 32, № 6. P. 990--996.

15. Hoekstra T., Geleijnse J.M., Schouten E.G., Kluft C. Diurnal variation in PAI-1 activity predominantly confined to the 4G-allele of the PAI-1 gene // Thromb. Haemost. 2002. Vol. 88, № 5. P. 794--798.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Таблица 1. Распределение аллелей и генотипов по полиморфному маркеру 3111ТС гена CLOCK у здоровых и больных ЭАГ людей

Примечание: Здесь и в табл. 3: ЭАГ - артериальная эссенциальная гипертензия.

Таблица 2. Распределение аллелей и генотипов по полиморфному маркеру 3111ТС гена CLOCK у здоровых и больных ИБС людей

Примечание: Здесь и в табл. 4: ИБС - ишемическая болезнь сердца.

Таблица 3. Распределение аллелей и генотипов по полиморфному маркеру 843ТС гена CLOCK у здоровых и больных ЭАГ людей

Таблица 4. Распределение аллелей и генотипов по полиморфному маркеру 843ТС гена CLOCK у здоровых и больных ИБС людей

Размещено на Allbest.ru