Роль лізосомального апарату нейтрофільних лейкоцитів у формуванні синдрому дисемінованого внутрішньо судинного зсідання крові

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця

Боярчук Олена Дмитрівна

УДК 612.112.155.34/.39

Роль лізосомального апарату нейтрофільних лейкоцитів у формуванні синдрому дисемінованого внутрішньо судинного зсідання крові

03.00.13 -- фізіологія людини і тварин

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1998

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Луганському державному педагогічному інституті ім. Т.Г.Шевченка

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор

Луніна Неллі Василівна,

Луганський державний педагогічний інститут ім. Т.Г.Шевченка,

завідувач кафедри фізіології людини

та валеології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор

Середенко Михайло Михайлович

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця

НАН України

завідувач відділу по вивченню гіпоксичних станів

доктор біологічних наук

Варецька Тамара Володимирівна

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна

НАН України

провідний науковий співробітник

Провідна установа: Інститут геронтології АНМ України

Захист відбудеться “ 29 ” грудня 1998 року о 14-00 годині на

засіданні спеціальної вченої ради Д 26. 198. 01 при Інституті фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України (252024 м.Київ, вул. Богомольця, 4).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України за адресою: 252024 м.Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий 26 листопада 1998 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

доктор біологічних наук _______________ Сорокіна-Маріна З.О.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми

Нейтрофільні гранулоцити виявляють високий потенціал і багато-гранну функціональну активність (адгезія, хемотаксіс, респіраторний вибух, фагоцитоз, внутрішньоклітинне травлення, антимікробна і цитотоксична дія), що свідчить про їх великі резервні і адаптаційні можливості (Б.И.Кузник, Н.Н.Цыбиков, 1981; В.Е.Пигаревский, 1982; А.Д.Адо, А.Н.Маянский, 1983; Н.М.Бережная, 1988; Д.F.Bainton, 1976; M.Boodaerts e.a., 1982; J.M.Horlan e.a., 1985). Більшість авторів пов'язує роль нейтрофільних лейкоцитів, зокрема, з їх участю у фагоцитарних реакціях при запаленні чи пошкодженні тканин, при цьому вони відзначають розвиток нейтрофільозу і активацію гранулоцитопоезу (А.И.Струков, 1980; А.И.Воро-бьев в соавт., 1985; Ю.М.Бала, с соавт., 1991; I.M.Goldstein, 1984; R.A.Clark, N.Borregaard, 1985,1988).

У реалізації біологічного потенціалу нейтрофілоцитів значну роль відіграє лізосомальний апарат цих клітин. Найбільше вивчена участь лізосомальних ферментів нейтрофілів у інфекційно-запалювальних реакціях організму (М.Г.Шубич, И.В.Нестерова, 1980; А.А.Пальцин, 1988; Д.Н.Маянский, 1991; J.Fallon, J.Gallin, 1986). Саме лізосомальні ферменти нейтрофілів визначають як “медіатори запалення”, що опосереджують зв'язок нейтрофільних лейкоцитів з каликреїн-киніновою системою і системою комплемента (А.Я.Кульберг, 1985; А.Н.Маянский, 1989, Н.Моvat, 1985).

Однак дослідженнями, проведеними співробітниками школи Горизонтова (П.Д.Горизонтов, 1981; П.Д.Горизонтов с соавт., 1983), було встановлено, що нейтрофільний лейкоцитоз, обумовлений активацією гранулоцитопоезу, розвивається і при дії на організм стресорів неінфекційної природи, що до цього часу не одержало пояснення.

Реакція нейтрофільних лейкоцитів на дію стресорів неінфекційної природи була встановлена Н.В.Луніною і П.М.Козюком (1978), які показали, що при гострій крововтраті розвивається нейтрофільний лейкоцитоз, що супроводжується зменшенням числа лізосом і гранул лізосомальних катіонних білків у нейтрофільних лейкоцитах периферичної крові. Роботами, проведеними в нашій лабораторії, було доведено, що звільнення лізосомальних ферментів з нейтрофільних лейкоцитів відбувається шляхом екзоцитозу, без порушень цілісності мембран клітини (С.Б.Коваль с соавт., 1983). У дослідах in vitro встановлено, що лізосомальні ферменти нейтрофілів, печінки, головного мозку здатні активувати фактор Хагемана. Причому ця властивість в значно більшій мірі притаманна лізосомальним ферментам саме нейтрофілів (Н.В.Лунина, С.Б.Коваль, 1983).

Подальші дослідження лізосомального апарату нейтрофільних лейкоцитів при дії стресорів неінфекційної природи дозволили встановити, що лізосомальні ферменти і катіонні білки, потрапляючи в кров, активують Хагеман-залежні процеси згортання, фібринолізу, каликреїн-кинінову систему і систему комплементу (Н.В.Луніна, С.Б.Коваль, 1982, 1983; С.Б.Коваль с соавт., 1983; Е.В.Скрипка, 1983, 1986, 1990; С.И.Шинкарев, 1983; Н.В.Лунина, А.Ф.Полтавский, 1984; Н.А.Агафонова, Н.В.Лунина, 1987; Н.В.Лунина, С.В.Вовк, 1992, 1993; Н.В.Лунина, С.В.Вовк, А.А.Чехов, 1993; А.А.Чехов, С.В.Вовк, 1993). При цьому активація лізосомального апарату при впливі крововтрати (Н.В.Лунина, П.М.Козюк, 1978; Е.В.Скрипка, 1983, 1990), зниженого барометричного тиску (Н.В.Луніна, А.Ф.Полатвський, 1984), вагітності і родів (Н.В.Лунина, С.Б.Коваль, 1982, 1983; С.Б.Коваль с соавт., 1983), іммобілізація (Н.В.Лунина, Н.А.Агафонова,1986; Л.А.Когут, 1988; Н.В.Лунина, Л.В.Абакумова, 1990, 1991; Н.В.Лунина, А.А.Чехов, 1992; А.А.Чехов, С.В.Вовк,1993) була залежна від сили подразнюючого фактора (Н.А.Агафонова, Н.В.Лунина, 1987) і розвивалась під контролем симпатичної нервової системи (С.В.Вовк, 1993) та гіпоталамо-гіпофізарно-адренокортикальної системи (А.А.Чехов, С.В.Вовк, 1993). На підставі цього було зроблено висновок про неспецифічність реакцій лізосомального апарату нейтрофільних лейкоцитів, що забезпечують збереження гомеостазу в умовах стресу.

Встановлено, що при дії на організм надзвичайних подразників в експерименті іноді порушувався гемостаз, що виражався в розузгодженні функціональної активності систем, залежних від фактора Хагемана -- в тому числі згортаючої та фібринолітичної, і такі тварини звичайно гинули (Н.А.Агафонова, Н.В.Луніна, 1987; Н.В.Луніна, Л.В.Абакумова, 1990, 1991). В свою чергу відомо, що розугодженість систем регулювання агрегатного стану крові може привести до розвитку синдрому дисемінованого внутрішньосудинного зсідання крові (ДВЗ-синдрому) (Н.А. Горбунова, 1981; Н.Я.Лагутина, 1981).

Результати експериментів дозволили висунути припущення, що, можливо, лізосомальні ферменти нейтрофільних лейкоцитів можуть впливати на розвиток ДВЗ-синдрому.

Тим більше, що, згідно з сучасними уявленнями, лейкоцити, в тому числі й нейтрофіли, відіграють велику роль у підтриманні гемостазу, містять різноманітні фактори, що сприяють і перешкоджають згортанню крові, зокрема, тромбопластичний фактор, антигепариновий фактор, гепарин, антикоагулянт антитромбопластичної дії, плазмін, плазміноген і проактиватори плазміногена, три фракції антиплазміну (Б.И.Кузник с соавт., 1974; Б.И.Кузник, Я.Д.Красик, 1979; Б.И.Кузник, 1990; А.И.Грицюк, 1994). Однак дослідження лейкоцитарного компонента гемостазу ще не одержали достатньої і належної не лише практичної, але й наукової апробації.

Виходячи з викладеного вище, нами були поставлені такі мета і завдання дослідження.

Мета і завдання дослідження

кров лейкоцит лізосома гранула

З'ясувати роль лізосомальних ферментів нейтрофільних лейкоцитів у розвитку синдрому дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові.

У завдання роботи входило:

1) вивчити при моделюванні експериментального ДВЗ-синдрому кількісні зміни нейтрофілів у периферичній крові;

2) вивчити стан гранулоцитопоезу;

3) вивчити адгезивні властивості лейкоцитів;

4) вивчити морфофункціональні властивості лізосомального апарату нейтрофілоцитів за вмістом лізосом і гранул лізосомальних катіонних білків у нейтрофілах і активністю маркерного лізосомального фермента нейтрофілів -- кислої фосфатази у сироватці крові;

5) дослідити стан гемостазу за часом рекальцифікації плазми, тромбіновим часом, кількістю фібриногену, активністю ХШ фактора, етаноловим тестом і тестом на продукти деградації фібрину/фібриногену (ПДФ); 6) провести морфологічне дослідження та аналіз деяких внутрішніх органів(легень, нирок, надниркових залоз, печінки).

Наукова новизна одержаних результатів

Вперше доведена залежність формування ДВЗ-синдрому від функціонального апарату нейтрофільних лейкоцитів. На основі одержаних експериментальних даних висунуто положення про те, що при формуванні ДВЗ-синдрому лізосомальні ферменти нейтрофільних лейкоцитів беруть участь у порушенні гемостазу. Зокрема, встановлено, що свій вплив на порушення гемостазу лізосомальні ферменти нейтрофільних лейкоцитів виявляють в умовах різко вираженої лейкоцитарної реакції і визначають розвиток гіпокоагуляційного стану, який виявляється різким виснаженням факторів згортання крові, аж до повного її незгортання, та активацією факторів фібринолітичної системи. Таке співвідношення активності згортаючої та фібринолітичної систем і визначило прояв ДВЗ-синдрому.

В цих умовах спостерігалась зворотна корелятивна залежність між активністю лізосомальних ферментів і станом факторів згортаючої системи крові та пряма -- з факторами фібринолітичної системи.

Наведена залежність стану гемостазу від функціональної активності лізосомального апарату нейтрофілоцитів встановлена в експериментах з пригніченням гранулоцитопоезу, що викликало значне зниження в крові вмісту лізосомальних ферментів нейтрофільних лейкоцитів.

Практичне значення одержаних результатів

Результати досліджень мають певне теоретичне значення, поскільки розширюють існуючі уявлення про значення нейтрофільного лейкоцитозу і можуть служити для подальшої розробки проблеми по лейкоцитарному компоненту гемостазу. Зокрема, показана участь саме лізосомальних ферментів циркулюючих нейтрофілів у змінах згортаючої та фібринолітичної систем при ДВЗ-синдромі.

Практична цінність роботи полягає в тому, що встановлені кореляційні зв'язки між активацією лізосомального апарату нейтрофільних лейкоцитів і системами крові -- згортаючою і фібринолітичною -- можуть бути використані для пояснення і корекції порушень гемостазу при ДВЗ-синдромі. Регулювання концентрації лізосомальних ферментів нейтрофілів у крові може запобігти розвитку глибоких гіпокоагулемічних зрушень гемостазу в ході розвитку синдрому ДВЗ.

Особистий внесок претендента

Всі експериментальні дані по темі дисертації виконані безпосередньо дисертантом. Що стосується співавторів, з якими були опубліковані праці, то результати їх досліджень були використані для підтвердження одержаних результатів, їх обгрунтування, так як співробітники нашої лабораторії працюють протягом 15 років по темі “Роль лізосомальних ферментів нейтрофільних лейкоцитів у формуванні стрес-синдрому”. В цьому розумінні ця дисертаційна праця є продовженням досліджень по загальній проблемі.

Апробація результатів дисертації

Про результати дисертаційної праці доповідалось на щорічних наукових конференціях Луганського педагогічного інституту в 1996-1998 рр., на XV з'їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк,1998),на міжнародній конференції “Гіпоксія: деструктивна та конструктивна дія” (Київ, 1998).

Публікації

За матеріалами дисертації опубліковано 6 праць, з яких 4 журнальні статті і 2 праці в тезах.

Структура та обсяг дисертації

Дисертація складається з вступу, 5 глав, обговорення одержаних результатів, висновку, списку літератури.

Дисертація написана на 120 сторінках, з них власного тексту 85 сторінок, включаючи 27 таблиць і 40 малюнків, які займають 35 сторінок. Показник літератури містить 250 вітчизняних і зарубіжних джерел.

Матеріали і методи дослідження

Дослідження поставлені на 80 безпородних кроликах обох статей масою 2,5-3,0 кг.

Експеримантальні тварини були розділені на 2 групи:

І група -- контрольна,

II група -- дослідна.

У кроликів обох груп відтворювався ДВЗ-синдром. У II групі досліджень ДВЗ-синдром моделювали в умовах пригнічення гранулоцитопоезу.

ДВЗ-синдром моделювали препаратом “Ефа-2” (“Гигиена - БИО”, Москва), виготовленим на основі отрути змії ефи багатолускатої (Ehis multisguamatus). Відомо, що отрута змії ефи має коагулюючі властивості і при її надходженні в організм розвивається одна з форм ДВЗ-синдрому (З. С. Баркаган, 1985, 1988).

Для відтворення моделі ДВЗ-синдрому використовували різні дози препарату “Ефа-2”. Для вивчення всіх фаз ДВЗ-синдрому найбільш прийнятною є підгостра форма протікання, яка розвивається при введенні препарату “Ефа-2” нащесерце перорально в дозі 8350 мг/кг.

Пригнічення гранулоцитопоезу здійснювалось шляхом перорального введення мієлосану (АО “Октябрь”, Санкт-Петербург) в дозах: 10 мг на добу протягом 5-7 днів - до зменшення абсолютного числа нейтрофілів у літрі крові на 40-50 % і 4 мг на добу в середньому протягом 8 днів. Обираючи такі дози мієлосану, ми керувалися вказівками Т. Н. Ченцової, Н. Ф. Клинової (1967), які вводили препарат мієлобромол, що пригнічує гранулоцитопоез і в зазначених дозах знижує кількість лейкоцитів також на 40 -- 50 %.

У кроликів І групи досліджувані показники вивчались у інтактних тварин і після введення “Ефа-2” до відновлення показників згортаючої системи до вихідного рівня. В ІІ групі показники вивчались у інтактних тварин після пригнічення гранулоцитопоезу і після введення препарату “Ефа-2” до відновлення згортаючої системи.

В усіх тварин досліджувались показники, що характеризують функціональний стан лізосомального апарату нейтрофільних лейкоцитів і гемостаз, і проводилось морфологічне дослідження легень, нирок, надниркових залоз, печінки.

Загальна кількість лейкоцитів, вміст нейтрофілів, гранулоцитопоез досліджували загальноприйнятими методиками (В.В.Меньшиков, 1987).

Лізосомально-катіонну формулу нейтрофілів периферійної крові вивчали за методом В.Е.Пигаревського (1978). Підраховували лізосоми і гранули лізосомальних катіонних білків, використовуючи світловий мікроскоп (при збільшенні ок.15, об.90).

Для вивчення вмісту лізосом у нейтрофільних лейкоцитах мазки крові фарбували барвником Май-Грюнвальда. При мікроскопуванні лізосоми диференціюються як крупні округлі тільця рожевого кольору.

При дослідженні кількості гранул лізосомальних катіонних білків нейтрофілів крові використовували барвник “світловий зелений” (Н.В.Луніна, С.Б.Коваль 1982). Гранули лізосомальних катіонних білків у світловий мікроскоп визначаються як яскраво-зелені округлі утворення.

Підраховували 100 нейтрофілів та ідентифікували серед них 3 групи:

1 -- нейтрофіли, що містять понад 30 лізосом і гранул катіонних білків,

2 -- нейтрофіли, що містять від 29 до 10 лізосом і гранул катіонних білків,

3 -- нейтрофіли, що містять менше 10 лізосом і гранул катіонних білків.

Результат виражали в процентах. За процентним вмістом нейтрофільних лейкоцитів кожної з 3-х груп і загальною кількістю нейтрофілів у крові вираховували абсолютний вміст дегранульованих нейтрофілів (в одиницях СИ -- Х 109/л).

Активність маркерного лізосомального фермента -- кислої фосфатази в сироватці крові вивчали за методом Боданського (А.А.Покровский, 1969).

Гемостаз при ДВЗ-синдромі оцінювали за уніфікованим часом рекальцифікації плазми, за тромбіновим часом, за вмістом фібриногену, за активністю фактора ХIII, за паракоагуляційними тестами (В.П.Балуда, 1980; В.В.Меньшиков, 1987).

Морфологічне дослідження органів проведено у 20 кроликів -- по 10 у кожній групі. Тварин забивали в період максимальної активності маркерного лізосомального фермента -- кислої фосфатази. При гістологічному дослідженні звертали увагу на наявність тромбів та агрегатів формених елементів крові у судинах мікроциркуляторного русла, геморагій і некрозів у внутрішніх органах.

Результати експериментів опрацьовані статистично методом прямих різниць, як описано у Б.В.Монцевічуте-Ерінгене (1964). Вичисляли середні різниці та їх похибки, достовірні відмінності. Статистичне опрацювання здійснювали на комп'ютері.

Результати та їх обговорення

В результаті проведених досліджень встановлено, що у кроликів І групи після введення препарату “Ефа-2” розвивався нейтрофільний лейкоцитоз з максимальним збільшенням нейтрофільних лейкоцитів на 10-11 добу експерименту (+3.7±0.71; р<0.001).

За даними літератури, нейтрофільоз може бути обумовлений як перерозподілом нейтрофілів з маргинального пула, що містить до 50-60% нейтрофілів, у циркуляцію (А.Н.Маянский, Д.А.Маянський, 1989; Е.Д.Гольдберг с соавт., 1991), так і активацією мієлоїдного кровотворення (П.Д. Горизонтов с соавт., 1983, Е.Д.Гольдберг с соавт., 1991, R. Webber e.a., 1970).

В нашому дослідженні через добу після введення “Ефа-2” у кістковому мозку кроликів спостерігалась різка активація гранулоцитопоезу (+76.8±1.64;р<0.001) з прискоренням процесів визрівання, що підтримувало збільшену кількість нейтрофілів практично протягом всього періоду експерименту.

Аналогічні результати при вивченні дії різних стресорів неінфекційної природи були одержані й іншими авторами (А.М.Дыгай, В.П.Шахов, 1989; Е.Д.Гольдберг с соавт., 1990, 1991; Н.В.Лунина, Л.В.Абакумова, 1991; Н.В.Лунина, С.В.Вовк, 1992, 1993; А.А.Чехов, 1993), проте дія препарату “Ефа-2” вказанними вище авторами не вивчалась.

Результати досліджень свідчать, що нейтрофільоз у тварин супроводжувався зміною функціонального стану лізосомального апарату нейтрофільних лейкоцитів. Встановлено зменшення числа лізосом і гранул лізосомальних катіонних білків у нейтрофілах після введення “Ефа-2”, максимально виражене на 10-11 добу досліду(+6.0±0.48; р<0.001). Найбільш значна дегрануляція і декатіонізація нейтрофільних лейкоцитів відповідала строкам розвитку найбільш вираженого нейтрофільозу.

Максимальний рівень активності маркерного лізосомального фермента -- кислої фосфатази в сироватці крові відзначався на 10-11 добу досліду (+0.84±0.18; р<0.001), що відповідало найбільш високому абсолютному вмісту дегранульованих нейтрофілів.

Відомо, що підвищення активності лізосомальних ферментів у сироватці крові є неспецифічною реакцією організму, що розвивається у відповідь на вплив подразника достатньої сили (С.Е.Ульяненко, П.П.Суринов, 1982; Н.И.Бахов, 1988; П.Ф.Коровкин, 1989; K.Kramer e.a., 1987). При цьому підвищується проникливість лізосомальних мембран і відбувається вивільнення гідролітичних ферментів лізосом (Л.Е.Панин, 1983; Л.Е.Панин, Н.Н.Маянская, 1987). Збільшення проникливості лізосомальних мембран і підвищення активності лізосомальних ферментів у крові встановлено при геморагічному шоку (S.Harpacsy, G.Shells, 1980) та гіпоксії (И.И.Антонова, 1993; D.Acosta e.a., 1978). Крім того, працівниками нашої лабораторії було також показано підвищення проникливості лізосомальних мембран нейтрофілів, що супроводжується збільшенням активності лізосомальних ферментів у крові в умовах дії стресорів інфекційної і неінфекційної природи (А.Ф.Полтавский, 1985; Н.А.Агафонова, Н.В.Лунина, 1987; О.А.Зеленько, 1993).

Надходження лізосомальних ферментів у позаклітинний простір може відбуватись різними способами. В одних випадках вихід ферментів лізосом супроводжується пошкодженням плазматичної і лізосомальної мембран (В.А.Фролов, 1986; G.Weissman, 1976; D.E.Chaudler, 1980), в інших випадках -- через фагосому, що неповністю закрилася із зовнішнього боку клітини (ендоцитоз), або при безпосередньому виділенні вмісту азурофільних гранул (екзоцитоз) після переміщення їх до плазмалеми (Д.К.Новиков, 1987; Н.И.Бахов с соавт., 1988; А.Н.Маянский, Д.Н.Маянский, 1989; J.E. Beesley e.a. 1988).

С.Б.Коваль з співавторами (1983) встановили, що зниження числа лізосом і гранул лізосомальних катіонних білків у нейтрофілоцитах обумовлено виходом лізосомального вмісту в кров шляхом екзоцитозу. Це не прямо підтверджується нашими дослідженнями, які показали збереження в циркуляції повністю дегранульованих і декатіонізованих нейтрофілів при збільшенні загального вмісту нейтрофільних лейкоцитів у периферійній крові.

Після введення “Ефа-2” збільшувались агрегаційні властивості лейкоцитів у крові, що виражалось у підвищенні показника агрегації лейкоцитів (ПАЛ) та індексу агрегації лейкоцитів (ІАЛ) протягом всього періоду дослідження (крім 10-12-ї доби, коли значення показника були нижче вихідних величин). Максимальна вираженість лейкергічних властивостей лейкоцитів реєструвалась на 2-4-ту добу (+9.5±1.52;р<0.001), в період гіперкоагуляційних змін гемостазу, а мінімальна -- на 10-12-ту добу(-2.0±0.68;р,0.01), в період глибоких гіпокоагуляційних порушень гемостазу і максимальної активності лізосомальних ферментів у сироватці крові. Однак останнє не відповідає даним літератури, де вказується на те, що підвищення адгезивності нейтрофільних лейкоцитів супроводжується виділенням лізосомальних ферментів нейтрофілів, які, в свою чергу, виконують роль агрегаційного фактора (К.Дреслер, 1988; І.Wautier, 1983; D.Tsvetkov, 1987).

Порушення агрегаційних властивостей лейкоцитів можна пояснити послідовною агрегацією і дезагрегацією, в результаті чого лейкоцити стають менш функціонально повноцінними і слабкіше реагують на повторний вплив агрегуючих агентів, що пов'язане з вираженою в цей період дегрануляцією нейтрофілів. Крім того, на зменшення ступеня агрегації клітин крові може впливати збільшений вміст продуктів деградації фібрину/фібриногену (ПДФ), які діють як антиагрегати (Г.Н.Дранник, 1987; И.Н.Бокарев с соавт., 1989).

Введення “Ефа-2” призводило до змін показників гемостазу. В перші чотири доби відзначалось різке укорочення часу рекальцифікації плазми (-40.9±4.20;р<0.001) і тромбінового часу (-5.6±0.58;р<0.001), підвищення вмісту фібриногену(+31.7±8.54;р<0.01) і активності ХШ фактора(+72.0±3.85;р<0.001). Визначались позитивні проби етанолового тесту і на ПДФ. Подібні зміни згортаючої системи свідчать про гіперкоагуляційні порушення гемостазу (С.В.Левицкая, 1984; К.Каиэи, 1991; А.И.Грицюк, 1994). Що ж стосується змін етанолового тесту і проби на ПДФ, то, за даними літератури, відомо, що позитивна проба етанолового тесту вказує на наявність у плазмі комплексів фібрин-мономеру з фібриногеном і ранніми ПДФ, і присутність у сироватці крові ПДФ розглядається як важливий критерій ДВЗ-синдрому (Г.Н.Дранник, 1988; В.В.Меньшиков, 1989; R.L.Bick, 1982).

В наступні дні активність факторів згортання крові починає поступово знижуватися:час рекальцифікації плазми в 2.2 рази, тромбіновий час в 1.6 раза, вміст фібриногену в 2.8 раза, активність ХІІІ фактора в 1.8 раза. У плазмі крові визначаються фібрин-мономерні комплекси, а в сироватці крові стає ще вищим рівень ПДФ. Одержані результати виявляють перехідну стадію коагулопатії споживання (М.С.Мачавели, 1981; З.С.Баркаган, 1988; P.Seveik, 1991).

Починаючи з 9-ї доби експерименту, система гемостазу характеризується ускладненням коагулопатії споживання з різкими ознаками гіпокоагуляції: різко збільшений час рекальцифікації плазми (+206.7±16.91;р<0.001) і тромбіновий час (+15.6±2.42;р<0.001), максимально виражена фібриногенопенія (-52.6±6.25;р<0.001), значно знижена активність ХШ фактора (-76.7±3.52;р<0.001), що ще раз підтверджує розвиток гіпокоагулемічних порушень. Проби етанолового тесту в плазмі стають негативними, а в сироватці крові підвищується вміст ПДФ.

Наявність негативних проб етанолового тесту в плазмі крові можна пояснити високим рівнем вмісту продуктів деградації фібрину/фібриногену, які є інгибітором полімеризації фібрин-мономерів (И.В.Полынская, 1985; Г.Н.Дранник, 1987; V.A.Belitser еt al., 1982; R.L.Bick, 1982).

Таким чином, аналізуючи одержані дані, можна зробити висновок, що після введення “Ефа-2” у тварин спостерігались глибокі порушення гемостазу, які виражались розвитком стадій, що послідовно змінювали одна іншу: гіперкоагуляційної, при якій спостерігалась різка активація факторів згортаючої системи і агрегація клітин; коагулопатії споживання, при якій відбувалось поступове виснаження факторів згортання та активація фібринолізу; гіпокоагуляційної, яка характеризувалась різким збільшенням часу згортання крові, аж до повної втрати нею властивостей згортатися, максимальним зменшенням вмісту фібриногену і підвищенням рівня ПДФ, що вказує на розвиток синдрому ДВЗ.

При співставленні даних активності маркерного лізосомального фермента -- кислої фосфатази протягом експерименту і змін гемостазу було відзначено, що в період максимально вираженої активності ферментів нейтрофілів визначались глибокі гіпокоагуляційні порушення і загибель експериментальних тварин (до 30 %).

Визначення коефіцієнта кореляції показало зворотну залежність між активністю кислої фосфатази і компонентів згортаючої системи (для кожного показника, який характеризує стан згортаючої системи, коефіцієнт кореляції (r) коливався від 0,86 до 0,91, p<0,05). Що ж стосується кореляції між вмістом кислої фосфатази і показниками, які характеризують стан фибринолітичної системи, то коефіцієнт кореляції визначити було неможливо, тому що етаноловий тест і проби на продукти деградації фібрину/фібриногену оцінюються якісно, а не кількісно. Тим не менше, при підвищенні активності лізосомальних ферментів у плазмі збільшується вміст фібрин-мономерів і ПДФ, що свідчить про пряму залежність між показниками.

У зв'язку з цим, морфологічна діагностика синдрому ДВЗ була проведена в період максимальної активності кислої фосфатази. Морфологічне дослідження печінки, легень, нирок, надниркових залоз показало наявність мікротромбів: фібринових -- у легенях, еритроцитарних -- у легенях і нирках; агрегації еритроцитів -- в усіх досліджуваних органах; паренхиматозної дистрофії з ділянками некрозу і некробіозу -- в надниркових залозах і печінці; осередкових крововиливів -- у корковій речовині та капсулі надниркових залоз і паренхимі печінки.

Подібна картина мікроциркуляторного русла при ДВЗ-синдромі описується в працях інших авторів (Н.Ф.Каньшина, 1981; Д.Д.Зербино, 1989; Б.И.Калмыкова, 1990; E.Redoeczi et al., 1969; U.Blayl et at., 1976), що ще раз підтверджує розвиток ДВЗ-синдрому в експериментальних тварин у наших дослідженнях при введенні препарату “Ефа-2”.

Одержані нами прояви експериментального ДВЗ-синдрому співпадають з іншими його моделями, викликаними введенням “Дезоксону-3”, ендотоксиновим шоком, опіками, гемокоагулюючими отрутами і т.п. (З.С.Баркаган с соавт., 1988; Б.М.Щепотин с соавт., 1989; Е.Д.Черствой с соавт., 1990; Б.И.Калмыкова с соавт., 1990).

Для підтвердження існування виявленої залежності між підвищенням функціональної активності лізосомального апарату нейтрофілів і вираженими порушеннями гемостазу в дослідних тварин моделювання експериментального ДВЗ-синдрому проводили в умовах пригніченого гранулоцитопоезу мієлосаном.

Одержані дані в II групі досліджень свідчать про те, що після введення “Ефи-2” в умовах пригнічення гранулоцитопоезу нейтрофільний лейкоцитоз не тільки не розвивався, а й число нейтрофілів у крові на 4 -- 6 добу знижувалось на 18 --20 %.

При цьому в кістковому мозку кроликів відзначалось зменшення клітин гранулоцитарного ряду з гальмуванням процесів визрівання в 7 -- 10 разів, в результаті чого й відбувалось зниження кількості нейтрофільних лейкоцитів у периферичній крові.

Процеси зменшення числа лізосом і гранул лізосомальних катіонних білків нейтрофілів та абсолютний вміст дегранульованих і декатіонізованих нейтрофілоцитів були 4 -- 8 разів нижчими, ніж у контрольній групі.

Це, в свою чергу, пояснює, що активність маркерного лізосомального фермента -- кислої фосфатази в сироватці крові дослідних тварин була в 2,5 раза менш вираженою, ніж у контрольних кроликів.

Зменшення концентрації лізосомальних ферментів у крові тварин супроводжувалось зниженням ступеню збільшення ПАЛ та ІАЛ у всі строки експерименту. Значення ПАЛ та ІАЛ в ІІ групі були менш вираженими в середньому в 3 -- 5 разів. Одержані дані підтверджують той факт, що ферменти нейтрофільних лейкоцитів виконують роль агрегаційного фактора (Н.М.Бережная, 1988; К.Дреслер, 1988; J.O'Flagerti, 1981; J.Wautier e.a.; 1983; D.Tsvetkov, 1987; I.Ginis, A.Tauber, 1990).

Зниження активності лізосомальних ферментів нейтрофільних лейкоцитів у крові призводило до значного зменшення порушень гемостазу. Після введення “Ефи-2” в умовах пригнічення гранулоцитопоезу в перші дві доби укорочувався час рекальцифікації плазми (-29.3±1.38;р<0.001) і тромбіновий час (-5.1±0.31;р<0.001), підвищувався вміст фібриногену (+21.8±5.38;р<0.001) і зростала активність ХIII фактора (+ 12.8±3.76;р<0.01); в плазмі крові визначалися позитивні проби етанолового тесту, а в сироватці крові -- ПДФ, що свідчить про розвиток гіперкоагуляції (Б.И.Кузник, 1981; А.Н.Дубяга, 1985; Й. Кавааи, 1991). Однак у порівнянні з контрольною в II групі зміни показників, що характеризують стадію гіперкоагуляції, були в середньому в 4 рази менш виражені.

В наступні два дні час рекальцифікації плазми (+1.5±8.65;р>0.5) підвищувався до вихідних величин, тромбіновий час (-2.1±0.37;р<0.001) був ще незначно укорочений, намічалася тенденція до зниження вмісту фібриногену (-9.6±3.32;р<0.02) і активності ХIII фактора (+2.5±4.09;р>0.5). Подібні зміни згортаючої системи відповідають розвитку стадії коагулопатії споживання (З.С.Баркаган, 1988; К.Каиэи, 1991; А.И.Грицюк, 1994).

На 5-у добу час рекальцифікації плазми (+6.7±1.57;р<0.01) і тромбіновий час (+1.3±0.54;р<0.02) були незначно підвищені, а активність XIII фактора (-4.9±1.30;р<0.001) знижена, але ці зміни відбувались у межах нормальних коливань показників, що вивчалися , а вміст фібриногену (-3.9±2.08;р>0.1) не відрізнявся від вихідних величин. Проби на етаноловий тест і продукти деградації фібріну/фібріногену були негативними.

Стан згортаючої системи в цей період не відображав різкого споживання факторів згортання і при нормальному вмісту фібриногену свідчив про те, що стадія гіпокоагуляції в умовах пригнічення гранулоцитопоезу не розвивалась.

Починаючи з 6-ї доби показники згортаючої системи відновлювались.

Таким чином, співставляючи результати наших досліджень з даними літератури, можна зробити висновок, що прояви порушень гемостазу, які виражаються лише в розвитку гіперкоагуляційних змін, по суті, не характерні для ДВЗ-синдрому як такого в цілому (М.С.Мачабели, 1981; С.В.Левицкая, 1984; В.Г.Лычев, 1986; Й.Кавааи,1991; К. Каиэи, 1991; А. И. Грицюк, 1994).

Морфологічне дослідження показало, що у внутрішніх органах спостерігалась загальна картина повнокрів'я мікроциркуляторного русла і помірно виражені дистрофічні зміни клітин. Подібні зміни мікроциркуляторного русла підтверджує наше допущення про те, що у кроликів в умовах пригнічення гранулоцитопоезу після введення “Ефи-2” ДВЗ-синдром не розвивався, а процес обмежувався лише гіперкоагуляційними зрушеннями, що характерно для стрес-синдрому (Н.Ф.Каньшина, 1981; Д.Д.Зербино, Л.Л.Лукасевич, 1983; Н.К.Пермяков, 1983; E.Regoeczi, 1969).

Аналізуючи результати наших досліджень, можна уявити такий механізм розвитку ДВЗ-синдрому після введення “Ефи-2” і роль нейтрофільних лейкоцитів при цьому.

Препарат “Ефа-2”, що використовувався в цій роботі, виготовлений на основі отрути змії ефи багатолускатої (Echis multisgnomatus), введення якої, як і інших речовин, здатних викликати розвиток ДВЗ-синдрому, активують протромбін або Х фактор (М.С.Мачабели, 1970; Б.И.Кузник, 1971, 1979; В.П.Балуда, 1980; З.С.Баркаган, 1985).

В наших експериментах після введення “Ефи-2” спостерігалась різка активація факторів згортаючої системи, що, очевидно, і було обумовлено прямою дією отрути на протромбін або Х фактор плазми. Не можна виключити і прямий вплив лізосомальних ферментів нейтрофільних лейкоцитів на фактор Хагемана, бо саме в період розвитку гіпокоагуляційних порушень гемостазу, характерних для ДВЗ-синдрому, активність кислої фосфатази була максимальною. Тим більше, що і попередніми дослідженнями нашої лабораторії встановлена не тільки активація фактора Хагемана і залежних від нього систем лізосомальними ферментами нейтрофільних лейкоцитів, але й розузгодження згортаючої і фібринолітичної систем при формуванні стрес-синдрому. Крім того, дослідженнями Кузника (Б.И.Кузник, В.П.Скипетров, 1974; Б.И.Кузник, Я.Д.Красик, 1979) доведено, що лізосомальні ферменти гранулоцитів, володіючи фібринолітичною активністю, можуть самі по собі, тобто без участі плазміну, розщепляти фібрин.

В період вираженого нейтрофільозу і максимального виходу лізосомальних ферментів у кров глибока гіпокоагуляція, що розвивається, аж до повного незгортання крові, за даними літератури, може пояснюватись, з одного боку, різким виснаженням факторів згортаючої системи і високим рівнем вмісту в сироватці крові продуктів деградації фібрину/фібриногену, а, з іншого боку, активацією Хагеман-залежної фібринолітичної системи лізосомальними ферментами нейтрофілів і антикоагуляційними та фібринолітичними властивостями останніх.

Висловлена аргументація підтверджується експериментами з пригніченням гранулоцитопоезу, максимальним подавленням активності лізосомального апарату нейтрофільних лейкоцитів, що призводило до зниження вмісту кислої фосфатази на 70%.

В умовах зниженої концентрації лізосомальних ферментів нейтрофільних лейкоцитів у сироватці крові стан згортаючої і фібринолітичної систем визначався більшою мірою впливом на ці процеси лише “Ефи-2” і не ускладнювався лізосомальними ферментами нейтрофільних лейкоцитів.

Таке твердженнявидається обгрунтованим, оскільки лізосомальні ферменти нейтрофілів не лише активують фактор Хагемана, але й мають протизгортаючі фібринолітичні властивості, що при їх високій концентрації призводить до розвитку глибоких гіпокоагуляційних порушень.

Таким чином, розвиток ДВЗ-синдрому супроводжується вираженим нейтрофільним лейкоцитозом, обумовленим активацією гранулоцитопоезу. Підвищення кількості циркулюючих нейтрофілів супроводжувалось зменшенням вмісту лізосом у нейтрофільних лейкоцитах і підвищенням активності маркерного лізосомального фермента в сироватці крові. Підвищувались агрегаційні властивості лейкоцитів крові.

Вивчення показників згортаючої системи при ДВЗ-синдромі показало, що їх зміни пов'язані з рівнем активності кислої фосфатази в сироватці крові.

Пригнічення гранулоцитопоезу у піддослідних тварин супроводжувалось значним зниженням активності кислої фосфатази, при цьому відзначалось зменшення порушень гемостазу (після введення “Ефи-2”) і уражень мікроциркуляції внутрішніх органів, що запобігало розвитку гіпокоагуляційних змін гемостазу, а, значить, і ДВЗ-синдрому.

Отже, нами доведено наявність функціонального зв'язку між станом лізосомального апарату нейтрофільних лейкоцитів крові і розвитком синдрому дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові.

Висновки

1.Згідно з даними літератури, участь лізосомальних ферментів нейтрофілів у розвитку ДВЗ-синдрому не вивчалася. Раніше дослідами, проведеними в нашій лабораторії, було встановлено, що лізосомальні ферменти нейтрофілів регулюють гемостаз, що дало підставу допустити, що лізосомальні ферменти нейтрофілів беруть участь у розвитку ДВЗ-синдрому.

2. При формуванні ДВЗ-синдрому, викликаного введенням препарату “Ефа-2”, в організмі кроликів розвивався нейтрофільний лейкоцитоз, активувався гранулоцитопоез, зменшувався вміст лізосом і гранул лізосомальних катіонних білків у нейтрофілах та з'являлась виражена активність маркерного лізосомального ферменту кислої фосфатази в сироватці крові.

3. При розвитку ДВЗ-синдрому порушувався гемостаз, що виражалось різкою активацією факторів згортаючої системи з поступовим їх виснаженням, розвитком глибокої гіпокоагуляції, аж до повного незгортання крові в період найбільшої активності кислої фосфатази.

4. Морфологічне дослідження внутрішніх органів у період максимальної активності кислої фосфатази показало наявність мікротромбів і агрегатів формених елементів крові у мікроциркуляції, а також некрозів і геморагій.

5. В умовах пригнічення гранулоцитопоезу після введення препарату “Ефа-2” нейтрофільний лейкоцитоз не розвивався, визначалось гальмування гранулоцитопоезу, незначно зростала концентрація лізосомальних ферментів у плазмі крові.

6. В цих умовах розвивались лише гіперкоагуляційні зміни у згортаючій системі, а гіпокоагуляційні порушення гемостазу були відсутні.

7. Морфологічне дослідження внутрішніх органів свідчить про повнокрів'я мікроциркуляції і помірно виражені дистрофічні зміни клітин.

8. Високий рівень активності лізосомальних ферментів нейтрофілів у плазмі крові є одним з визначальних факторів у розвитку ДВЗ-синдрому.

Список опублікованих праць

1. Можаева Е.А., Боярчук Е.Д. Состояние систем, зависимых от фактора Хагемана, в условиях дефицита инсулина при действии стрессора инфекционной природы // Вестник проблем биологии и медицины. -- 1998. -- №5. -- С. 23 -- 29.

2. Боярчук Е.Д. Экспериментальная модель ДВС-синдрома // Вестник проблем биологии и медицины. -- 1998. -- №7. -- С. 132--138.

3. Боярчук О.Д., Можаєва О.О. Стан лізосомального апарату нейтрофільних лейкоцитів при ДВЗ-синдромі і в умовах гіпоінсулінемії при дії стресора неінфекційної природи // Вестник проблем биологии и медицины -- 1998. -- №7. -- С. 139--143.

4. Боярчук Е.Д., Лунина Н.В. Роль нейтрофильных лейкоцитов в развитии ДВС-синдрома. // Вестн. пробл. биологии и медицины. -- 1998. -- №16. -- С 39 -- 44. .

5. Боярчук О.Д., Луніна Н.В. Вплив пригнічення гранулоцитопоезу на зміни лізосомального апарату нейтрофільних лейкоцитів при ДВЗ-синдромі // ХV з'їзд Укр. фізіологічн. товариства. -- Фізіол. журнал. -- 1998. -- Т. 44, №3. -- С. 183.

6. Боярчук О.Д., Луніна Н.В. Вплив пригнічення гранулоцитоезу на формування ДВЗ-синдрому // Матер. міжнародн. конф. “Гіпоксія: деструктивна та конструктивна дія”. -- Київ. -- 1998. -- С. 39-40.

Анотації

Боярчук О.Д. Роль лізосомального апарату нейтрофільних лейкоцитів у формуванні синдрому дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові. -- Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 -- фізіологія людини і тварин. -- Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 1998.

Дисертація присвячена ролі лізосомальних ферментів нейтрофільних лейкоцитів у розвитку синдрому дисемінованого внутрішньосудинного згортання крові. В роботі висунуто припущення про те, що при формуванні ДВЗ-синдрому лізосомальні ферменти нейтрофілів беруть участь у порушенні гемостазу. Встановлено, що свій вплив на порушення гемостазу вони виявляють при надходженні у кров в умовах різко вираженої лейкоцитарної реакції і визначають розвиток глибокого гіпокоагуляційного стану. В експериментах з пригніченням гранулоцитопоезу показана зворотна корелятивна залежність між активністю лізосомальних ферментів і станом факторів згортаючої системи крові та пряма -- з факторами фібринолітичної системи. Встановлені корелятивні зв'язки можуть бути використані для пояснення і корекції порушень гемостазу при ДВЗ-синдромі. Регулювання концентрації лізосомальних ферментів нейтрофілів у крові може запобігти розвитку глибоких гіпокоагуляційних зрушень гемостазу в ході розвитку синдрому ДВЗ.

Боярчук Е.Д. Роль лизосомального аппарата нейтрофильных лейкоцитов в формировании синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови. -- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 -- физиология человека и животных. -- Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 1998.

Диссертация посвящена роли лизосомальных ферментов нейтрофильных лейкоцитов в развитии синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови. В работе выдвинуто допущение, что при формировании ДВС-синдрома лизосомальные ферменты нейтрофилов принимают участие в нарушении гемостаза. Установлено, что свое влияние на нарушение гемостаза они проявляют при поступлении в кровь в условиях резко выраженной лейкоцитарной реакции и определяют развитие глубокого гипокоагуляционного состояния. В экспериментах с угнетением гранулоцитопоэза показана обратная коррелятивная зависимость между активностью лизосомальных ферментов и состоянием факторов свертывающей системы крови и прямая -- с факторами фибринолитической системы. Установленные корреляционные связи могут быть использованы для объяснения и коррекции нарушений гемостаза при ДВС-синдроме. Регулирование концентрации лизосомальных ферментов нейтрофилов в крови может предотвратить развитие глубоких гипокоагуляционных сдвигов гемостаза в ходе развития синдрома ДВС.

Boyarchuk H.D. The role of lysosomal apparatus of neufrophy lic leucocytes in formation of the disseminated intravascular blood coagulation.

Thesis for candidate"s degree by speciality 03.00.13. -- human and animal physiologi. -- O.O.Bogomoletz Institute of Physiology, Ukranian National Acadamy of Science, Kyiv, 1998.

The dissertation is devoted to the role of neutrophylic leucocytes (namely, its lysosomal apparatus) in formation of the disseminated intravascular blood coagulation (DIC). It was supposed that under condition of DIC the neutrophils lytic enzymes take part in hemostasis state. It was established that these enzymes influenced on hemostasis formation.

In experiments with granulocyte formation oppression it was been shown that there was the inverse correlation between the lytic enzymes concentration and the blood coagulation"s factors and the straight correlation with the fibrinolytic system factors.

The established correlation could be used for explanation and correction of the changes in hemostasis under DIC.

Regulation of the lytic enzymes concentrations in the blood neutrophyles may prevent the development of deep hypocoagulation hemostasis changes under DIC formation.

Размещено на Allbest.ru

...