Бальнеоактивність органічних речовин води "Нафтуся" та підходи до моделювання їх походження

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

УКРАЇНСЬКИЙ НДІ МЕДИЧНОЇ РЕАБІЛІТАЦІЇ ТА КУРОРТОЛОГІЇ

БІЛАС Володимира Романівна

УДК 615.327:553,715]:616-092.19-001.28

Бальнеоактивність органічних речовин води ”Нафтуся” та підходи до моделювання їх походження

14.01.33 - курортологія та фізіотерапія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

Одеса - 1998

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Науковий керівник: доктор медичних наук Івасівка Степан Васильович, Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, завідувач відділом експериментальної бальнеології.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, старший науковий співробітник Драгомирецька Наталія Володимирівна, Український НДІ медичної реабілітації та курортології, головний науковий співробітник відділення відновного лікування хворих терапевтичного профілю;

доктор медичних наук, старший науковий співробітник Киртич Людмила Прокопівна, науково-практичне об'єднання “Реабілітація”, завідувач гастроентерологічним відділеням.

Провідна установа: Кримський республіканський НДІ фізичних методів лікування та медичної кліматології ім. І.М. Сеченова МОЗ України, клінічний відділ

Захист відбудеться “ 25 “ грудня 1998 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.608.01 при Українському науково-дослідному інституті медичної реабілітації та курортології МОЗ України (270014, Одеса, Лермонтовський пров., 6).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Українського НДІ медичної реабілітації та курортології (270014, Одеса, Лермонтовський пров., 6).

Автореферат розісланий “ 10 ” листопада 1998 року.

Вчений секретар спеціалізованої ради,

кандидат медичних наук,

старший науковий співробітник Г.О. Дмитрієва

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вживання терміну "лікувальна мінеральна вода Нафтуся” правомірне лише частково, якщо виходити з формальної умови, що до мінеральних належать води, котрі містять в свойому складі солей не менше 2 г/л (В.В. Иванов, Г.А. Невраев, 1964; П.Г. Царфис, Ю.Е. Данилов, 1975). Її низька мінералізація (0,7-0,8 г/л, тобто на рівні прісної води) скерувала пошук бальнеоактивних чинників в сторону органічних складників. Вже в першій письмовій згадці про Нафтусю поряд з констатацією її лікувальних властивостей звертається увага на ймовірний фактор цих властивостей: "... селяни Трускавця та інших сіл Галіції п'ють воду з домішками нафти для лікування багатьох захворювань" (G. Rzaczynski, 1721). В першій науковій праці, присвяченій Нафтусі, теж сказано про нафту як "не позбавлену значимості складову частину" (T. Torosiewicz, 1836). А, власне, здогадка про діюче начало води відображена і у її назві. Положення про зумовленість лікувальної дії Нафтусі її нафтовими складниками розвинене в роботах M. Koch (1842), A. Unger (1843), Е.С. Бурксера и Н.Е. Федеровой (1950). Поряд з тим, впродовж більш столітнього періоду досліджень, як головні лікувальні чинники, розглядалися: смолоподібні речовини (B. Radziszewski, 1881; T. Praschil, 1904; K. Gerus, 1911); леткі сірчисті вуглеводи (G. Flaschen, 1931; Z. Orlowski, 1936; К.Г. Гаюн, Т.Ф. Левченко, 1957; Н.А. Білик, 1975; Я.М. Ливчак і ін., 1962; Е.Л. Быкова, Г.А. Голева, 1968); феноли (С.А. Шапиро, 1951); адреналіноподібні симпатоміметичні речовини (Ф.Е. Куркудым, 1963, 1965, 1968). Проте ці твердження чи припущення побудовані не на прямих доказах, а на загальних уявленнях про ефекти тих чи інших складників Нафтусі, тому мають лише історичну цінність.

Бальнеотерапевтичну дію Нафтусі і її органічних складників оцінювали згідно змін водно-сольового обміну (Б.Е. Есипенко, 1978, 1981), холерезу і діурезу (И.Н. Данилова и др., 1977), парціальної функції нирок (Е.И. Капская, О.Д. Гаске, 1980), жовчоутворення (Н.И. Габор и др., 1974; З.А. Гаврилюк, 1980), процесів тканинного дихання та фосфорилювання в печінці (Л.И. Жалило, 1975). Застосування системного підходу дозволило отримати багато нових даних, котрі, однак, виявилися неоднозначними і суперечливими.

Дослідження М.С. Яременко і ін. (1983-1989) реакції гастро-ентеральної панкреатичної ендокринної системи на одноразове і довготривале введення мінеральної води Нафтуся дозволило коректно оцінити бальнеоактивну дію її гіпоосмолярного чинника, проте, в подальшому, експериментально встановлено, що вивільнення гастроінтестинальних гормонів зумовлене градієнтними потоками води з порожнини шлунково-кишкового тракту в тканини внутрішнього середовища (С.В.Івасівка, 1994), тобто гіпоосмолярність є неспецифічним бальнеоактивним чинником мінеральної води Нафтуся.

Отже, проблема вияснення ролі органічних складників води Нафтуся в її бальнеоактивності залишається актуальною. На сьогодні встановлено, що автохтонні мікроорганізми води Нафтуся здатні руйнувати її органічні речовини, однак утворення біологічно активних речовин (БАР) шляхом мікробної біотрансформації лише передбачалося (С.А. Крашенинникова, 1962; Е.И. Квасников и др., 1978, 1981; Б.Е. Есипенко, 1981).

Звязок роботи з науковими темами. Науково-дослідна робота виконувалась в плановому порядку у відділі по вивченню механізмів фізіологічної дії мінеральних вод та лабораторії експериментальної бальнеології відділу фізіології водно-сольового обміну Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України і зв”зана з темами: ”Изучение роли отдельних компонентов вод типа Нафтуся, механизмы их физиологического и лечебного действия” , N гос. Регистрации 01850003843, шифр темы 2.35.7.7.,”Изучение биологической активности и физиологического действия органических веществ воды Нафтуся”, N гос. Регистрации 01880009978, шифр темы 2.36.1.1.,”Изучить физиологическую активность ряда минеральних вод новых источников с целью экспериментального обоснования их лечебного действия” по программе ГКНТ N 348 от 30. 07.86, N гос. Регистрации 01870026029, шифр темы 2.36.5.3.

Мета дослідження. Розширення спектру методів оцінки бальнеоактивності органічних речовин вод типу Нафтуся, розробка підходів до моделювання їх походження з метою уточнення деяких сторін механізму їхньої дії та ідентифікації вод нововідкритих родовищ та свердловин на предмет приналежності до типу Нафтуся.

Задачі дослідження. У відповідності з метою дослідження були поставлені наступні завдання.

1. Виявити специфічні ферментативні біоіндикатори для вод типу Нафтуся. Вивчити залежність між рівнями ферментативної активності вод різних свердловин та кількістю мікроорганізмів різних фізіологічних груп цих вод.

2. Вивчити вплив вод типу Нафтуся на активність гідролітичних ферментів шлунково-кишкового тракту екзогенного та мембранного походження. З”ясувати вплив окремих груп органічних речовин лікувальних вод цього типу на каталітичну активність гідролаз.

3. Оцінити вплив природних та антропогенних факторів на бальнеоактивність води Нафтуся свердловин Трускавецького родовища з допомогою специфічних біосенсорів.

4. Вивчити вплив води Нафтуся при тривалому напоюванні тварин на фагоцитарну активність гранулоцитів та реактивність органів імунної системи. Провести порівняльну оцінку імуномодулюючої дії гідрофобної та гідрофільної фракцій ліофілізату лікувальної води на фагоцитарну активність гранулоцитів експериментальних тварин.

5. Розробити загальні принципи отримання групи бальнеоактивних речовин , притаманних водам типу Нафтуся, шляхом мікробної біотехнології вирощування асоційованої культури вуглеводеньокислюючих мікроорганізмів на вуглеводневій сировині.

6. Провести порівняльну оцінку впливу продуктів біотрансформації озокериту на мембранні іонтранспортні АТФази ентероцитів та на систему неспецифічного імунного захисту з дією нативної води Нафтуся.

7. Обгрунтувати і з”ясувати значення мікробного ценозу в механізмі дії мінеральних вод типу Нафтуся , дати оцінку отриманим результатам для бальнеології .

Наукова новизна одержаних результатів. На основі клініко-біохімічних та мікробіологічних методів вперше розроблено біосенсорні методи оцінки бальнеоактивності мінеральної води Нафтуся in vitro . Розширено набір біотестів для оцінки бальнеоактивної дії вод цього типу.

Вперше встановлено, що мікробна лактатдегідрогеназна активність є біологічним індикатором води Нафтуся, зумовлена життєдіяльністю сульфатредукуючих бактерій, зокрема Desulfovibrio desulfuricans.

Вперше з”ясований механізм дії окремих груп органічного комплексу лікувальних мінеральних вод на активність гідролітичних ферментів тонкого кишечника (альфа-амілази та мембранної Na,K-АТФази).

Вперше встановлоно модулюючу дію води Нафтуся на фагоцитарну здатність гранулоцитів у клініці та експерименті.

Вперше відтворено один із ключових бальнеоефектів мінеральної води - гальмування активності іонтранспортних АТФаз карбоновими кислотами, отриманими шляхом мікробної біотрансформації..

Методом біотехнологічного нагромадження метаболітів асоційованої культури вуглеводеньокислюючих мікроорганізмів води Нафтуся отримано бальнеоактивні речовини та відтворено бальнеоефекти на ферментних біосенсорах та при багаторазовому надходженні в організм in vivo.

Практичне значення. Отримані результати є основою біологічної ідентифікації мінеральних вод типу Нафтуся згідно їх власної ферментативної активності. Розроблено методи ферментативного біотестування органічних речовин лікувальних мінеральних вод з метою розширення спектру їх ідентифікаційних характеристик.

Запропоновані біосенсорні методи можуть бути використані для вивчення біологічної активності складних органічних сумішей, біомоделей, гомеопатичних засобів та пробіотиків, а також для оцінки впливу антропогенних та природних чинників на рівень бальнеоактивності лікувальних слабомінералізованих вод . З їх допомогою коректно проведено моніторінг змін лікувальної дії мінеральної води Нафтуся різних свердловин Трускавецького родовища та ідентифіковано води типу Нафтуся серед нових свердловин.

Біотехнологічно одержано групу бальнеоактивних органічних речовин мінеральної води Нафтуся, що дозволяє забезпечити цілеспрямовану модифікацію бальнеотерапевтичної цінності цієї унікальної лікувальної води.

Запропоновано та впроваджено в практику рекомендації щодо щадячих методів очистки лікувальних вод з метою збереження бальнеоактивних органічних речовин та генетичного фонду мікробного ценозу Трускавецького родовища.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно визначена мета цього дослідження, проаналізована наукова література з вивченої проблеми. Розроблено біосенсорні методи, механізми дії та причинні фактори їх модифікації групами органічних речовин води Нафтуся з”ясовані самостійно. Переважна більшість експериментів, присвячена вивченню імуномодулюючої дії води Нафтуся проведена особисто. Автор самостійно розробила підходи та змоделювала біотехнологію одержання біологічно активних речовин досліджуваної води.

Разом із С.В.Івасівкою виділено продукти мікробної біотрансормації озокериту методом ліофільної сушки та відтворено основні бальнеоефекти води Нафтуся в дослідах in vivo.Досліди з реєстрацією активності гладеньких м'язів проведені разом з В.П. Загороднюком та Є.Я. Баєвим. Статистична обробка результатів, їх узагальнення, інтерпретація та висновки здійснені самостійно.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи оприлюднено на: XXIX Всесоюзній нараді, присвяченій стану і перспективам розвитку методичних основ хімічного і біологічного моніторингу поверхневих вод суші (Ростов-на-Дону, жовтень 1987); Всесоюзній конференції Інституту геології АН УРСР (Київ, червень 1988 ); Республіканській наук.-практ. конф. "Шляхи зменшення антропогенного впливу на природні ресурси" (Одеса, жовтень 1990); регіональній наук.-практ. конф. "Актуальные вопросы санаторно-курортного лечения" (Ужгород, листопад 1990); II Республіканській наук.-практ. конф. дерматологів і курортологів "Курортні фактори Прикарпаття в медичній і соціальній реабілітації хворих дерматозами" (Львів, вересень 1991 ); наук.-практ. конф. "Нові підходи до організації і проведення лікування, реабілітації і рекреації в умовах курорту"(Трускавець, жовтень 1995); наук.-практ. конф. "Медична реабілітація потерпілих внаслідок Чорнобильської катастрофи" (Трускавець, травень 1996); розширеному засіданні лабораторії експериментальної бальнеології відділу фізіології водно-сольового обміну Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН(Трускавець, вересень 1997); засіданні сектору вісцеральних систем Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН (Київ, листопад 1997 ).

Публікації. Результати дисертації опубліковані в монографії, 8 статтях у наукових виданнях, 9 тезах з'їздів та конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 163 сторінках машинописного тексту, складається із вступу, аналітичного огляду літератури, опису методик досліджень, 5 розділів результатів власних досліджень, їх обговорення та висновків, списку 317 використаних літературних джерел. Дисертація містить 34 таблиці та 12 рисунків.

ЗМІСТ РОБОТИ

Досліджували мінеральну воду Нафтуся (МВН) свердловин (св) 1- НО, 8-НО, 16-НО, 21-Н Трускавецького родовища, а також слабомінералізовані води цього типу св. 18-КД Східницького родовища, св. 123 (Помірки), св. N 2 і N 3 (Гута), та джерела N 11 (Юзя). Відбір проб води проводили в стерильні флакони об'ємом 0,3 л, які досліджували не пізніше 3 годин з моменту відбору. В окремих серіях використовували МВН після 3-30-денного зберігання в аеробних чи анаеробних умовах. Вміст кисню контролювали потенціометрично аналізатором "Tlenomierz" (Польща). В частині дослідів з води попередньо видаляли мікрофлору з допомогою бактеріального фільтру ФМО2-1000 та мембрани "Ріпор-4". Проби зберігали в герметичних ємкостях при 9оС впродовж 30 діб.

Методи дослідження. Вивчення автохтонної мікрофлори МВН та її специфічних фізіологічних груп проводили згідно методичних рекомендацій. Визначення загальної кількості бактерій проводилось методом прямої мікроскопії у фазово-контрасному зображенні. Виявлення кількості мікроорганізмів трьох специфічних фізіологічних груп проводилось методом титрів на елективних живильних середовищах. А, саме, вуглеводеньокислючі мікроби (ВОМ) виділяли на середовищі Таусона, сульфатредукуючі мікроби (СРМ) - на середовищі Штурм, а тіоновокислі - на середовищі Бейєрінка. Оцінка життєдіяльності мікроорганізмів здійснювалась по зовнішніх ознаках росту, культуральних та ферментативних властивостях.

Для моделювання генезу гідрофільних сполук води Нафтуся ВОМ культивували з вуглеводневою сировиною нафтового походження: водовмісної породи трускавецького родовища МВН, жильного озокериту Бориславського рудного управління, бориславської нафти і хімічно чистого парафінового масла. Збагачену культуру ВОМ отримували шляхом багаторазових пересівів на середовище Таусона з вуглеводнями. Культуральну рідину (КР) ліофілізували на установці LZ- 9,2.Із сухого залишку мінеральних та органічних компонентів водною екстракцією виділяли гідрофільні органічні речовини (ОР).

В МВН, КР і водних витяжках вуглеводнів визначали вміст бактерій, концентрацію органічного вуглецю (Сорг), бітумів, амінів, карбонових кислот, кисню, величину Eh-потенціалу і pH.

Тестування бальнеоактивності МВН, КР і водних витяжок вуглеводнів здійснювали in vitro та in vivo. In vitro досліджували лактатдегідрогеназну (ЛДГ) активність методом Бергмейєра, активність бактеріальної альфа-амілази методом Сміта і Роя, активність Na,K-АТФази ентероцитів щура методом Cortas в модифікації О.М. Харламової, а також скоротливу та електричну активність ізольованих гладеньких м'язів (ГМ), (М.С. Яременко и др., 1989). В дослідах на щурах іn vivo досліджували активність триєдиної захисної системи організму: імунної, мікросомальної монооксигеназної (ММС) печінки та канальцевої секреторно-транспортної (КСТС) нирок. Стан імунної системи оцінювали по вмісту лейкоцитів у крові, фагоцитарній активності нейтрофілів, масі селезінки, показниках лейко-, та спленограми (М.А. Базарнова, 1982). Про активність ММС судили по тривалості барбітуратного сну; рівень КСТС оцінювали по швидкості екскреції фенолроту з сечею, введеного внутрішньом'язово (С.В. Івасівка, 1994).

Гель-хроматографію гідрофільних ОР МВН, КР та водних витяжок вуглеводнів здійснювали на нейтральному сефадексі G-10 (С.В. Івасівка, 1994).

Жирні кислоти (ЖК) з МВН і КР виділяли методом екстракції хлороформом при рН 3,0-4,0. Їх сумарний вміст визначали по концентрації СООН-груп. Для ідентифікації індивідуальних ЖК фракцію ЖК з КР аналізували на газо-рідинному хроматографі (ЛХМ- 8МД) з полум'яно-іонізаційним детектором. Біологічну активність ЖК, вилучених з МВН і КР, а також міристинової кислоти (С14), як представника карбонових (жирних) кислот МВН, вивчали по дії на Na,K-АТФазу і препарат ГМ.

Статистична обробка цифрового матеріалу проведена за критеріями t Student, T Wilcocson, U Wilcocson-Mann-Witney. Кореляційно-регресивний аналіз здійснено на комп'ютері за програмою Costat.

Результати дослідження. 1. Мікробна лактатдегідрогеназна активність - індикатор вод типу Нафтуся. Встановлено, що рівень ЛДГ у всіх досліджуваних водах корелював із чисельністю сульфатредукуючих мікроорганізмів. Загальна активність ЛДГ (пмоль/л*год) у воді св. 18-КД складала 16512, у воді Нафтуся (Трускавець) - 12410, у воді св. 123 - 855, тоді як у поверхневих водах - 202. Чисельність специфічних мікроорганізмів- вуглеводеньокислюючих та сульфатредукуючих (тис/л), висіяних з води св. 18-КД, складала 4,3, води Нафтуся (Трускавець) - 0,96, води св. 123 - 0,34. При цьому встановлено, що найвища активність ЛДГ притаманна групі анаеробних сульфатредукуючих бактерій, а саме, Desulfovibrio desulfuricans.

Встановлено, що вміст СРМ та ВОМ у МВН св. 21-Н св. 1-НО суттєво зменшувався у весняно-осінній період, досягаючи мінімуму на початку вересня з поступовим підвищенням до січня. Ця ж тенденція виявлена для загальної ЛДГ-активності мінеральної води, котра знижувалась в цей період у воді св. 21-Н з 14011 до 10510 (p<0,05) та св. 1-НО - із 19710 до 12010 (p<0,001). Варте уваги, що Eh-потенціал води св. 21-Н зростав у середньому з +60 до +100 мВ (p<0,001), св. 1-НО - із -50,7 до -36,7 мВ (p<0,05) у весняно-осінній період. Паралельно зростала концентрація кисню у воді св. 21-Н з 0,36 до 0,49 мг/л (p<0,05).

Допускалось, що й інтенсивна експлуатація свердловин Трускавецького родовища у весняно-осінній період посилювала сезонні коливання ЛДГ-активності. Виявлено зворотній від'ємний зв'язок між швидкістю відбору води та чисельністю сульфатредукуючих мікроорганізмів. Коефіцієнт кореляції для МНВ св. 1-НО складав 0,70 .

Таким чином, лактатдегідрогеназна активність мінеральної води Нафтуся віддзеркалює інтенсивність життєдіяльності СРМ та її зміни під впливом природних і антропогенних чинників. На підставі вище викладеного запропоновано спосіб ідентифікації мінеральних вод типу Нафтуся по їх власній ферментативній активності.

2. Вплив води Нафтуся на бактеріальну альфа-амілазу. Встановлено чітку активацію бактеріальної альфа-амілази нативною МВН, від 15% до 56%, залежно від водозабору. Найвища активуюча здатність властива воді св.1-НО - 6,170,36 мг/сек*мл проти 3,950,2 дистильованої води (p<0,001). Виявлено залежність ступеня активації від температури прогріву МВН і аерації. Так, прогрів МВН до 40оС впродовж 1 год з доступом кисню знижує активність альфа-амілази на 36%, а підвищення температури прогріву приводить до втрати впливу на біосенсор. Прогрів води в анаеробних умовах при 40оС впродовж однієї години денатурує активуючий фактор в меншій мірі. Водночас, деіонізована вода та сольовий аналог Нафтусі (САН) - розчин, що моделює її макроіонний склад (М.С. Яременко и др., 1989), є інертними щодо альфа-амілази, як і денатурована МВН. Отже, активація альфа-амілази in vitro є специфічним бальнеоефектом МВН.

Постійною складовою органічного комплексу МВН є фенольні сполуки, котрі, як відомо, стимулюють альфа-амілазу вже в мізерних концентраціях - 0,001-0,000001 М. Через те в пошуках ОР-активатора ферменту були протестовані саліцилова, корична, ванілінова кислоти у концентраціях, співставимих з МВН. Встановлено, що саліцилова кислота активує альфа-амілазу в розведеннях 0,00001 та 0,000001 М на 75% і 57% відповідно. Отже, можна допустити, що саме фенольні сполуки, як складові води Нафтуся, є активаторами альфа-амілази.

Карбонові кислоти також є постійними складовими органічного комплексу МВН, через що доцільно було дослідити їх вплив на альфа-амілазу. Встановлено, що вилучені з Нафтусі довголанцюгові карбонові кислоти (C16-C24) в концентраціях, ідентичних вмісту СООН-груп в мінеральній воді: 1) жирні кислоти в САН - 70 мкМ/л; 2) жирні кислоти в 10 мМ розчині NaCl - 70 мкМ/л, чинили гальмівну дію, подібну в двох варіантах - на 47% (p<0,001). Отже, отримані дані дозволяють допустити, що довголанцюгові жирні кислоти є інгібіторами бактеріальної альфа-амілази.

Таким чином, ступінь активації альфа-амілази водою Нафтуся різних свердловин визначався співвідношенням активаторів та інгибіторів ферменту. Найвищу активуючу здатність води св. 1-НО ми пояснюємо присутністю в ній фенолів рослинного походження в максимальних концентраціях для Трускавецького родовища ( С.В.Івасівка і ін., 1994).

3. Вплив води Нафтуся на Na,K-АТФазу ентероцитів. Вибір Na,K-АТФази, ключового фермента мембранного іонного транспорту, як біосенсора, зумовлений безпосередним контактом МВН із слизовою тонкого кишечника. Раніше в нашій лабораторії (О.Н. Харламова, М.С. Яременко, 1984) в дослідах in vivo було показано, що зниження активності Na,K-АТФази ентероцитів на 50% спостерігалось через 30 хв після введення МВН щурам per os.

Нами встановлено в дослідах in vitro, що гальмування активності Na,K-АТФази ентероцитів щура відбувалось при внесенні МВН в середовище інкубації ферменту в кількостях 0,001; 0,005; 0,01; 0,1; 1,0 та 10% від об'єму середовища. Ефект залежав від водозабору та об”єму МВН. Так, води св. 1-НО і св. 18-КД максимально (відповідно, на 47,34,9% і 46,04,8%, p<0,001) гальмували фермент у дозі 1% інкубаційного середовища. Вода св. 21-Н гальмувала Na,K-АТФазу на 41,93,6% (p<0,001), а вода джерела N 11 (Юзя) - лише на 17,92,1% у тій же концентрації. Навпаки, поверхнева (озерна) вода не змінювала активності ферменту (+3,60,3%). Отримані дані свідчать про специфічність дії МВН на транспортну Na,K-АТФазу мембран ентероцитів щура. Тобто, правомірно передбачати, що в МВН є специфічні БАР-інгибітори, котрі діють безпосередньо на фермент.

Водночас виявлено сезонні коливання активності Na,K-АТФази води Нафтуся свердловин Трускавецького родовища. Так, зниження гальмівної дії води св. 1-НО до -17,10,9%, в середньому, спостерігалося влітку. В деяких випадках МВН св. 21-Н та св. 1-НО літнього водозабору властивий навіть слабкий активуючий ефект. Навпаки, вода св. 18-КД, що є на самовиливі, стабільно гальмувала названий біосенсор.

Таким чином, ступінь інактивації Na,K-АТФази ентероцитів щура in vitro визначався співвідношенням інгибіторів та активаторів ферменту в комплексі БАР води Нафтуся. Їх вміст підлягав сезонним змінам і корелював з фізико-хімічними та мікробіологічними показниками, що свідчило про біогенне походження досліджуваних БАР.

4. Вплив води Нафтуся на загальну резистентність організму. Активація фагоцитарної системи . Встановлено, що 5-денне напоювання щурів МВН (св.21-Н) у дозі 3,0% м.т. (по 1,5% м.т. з інтервалом 5 год) щоденно завершувалось лімфоцитозом і моноцитозом крові та гіперплазією селезінки за рахунок суттєвого збільшення чисельності лімфоїдних елементів і тканинних макрофагів. Загальний вміст нейтрофілів крові, її фагоцитарна ємність (вміст фагоцитуючих нейтрофілів) та мікробна ємність (кількість поглинутих нейтрофілами мікробів) зростали. Навпаки, фагоцитарний індекс (активність фагоцитозу) залишався без змін, тоді як індекс перетравлювання (завершеність фагоцитозу) зменшувався.

Таким чином, МВН стимулює системи клітинного імунітету. При цьому, зниження ступеню завершеності фагоцитозу може свідчити про можливість гальмування продукції кисеньзалежних бактерицидних факторів нейтрофілами у зв'язку з антиоксидантними властивостями води.

Активація систем захисту організму від ксенобіотиків.Об'єктами дослідження були гідрофобна та гідрофільна фракції ОР з ліофілізованого порошку води типу Нафтуся св. 18-КД( Східниця). Препарати вводили щурам по 1,25 мл перорально, впродовж 7 днів. Встановлено, що гідрофобні ОР води відтворюють стимулюючий ефект МНВ на ММС та КСТС, тоді як гідрофільні ОР активуюють лише КСТС нирок. Аналогічні результати отримані і при курсовому введенні щурам даних препаратів доочеревинно (по 0,6 мл).

Паралельно досліджували фагоцитарну активність нейтрофілів. Встановлено, що гідрофобні ОР води типу Нафтуся підвищували фагоцитарний індекс (в%) з 33,53,2 (контроль) до 47,32,8 (p<0,01), тоді як гідрофільні ОР чинили протилежну дію, дещо знижували його - 30,33,0 (p>0,4).

Таким чином, ОР лікувальних вод типу Нафтуся активують ММС печінки, КСТС нирок та системи клітинного імунітету лімфоїдних органів у крові щурів, що стимулює загальну резистентність організму.

5. Зміни органічних речовин та бальнеоактивності води Нафтуся під впливом автохтонних мікроорганізмів. Зберігання МВН при температурі пласта, в присутності кисню, чи без нього, дозволяє вибірково простежити біотрансформацію органічних речовин її аеробними та анаеробними автохтонними мікроорганізмами. Встановлено, що зберігання МВН при вмісті кисню 2 мг/л, впродовж 30 діб, супроводжувалось збільшенням загальної чисельності мікроорганізмів в 2,3 р. впродовж 7 діб, після чого відбувалось поступове зменшення мікробного числа до 0,8 млн/мл на 30 добу. При цьому, ріст ВОМ у 8 р. зафіксований на 7 добу, проте, надалі, їх чисельність поступово зменшувалась до 85% вихідного рівня. Кількість тіоновокислих бактерій змінювалась аналогічно, лише не так різко, досягаючи максимальних значень (450 кл/мл, тобто 120%) на 7 добу, із поступовим зменшенням до 300 кл/мл на 30 добу зберігання. Навпаки, чисельність СРМ складала лише 230 кл/мл на 7 добу, та після 14 діб зберігання вони, дійсні анаероби, не висівалися зовсім.

Валовий вміст Сорг зменшувавсь несуттєво впродовж 14 діб аеробного зберігання МВН, в подальшому кількість знизилась на 50% від вихідного рівня до 30 доби. Водночас вміст бітумів зазнав деструкції (на 90%) впродовж 14 днів зберігання, тоді як концентрація амінів зменшувалась рівномірно, проте неухильно, впродовж місяця, до 16%. І, навпаки, вміст карбонових кислот зменшувавсь на 20% лише в перші 7 діб, а, потім, до кінця місяця, зростав на 30% вище вихідних цифр.

Таким чином, простежено інтенсивну життєдіяльність ВОМ, зниження вмісту бітумів, накопичення карбонових кислот при аеробному зберіганні МВН.

Зберігання води в анаеробних умовах супроводжувалось рівномірним та однозначним зменшенням мікробного числа з 2,6 до 0,5 млн/мл впродовж 30 діб. При цьому, максимальний ріст (у 4,2 рази) сульфатредукуючих бактерій, як дійсних анаеробів, виявлено на 7 добу. В подальшому їх чисельність поступово зменшувалася, проте, ще на 21 добу складала 123% від вихідного рівня. Максимальний ріст ВОМ (150% від вихідного рівня) спостерігали на 3 добу, з поступовим зменшенням їх чисельності до 88% через 30 діб зберігання. Навпаки, чисельність тіонових бактерій, як дійсних аеробів, після незначного росту (11%) на 3 добу, неухильно зменшувалася, досягаючи 30,9% від вихідного рівня на 17 добу зберігання.

Встановлено поступове підвищення вмісту Сорг при зберіганні МВН в анаеробних умовах. Так, вміст Сорг досягав максимуму (121% приросту) на 24 добу зберігання і залишався на 18% вище вихідного рівня на 30 добу. Вміст бітумів поступово зменшувався на 10% від вихідного рівня. Проте виявлено односпрямоване збільшення амінів (у 2 рази) та карбонових кислот (у 1,5 рази.) на 30 добу зберігання.

Аналізуючи зміни органічних речовин та автохтонних мікроорганізмів при аеробному і анаеробному зберіганні МВН, констатовано різке зменшення бітумінозних сполук (на 45%) з одночасним збільшенням чисельності ВОМ у 8 раз на 7 добу аеробного зберігання.Проте при безкисневому зберіганні встановлено ріст карбонових кислот (на 203, 6%), незначну деструкцію бітумів та збільшення ВОМ на 150% в цей період. Констатовано біогенне нагромадження карбонових кислот, амінів та Сорг.

Таким чином, провідна роль у деструкції бітумінозних сполук та нагромадженні водорозчинних ОР (карбонових кислот) належить автохтонним ВОМ води Нафтуся. Зокрема, інтенсивність асиміляції гідрофобних ОР в аеробних умовах у 5 разів вища, ніж в умовах без доступу кисню.

Встановлено, що бальнеологічна активність МВН по здатності гальмувати Na,K-АТФазу ентероцитів щура також змінювалось в процесі зберігання. Так, МВН зберігала гальмуючу здатність впродовж 14 діб при відсутності кисню. Навпаки, нативна і насичена киснем (17 мг/л) МВН втрачала інгібуючу здатність вже через 24 год зберігання, тоді як аерована безмікробна МВН - через 3 доби. В наступні дні проявляли дію активатори Na,K-АТФази, максимумально стимулювали фермент на 7 добу (107%). Проте, вже на 10 добу кількість активаторів швидко зменшувалась. Вода,котра містить 2 мг/л кисню, втрачала гальмівний вплив на фермент дещо пізніше (на 3 добу) та проявляла значно слабший активуючий ефект (50%) на 7 добу зберігання. Подібні результати отримані при тестуванні аерованої води на ізольованих препаратах ГМ та серця та на процеси кислотоутворення в шлунку собак (М.С. Яременко и др., 1989).

Таким чином, біотрансформація БАР МВН автохтонними мікроорганізмами строго залежала від кількості розчиненого у воді кисню. Показано, що інгибітори іон-транспортної АТФази та ГМ переважали у воді Нафтуся при відсутності кисню, і, навпаки, їх активатори домінували в аеробних умовах. Сумарний ефект МВН визначався кількісним співвідношенням інгибіторів та активаторів, що залежало від інтенсивності засвоєння бітумінозних сполук її ВОМ. Встановлено, що МВН втрачала бальнеоактивність на 10-20 добу зберігання в аеробних умовах.

Вияснення хімічної природи виявлених БАР та ролі окремих груп мікроорганізмів у їх генезі стало завданням наступних досліджень.

6. Моделювання генезу жирних кислот та дослідження їх ролі в бальнеоактивності води Нафтуся. Встановлено, що чотирьохтижнева інкубація автохтонних мікроорганізмів МВН з комерційним озокеритом супроводжувалась утворенням водорозчинних БАР (Івасівка С.В., 1994), природа котрих залишається невідомою. Керуючись літературними даними, що жирні кислоти є постійними складовими МВН у концентрації 0,01-0,1 мМоль/л (А.П. Ясевич, 1982; Г.С. Бегунова, 1986) та результатами власних досліджень, що ВОМ забезпечують вибіркове накопичення ЖК при аеробному зберіганні МВН, вважали за доцільне дослідити можливість утворення ЖК шляхом мікробної біотрансформації вуглеводневої сировини: водовмісної породи Трускавецького родовища Нафтусі, бориславського озокериту, нафти, парафінового масла.

Методом гель-хроматографії зідентифіковано 7 водорозчинних сполук ВОМ-метаболітів, 4 з котрих ідентичні гідрофільним ОР МВН.

Встановлено, що культуральна рідина (КР) здатна гальмувати Na,K-АТФазу в розведенні 1-0,01% до об'єму інкубаційного середовища на 6-12 добу культивування ВОМ. Вказаний ефект не залежав від використаної вуглеводневої сировини. Водночас, гальмівна здатність КР чітко корелювала із вмістом ЖК в ній, через це правомірно допустити, що саме ЖК є інгибіторами Na,K-АТФази. Для підтвердження цього допущення проведено серію експериментів з дослідження дії ЖК, виділених з води Нафтуся та культуральної рідини. Показано, що ЖК води Нафтуся (С16-С24) і КР (С9-С18), в дозі 0,1 мкМоль/л, вірогідно гальмували активність фермента, в середньому, на 26,51,5% (p<0,05) і 32,83,1% (p<0,01), відповідно. Доречно додати, що ефективність гальмування ЖК вказаного фермента рівнозначна розведенням нативної МВН.

Таким чином, отримані дані дозволяють стверджувати, що ЖК води Нафтуся утворюються в результаті біотрансформації вуглеводнів нафтового походження автохтонними ВОМ і є тими БАР, що зумовлюють гальмування Na,K-АТФази.

В дослідах in vivo встановлено, що ВОМ-метаболіти озокериту здатні активувати системи захисту організму від ксенобіотиків. Об'єктами дослідженя були гідрофобна та гідрофільна фракції ліофілізату КР. Препарати вводили щурам щоденно, по 1,25 мл перорально, або по 0,6 мл доочеревинно, впродовж 7 днів. Виявлено, що незалежно від способу введення, гідрофобні метаболіти стимулювали ММС печінки та КСТС нирок, а також підвищували фагоцитарний індекс нейтрофілів (у %) з 33,53,2 (контроль) до 41,03,9 (p<0,05), тоді як водорозчинні ОР закономірно стимулювали КСТС нирок, проте вірогідно знижували фагоцитарний індекс нейтрофілів (у %) - до 25,03,0 (p<0,05).

Таким чином, продукти біотрансформації вуглеводневої сировини автохтонними мікроорганізмами води Нафтуся відтворювали бальнеоактивність нативної мінеральної води при багаторазовому надходженні в організм.

ВИСНОВКИ

1. Лактатдегідрогеназна активність є біологічним індикатором вод типу Нафтуся і чітко корелює з чисельністю автохтонних сульфатредукуючих мікроорганізмів. Найвища питома активність бактеріальної лактатдегідрогенази притаманна анаеробним бактеріям- Desulfovibrio desulfuricans.

2. Бальнеоактивні органічні речовини води Нафтуся впливають на активність ферментів тонкого кишечника (індукують альфа-амілазу та інгібують іонтранспортні АТФази мембран ентероцитів). Вказані біосенсори запропоновано використовувати для вивчення біологічної активності мінеральних вод типу Нафтуся та інших мінеральних вод та лікарських засобів.

3. Мінеральна вода Нафтуся стимулює імуногенез за рахунок підвищення рівня мікро- та макрофагів, фагоцитарної та мікробної ємності крові, а також збільшення вмісту лімфоїдних елементів у селезінці при багаторазовому поступленні в організм. Потенційними активаторами імуногенезу є гідрофобні органічні сполуки води Нафтуся, котрі підвищують фагоцитарну активність нейтрофілів, тоді як гідрофільні речовини дещо знижують її.

4. Розроблені біосенсорні методи пропонуємо використовувати для коректного та швидкого моніторінгу змін бальнеоактивності органічних компонентів мінеральних вод типу Нафтуся, зумовлених антропогенними та природними чинниками.Вони дозволяють актуально застосувати заходи екологічної безпеки родовища.

5. Вуглеводеньокислюючі та сульфатредукуючі мікроорганізми є продуцентами водорозчинних біологічно активних речовин мінеральної води Нафтуся. При цьому, вуглеводеньокислюючі мікроби забезпечують вибіркове накопичення жирних кислот при культивуванні з вуглеводневою сировиною нафтового походження, а також при аеробному зберіганні мінеральної води.

6. Жирні кислоти води Нафтуся є інгибіторами Na,K-АТФази. Жирні кислоти, отримані шляхом мікробної біотрансформації вуглеводневої сировини, відтворюють гальмівний вплив нативної мінеральної води на мембранний іон-транспорний фермент.

7. Продукти біотрансформації озокериту асоційованою культурою вуглеводеньокислюючих мікроорганізмів відтворюють вплив води Нафтуся на системи захисту організму від ксенобіотиків. При цьому, гідрофобні органічні сполуки культуральної рідини, як і води Нафтуся, стимулюють мікросомальну монооксигеназну систему печінки, канальцеву секреторно-транспортну систему нирок і підвищують фагоцитарну активність нейтрофілів, тоді як гідрофільні метаболіти закономірно активують секреторно-транспортну систему нирок і знижують фагоцитарну активність нейтрофілів.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Яременко М.С., Ивасивка С.В., Попович И.Л., Билас В.Р., Ясевич А.П., Загороднюк В.П., Стеценко Г.И., Бутусова И.А., Прокопенко О.Н., Харламова О.Н., Лахин П.В., Баев Е.Я. Физиологические основы лечебного действия воды Нафтуся.- К.: Наукова думка, 1989.- 144 с.

2. Яременко М.С., Билас В.Р., Пащак Г.А. Термическая устойчивость аутохтонной, микрофлоры минеральной воды Нафтуся // Вопр. курортол.- 1987.- N 7.- С. 46-49.

3. Яременко М.С., Загороднюк В.П., Билас В.Р., Баев Е.Я., Харламова О.Н. Оценка биологической активности минеральной воды Нафтуся // Физиол. журн.- 1988.- 34, N 6.- С. 80-85.

4. Билас В.Р. Сезонные изменения микрофлоры и физико-химических характеристик минеральной воды Нафтуся курорта Трускавец //Курортология и физиотерапия.- Вып. 21.- К. Здоров'я, 1988.- С. 16-18

5. Яременко М.С., Билас В.Р., Загороднюк В.П. Исследование генеза и роли жирных кислот как биологически активных компонентов минеральной воды Нафтуся // Вопр. курортол.- 1989.- N 5.- С. 62-65.

6. Попович І.Л., Івасівка С.В., Аксентійчук Б.І., Ковбаснюк М.М., Білас В.Р. Активація органічними речовинами лікувальних вод типу "Нафтуся" систем захисту організму від чужерідних агентів // Медична реабілітація, курортологія, фізіотерапія.- 1996.- N 3(7).- С. 30-36.

7. Ковальчук Г.Я., Івасівка С.В., Попович І.Л., Білас В.Р.. Вплив води Нафтуся на процес ліпопероксидації та імунітет у щурів //Проблеми патології в експерименті і клініці.Т.17.-Львів, - 1996.- С.181-184.

8. Білас В.Р. Бальнеотехнологічне моделювання збагачення води "Нафтуся" бальнеоактивними компонентами // Проблеми патології в експерименті і клініці.Т.17.-Львів, - 1996.- С.194-198.

9. Величко Л.М., Алєксєєв О.І., Попович І.Л., Саранча С.М., Білас В.Р. Чи відображує лейкограма крові стан опірності організму? // Здобутки клінічної та експериментальної медицини.- Матер. 40-ї підсумкової наук. конф.- Вип.2, ч.1.- Тернопіль, 1997.- С. 60-62.

10. Ясевич А.П., Билас В.Р. Изменение органических веществ воды Нафтуся под влиянием аэробной и анаэробной микрофлоры // Тез. докл. XXIX Всесоюзн. совещ., посвящ. состоянию и перспективам развития методологических основ химического и биологического мониторинга поверхностных вод суши (Ростов-на-Дону, октябрь, 1987 г.).- Т.1.- Ростов-на-Дону, 1987.- С. 337-338.

11. Яременко М.С., Ясевич А.П., Билас В.Р. Влияние режима эксплуатации на состав и свойства воды Нафтуся // Гидрогеологические аспекты формирования и охраны минеральных вод Украины: Тез. докл. Всесоюзн. конф. Инст. геологии АН УССР (Киев, июнь, 1988).- К., 1988.-С. 30-31.

12. Билас В.Р., Загороднюк В.П. Влияние интенсивности отбора воды Нафтуся на ее биологическую активность // Пути уменьшения антропогенного воздействия на природные курортные ресурсы: Тез.док. Респ. науч.-практ. конф. (Одесса, 8-12 октября 1990 г.)- Одесса,1990.- С. 41-42.

13. Івасівка С.В., Ясевич А.П., Гавдяк М.В., Білас В.Р., Баєв Є.Я., Попович І.Л., Ковбанюк М.М., Павлик В.І., Унковська Д.М. Склад та властивості мінеральної води "Гута" // Актуальные вопросы санаторно-курортного лечения.- Матер. науч.-практ. конф.- Ужгород, 1990.- С. 37-39.

14. Івасівка С.В., Білас В.Р. Генез гідрофільних органічних сполук води "Нафтуся" // Курортные факторы Прикарпатья в медицинской и социальной реабилитации больных дерматозами: Мат. 2-й Респ. науч.-практ. конф. дерматологов и курортологов.- Львов, 1991.-С. 23-24.

15. Стеценко Г.І., Аксентійчук Б.І., Бейда П.А., Калмиков Л.З., Білас В.Р., Ковальський С.В., Сов'як С.Я. Радіаційне навантаження у дітей, потерпілих від Чорнобильської катастрофи, які оздоровлюються на курорті Трускавець // Нові підходи до організації і проведення лікування реабілітації та рекреації в умовах курорту: Матер. наук.-практ. конф.- Трускавець, 1995.- С. 48-50.

16. Саранча С.М., Панасюк Е.М., Попович І.Л., Гребінюк О.В., Сивохіп І.С., Денисов С.Г., Ягельська Г.С., Назаренко Н.К., Білас В.Р. Імунний статус школярів , проживаючих на радіаційно контрольованих територіях, і вплив на нього лікувальних факторів курорту Трускавець // Медична реабілітація потерпілих внаслідок Чорнобильської катастрофи: Тез. доп. наук.-практ. конф.- Трускавець, 1996.-С. 56-57.

17. Алєксєєв О.І., Панасюк Є.М., Попович І.Л., Бариляк Л.Г., Білас В.Р., Баєв Є.Я. Експериментальне і клініко-фізіологічне обгрунтування застосування бальзаму "Кримський" для підвищення ефективності реабілітації на курорті Трускавець потерпілих від Чорнобильської катастрофи // Медична реабілітація потерпілих внаслідок Чорнобильської катастрофи: Тез. доп. наук.-практ. конф.- Трускавець, 1996.- С. 75-77.

18. Білас В.Р., Карпа Г.В. Органічні компоненти води "Нафтуся" - модулятори ферментів тонкого кишківника (альфа-амілази та Na,K-АТФази) // 7-ий Укр. біохім. з”їзд. Тези доп.,ч.3.- Київ, 1997.- С.5.

АНОТАЦІЯ

мінеральний вода біологічний імуногенез

Білас В.Р. Бальнеоактивність органічних речовин води "Нафтуся" та підходи до моделювання їх походження.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.33- курортологія та фізіотерапія.- Міністерство охорони здоров”я України, Український НДІ медичної реабілітації та курортології , Одеса,1998.

Дисертацію присвячено дослідженню проявів бальнеоактивності окремих груп органічних речовин лікувальної води "Нафтуся" і виясненню їх походження. Виявлено нові ефекти "Нафтусі" in vitro та in vivo, чим розширено набір тестів для оцінки її бальнеоактивності. Вперше продемонстрована можливість отримувати бальнеоактивні чинники "Нафтусі" методом мікробної біотехнології із різноманітної вуглеводневої сировини (озокериту, нафти, парафіну). Розробки впроваджені в практику Трускавецької гідрогеологічної режимно-експлуатаційної станції та лабораторії експериментальної бальнеології і використовуються для моніторингу бальнеоактивності родовища, оцінки методів очищення води від аллохтонної мікрофлори, ідентифікації вод нововідкритих родовищ та свердловин на предмет приналежності до типу "Нафтуся".

Ключові слова: вода "Нафтуся", органічні речовини, автохтонна мікрофлора, мікробна біотехнологія, бальнеоактивність.

АННОТАЦИЯ

Билас В.Р. Бальнеоактивность органических веществ воды "Нафтуся" и подходи к моделированию их происхождения.- Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.33.- курортология и физиотерапия.- Министерство здравоохранения Украини, Украинский НДИ медицинской реабилитации и курортологии, Одесса,1998.

Диссертация посвящена исследованию проявлений бальнеоактивности отдельных групп органических веществ лечебной воды "Нафтуся" и выяснению их происхождения. Выявлены новые эффекты "Нафтуси" in vitro и in vivo, чем расширен набор тестов для оценки ее бальнеоактивности. Впервые продемонстрирована возможность получать бальнеоактивные начала "Нафтуси" методом микробной биотехнологии из различного углеводородного сырья (озокерита, нефти, парафина). Разработки нашли внедрение в практику Трускавецкой гидрогеологической режимно-эксплуатацион-ной станции и лаборатории экспериментальной бальнеологии при мониторинге бальнеоактивности месторождения, оценке методов очистки "Нафтуси" от аллохтонной микрофлоры, идентификации вод типа "Нафтуся" новых месторождений и скважин.

Ключевые слова: вода "Нафтуся", органические вещества, автохтонная микрофлора, микробная биотехнология, бальнеоактивность.

SUMMARY

Bilas V.R. The balneoactivity of the organic substances of the water "Naftussya"and modulation of their genesis.- The manuscript.

The thesis for the obtaining the Candidates Degree in Medical Science on the specialty 14.01.33 - balneology and physiotherapy. Ukrainian research institute medical reabilitation and balneology.Оdessa, 1998.

The thesis is dedicated to the analysis of the manifestation of balneoactivity of the separate groups of organic substance of the security water "Naftussya" and the elucidation of their genesis. It is elucidated the new effects of "Naftussya" in vitro and in vivo and that is why it is increased the set of the tests for the valuation its balneoactivity.

For the first time the possibility to get the balneoactive components of "Naftussya" with the method of the microbial biotechnology from different hydrocarbonic substances (oil, ozokerite, paraffin) is demonstrated.

The elaborations are put into the practice Truskavets hydrogeological a exploratory station and the laboratory of the experimental balneology and they are used for the monitoring of the balneoactivity of the deposit, the valuation of the methods of the waters purification from allokhtonic microflora, the identification of the water in the new deposits ("Naftussya"-fieds) and the pors as the object to discover the thype of the water like "Naftussya".

Key words: water "Naftussya", organic substances, autochtonicmicroflora, microbic biotechnology, balneoactivity.

Размещено на Allbest.ru

...