Підвищення ефективності пренатальної діагностики хромосомної патології

Размещено на http://www.allbest.ru/

УКРАЇНСЬКИЙ НАУКОВИЙ ГІГІЄНІЧНИЙ ЦЕНТР

ХЛІВНА Людмила Анатоліївна

УДК 618.3: 616-053.1/-076.5

ПІДВИЩЕННЯ ЕФЕКТИВНОСТІ ПРЕНАТАЛЬНОЇ ДІАГНОСТИКИ ХРОМОСОМНОЇ ПАТОЛОГІЇ

03.00.15 - генетика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

КИЇВ - 1998



Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Донецькому міжобласному медико-генетичному центрі МОЗ України.

Наукові керівники: доктор медичних наук

Арбузова Світлана Борисівна,

Донецький міжобласний

медико-генетичний центр,

завідуюча,

доктор медичних наук, професор

Бариляк Ігор Романович,

Український науковий

гігієнічний центр, директор.

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, ст. н. с.

Пілінська Марія Андріївна,

Інститут експериментальної

радіології наукового центру

АМН України,

завідуюча відділом цитогенетики,

кандидат біологічних наук, ст. н. с.

Стефанович

Ганна Володимирівна

Український науковий центр

медичної генетики, завідуюча відділом раннього розвитку людини.

Провідна установа: Національний Університет ім. Тараса Шевченка, Міністерство Освіти України, кафедра загальної та молекулярної генетики, м. Київ.

Захист відбудеться 28 січня 1999 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.604.01 Українського наукового гігієнічного центру, 253660, м. Київ-94, вул. Попудренка, 50.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Українського наукового гігієнічного центру,

Київ-94, вул. Попудренка, 50.

Автореферат розісланий 25 грудня 1998 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради ________ Селезньов Б.Ю.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Одною з важливих задач медичної генетики є профілактика хромосомних захворювань, які мають значну питому вагу в структурі причин дитячої смертності та інвалідності.

Актуальність проблеми посилюється високою популяційною частотою хромосомних синдромів, які виявляються у 7 з 1000 живонароджених дітей Бариляк І.Р., Гнатейко О.З., 1991. Частота найбільш поширеної патології - синдрому Дауна (СД) - складає в середньому 1 на 800-1100 новонароджених Лазюк Г.И., 1979; Бариляк І.Р. і співавт., 1984; Козлова С.И., 1987; Арбузова С.Б., 1996.

Ефективність пренатальної діагностики (ПД) хромосомних захворювань залежить, головним чином, від рішення двох питань - формування груп ризику, в яких проводяться інвазивні дослідження, та вибору методів, що використовують для цитогенетичної ПД. Враховуючи те, що переважна більшість хромосомних синдромів відносяться до мутацій «de novo», тільки розробка чітких критеріїв та ретельний відбір вагітних при призначенні інвазивної ПД може підвищити ступінь виявлення хромосомної патології водночас із зниженням обсягу виконуваних діагностичних маніпуляцій.

Формування груп ризику повинно здійснюватися з урахуванням особливостей популяції. Використання традиційного показання для проведення інвазивних досліджень - вік жінки більше 35 років - не може суттєво вплинути на популяційну частоту хромосомних захворювань в Україні, тому що кількість літніх вагітних не перевищує 9% Arbuzova S.B., 1997.

При виборі методів інвазивної ПД необхідною та обовязковою умовою є безпечність і висока інформативність дослідження. Таким вимогам перш за все відповідає трансабдомінальний амніоцентез (АЦ) Tabor A., 1988; Mennutі M., 1989; Wolstenholme J., 1994.

Проте, аналіз амніотичної рідини (АР) не одержав поширеного використання в Україні через трудомісткість дослідження та тривалий термін культивування, що пояснюється недосконалістю традиційно використовуємих культуральних методик Золотухина Т.В.,1980; Nadler H., 1969; Gregson N., 1970; Nelson M., 1973.

У звязку з вищезазначеним, метою дослідження є удосконалення методологічних та методичних підходів до допологової діагностики хромосомної патології.

Завдання дослідження.

1. Визначити можливості стимуляції росту амніоцитів одночасно зі зниженням витрат та часу, необхідних для культивування амніотичної рідини.

2.Розробити оптимальні умови отримання хромосомних препаратів високої якості з культури клітин амніотичної рідини.

3.Обгрунтувати діагностичну значущість переважного використання трансабдомінального амніоцентезу для ПД хромосомної патології.

4.Проаналізувати ефективність виявлення хромосомної патології в різноманітних групах генетичного ризику.

5.Встановити найбільш інформативні критерії формування потоків на інвазивну пренатальну діагностику.

Научна новизна досліджень.

1. Встановлено фактори, які впливають на тривалість строків культивування амніоцитів.

2. Запропоновано спосіб отримання високоякісних хромосомних препаратів з 25-30 метафазами на склі.

3. Вперше виконано роботу з порівняльноїй характеристики якості культури з клітин АР та готових хромосомних препаратів, в залежності від складу культуральних середовищ.

4. Запропоновано новий диференційований підхід до формування груп високого генетичного ризику з урахуванням віку вагітних, акушерського анамнезу, даних біохімічного та УЗ-скринінгів.

Теоретична та практична значущість дослідження.

1. Запропоновано модифіковану методику культивування та фіксації амніоцитів, яка дозволяє в найкоротший термін провести цитогенетичний аналіз.

2. Проведено підбір культуральних сумішів з оптимальним складом, який дозволяє знизити витрати робочого часу та реактивів, що використовуються при культивуванні та фіксаціі амніоцитів.

3. Запропоновано нові принципи до формування потоків на цитогенетичну допологову діагностику з розрахунком індивідуального ризику, які дозволяють підвищити ефективність виявлення хромосомної патології одночасно зі зниженням кількості проведених інвазивних досліджень.

4. Удосконалено традиційний підхід до призначення інвазивних досліджень вагітним віком понад 35 років.

Впровадження в практику.

Отримані дані покладені в основу призначення та проведення інвазивних досліджень в Донецькому ММГЦ. Модифікована методика культивування та фіксації амніоцитів використовується в ряді генетичних консультацій та центрів України.

Нові принципи формування груп високого генетичного ризику враховують при роботі з вагітними в жіночих консультаціях та пологодопоміжних закладах.

На підставі результатів роботи були запроваджені раціоналізаторські пропозиції: «Способ получения хромосомных препаратов из культуры лимфоцитов периферической крови»; «Способ получения хромосомных препаратов из культуры амниотической жидкости» (№№ 3416, 3417, 1996 г.).

Основні положення дисертації були розроблені в рамках Національної Програми «Діти України», затвердженою Указом Президента України №63/96 від 18.01.96.

Особистий внесок здобувача в проведення досліджень.

Дисертант особисто розробив і запровадив в практику Донецького міжобласного медико-генетичного центру модифіковану методику культивування та фіксації амніоцитів. Дисертантом особисто готувалися живильні середовища, які використовувалися для культуральних досліджень, виконувався цитогенетичний аналіз клітин амніотичної рідини, біоптату плаценти та пуповинної крові, проводився аналіз отриманих даних. Автором самостійно опрацьовані результати роботи та підготовлений текст дисертації.

Апробація результатів роботи.

Основні положення дисертаційної роботи доповідалися на: 2-му зїзді медичних генетиків України (жовтень 1995, Львів); конференціях по пренатальній діагностиці в Центральних та Східноєвропейських країнах (вересень 1996, Прага; червень 1997, Будапешт); 1-му Конгресі Української Асоціації спеціалістів ультразвукової діагностики в перинатології, генетиці та гінекології (травень 1997, Харків); обласних, міських та міжрайонних семінарах з медичної генетики (1993-1998 рр.).

Публікації.

З теми дисертації опубліковано 11 робіт, в тому числі 6 журнальних статей.

Обєм та структура роботи.

Дисертаційна робота викладена на 137 сторінках машинописного тексту у вигляді 5 розділів і складається з вступу, огляду літератури, опису об'єкту та методик дослідження, розділів власних досліджень, обговорювання результатів, висновків та списку літератури. Текст дисертації ілюстрований 15 таблицями та 20 малюнками. Список літератури містить 196 назв.



ЗМІСТ РОБОТИ

культивування амніотичний хромосомний трансабдомінальний

Матеріали та методи дослідження.

Комплексна пренатальна діагностика здійснювалася в Донецькому ММГЦ. Формування потоків на інвазивні дослідження виконувалося на підставі даних анамнезу, результатів цитогентичних досліджень, ультразвукового та біохімічного скринінгів.

Ультразвуковий скринінг проводився за схемою, запропонованою Гречаніною О.Я. (1992).

При аналізі маркерів материнської сироватки (МС) використовувалися розроблені базові та граничні значення альфа-фетопротеіну (АФП) та хоріонічного гонадотропіну (ХГ) для кожного тижня вагітності та їх зміну при хромосомних порушеннях у плода Николенко М.И., 1997. Комбінований ризик розраховували згідно принципу Wald і Cuckle (1988).

Для інвазивної ПД переважно використовувався трансабдомінальний амніоцентез. Основою для проведення досліджень стало удосконалення традиційного способу отримання хромосомних препаратів з культури АР. Модифікована методика була опрацьована на 150 культурах паралельно з культивуванням і фіксацією АР за класичною методикою Nadler, 1969; Gregson, 1970; Nelson, 1973.

Усього проведено 1603 амніоцентеза, 104 плацентоцентеза і 11 кордоцентезів. Аспірація матеріалу для інвазивних досліджень проводилась у терміні вагітності 14-25 тижнів під контролем ультразвукового сканеру Aloka - SSD 630.

Для оцінки хромосомного набору в клітинах плаценти аналізували препарати, виготовлені «напівпрямим» методом Кулешов Н.П., 1989.

Культивування пуповинної крові плода та периферичної крові батьків проводили за загальновизнаною методикою Hungerford D., 1965, використовуючи запропонований нами спосіб синхронізації мітозів в культурі - до початку фіксації культуру лімфоцитів витримували 2-2,5 години у термостаті з температурою 36 С.

Для отримання диференційного забарвлення хромосом, оцінки розмірів гетерохроматинових та ядерцеутворюючих районів використовували G-, C- і Ag- методи Селезнев Ю.В., 1972; Sumner, 1971; Bloom, 1976.

Математична обробка результатів виконувалась на компютері ІBM PC/AT 486 з використанням програми STATGRAPHІCS версії 3.0; Excel 5.0; SAS версії 6.04.

Результати досліджень та їх обговорення

Модифікація етапів культивування амніотичної рідини.

Були встановлені чинники, які впливають на тривалість культивування амніоцитів та якість хромосомних препаратів.

Практично в усіх існуючих на сьогодні методиках наступним за аспірацією АР проводять етап центрифугування отриманої рідини з метою відокремлення ембріональних клітин від іншої суміші. Під час центрифугування клітини можуть пошкоджуватися; крім того, при відокремленні надосадової рідини відбувається їх часткова втрата. Таким чином, в цій пробі АР первісно знижена проліферативна активність амніоцитів.

При усуненні етапу центрифугування АР, який виступає перед ставленням культури, через 72 години після початку культивування на дні флакону було відмічено значну кількість прикріплених до субстрату клітин. Крім того, до цього часу у 75% культур були сформовані колонії діаметром 2-3 мм. В паралельній культурі, де АР підлягала центрифугуванню, за аналогічний проміжок часу кількість прикріплених до культуральної поверхні клітин була значно меншою.

Важливим чинником, який сприяє скороченню часу культивування, є використання експериментально дібраних комплексних живільних сумішів, до яких входять синтетичні середовища Ham's F-10, Ham's F-12, RPMІ - 1640, а також ембріональна теляча сироватка (ЕТС) (80 та 20%, відповідно). При культивуванні АР на загальновизнаному середовищі Chang's, спеціально призначеному для стимуляції в'ялоростучих клітин та ліній Chang H., 1991, і комплексній живильній суміші, часових відмін не відзначено. Крім цього, вартість середовища Chang's майже в 10 разів перевищує вартість комплексного середовища.

Важливою перевагою запропонованої методики є те, що вона не потребує використання СО- інкубатора для культивування клітин АР, так як підібраний склад сумішів, до яких входить HEPES, дозволяє підтримувати оптимальний рівень кислотності (7.2-7.4). Відсутність СО-інкубатора часто виступає перешкодою використанню амніоцитів для цитогенетичної ПД, тому що всі традиційні методики адаптовані саме до цієї умові культивування клітин АР.

Ще одним культуральним заходом, який впливає на термін культивування, якість хромосомних препаратів та вартість обстежень, є зміна живильної суміші не раніше 5-6 доби. Наші дослідження довели, що, на відміну від класичних методик, немає потреби кожні 3-4 дні проводити зміну живильної суміші, тому що середовища складені з великим запасом поживних речовин, і на протязі зазначеного періоду часу вичерпання їх не відбувається. Першу зміну живильного субстрату проводили зa 16-18 годин до початку фіксації, синхронізуючи мітотичний розподіл клітин в культурі. Завдяки цьому, вдалося збільшити мітотичний індекс у 2-2,5 рази порівняно з аналогічною пробою АР, зафіксованою традиційним способом. Двократну зміну живильного середовища - на 5 добу та за 16-18 годин до початку фіксації - проводили лише в культурі з низькою проліферативною активністю.

Таким чином, внаслідок проведеної роботи, була запропонована удосконалена методика культивування та фіксації амніоцитів, що дозволяє протягом 7-9 діб, на відміну від класичної, яка потребуї 15-18 діб, отримати хромосомні препарати високої якості з 25-30 метафазами на склі (табл. 1, мал.1).

Таблиця 1

Якісно-часова характеристика традиційної то модифікованої методик

Методика, яка використовується	Період адгезії, доби	Період віднов-лення мітотичної активності, доби	Період форму-вання диферен-ційованого моно-слою, доби	Кількість метафаз на одному склі
Традиційна	5	5-8	15-18	10-15
Модифікована	3	3-5	7-9	25-30

Запропонована методика була апробована на паралельних культурах АР, яку аспірували в різних термінах вагітності. Часових відмін при культивуванні АР, отриманої з 16 по 25 тижні, не помічено. В процесі роботи з АР, яка була аспірована до 16 тижня, встановлено, що час культивування складас в середньому 14 діб. Тому, виконуючи ранні амніоцентези, для скорочення періоду культивування АР пропонується збагатити живільну суміш середовищем ІMDM.

Обгрунтування переважного використання трансабдомінального АЦ для цитогенетичної ПД.

Головною перевагою трансабдомінального амніоцентезу є його безпечність, що продемонстровано усіма дослідниками та було показано у нашій роботі. Ризик переривання вагітності після проведення цієї інвазивної маніпуляції, згідно з літературними даними, не перевищує 0,5-0,7% Бочков Н.П., 1982; Tabor A., 1988; Mennutі M.,1989. З 1603 діагностичних АЦ, проведених в ММГЦ м. Донецька, перериванням вагітності закінчилися 4 інвазивні маніпуляції, що склало 0,2% від загальної кількості обстежених. В одному з цих випадків була виявлена хромосомна патологія плода - трисомія 21.

Застосовуючи модифіковану методику, яка дозволяє отримати високоякісні хромосомні препарати при зниженні строків культивування АР, діагностичний амніоцентез виконувався як головний метод інвазивної діагностики хромосомних захворювань.

Як додаткові методи ми використовували плаценто- та кордоцентез. До методу кордоцентезу зверталися в крайніх випадках, що пояснюється складністю виконання та високим ризиком ускладнень після даної інвазивної маніпуляції Кулиев А.М.,1990; Nіcolaіdes K., 1986. В наших дослідженнях кордоцентез виконувався з метою верифікації діагнозу, а також при значному маловодді - коли аспірація навколоплодної рідини була неможлива.

Плацентоцентез проводили у випадках пізнього звертання жінки до МГЦ (у терміні вагітності 23-25 тижнів), в тому числі, при виявленні в цих строках УЗ-ознак хромосомної патології плода. Практично єдиною перевагою плоцентоцентезу були малі терміни субінкубування (2,5-3 години) отриманого біоптату. Провести якісний хромосомний аналіз у клітинах біоптату плаценти вдалося у 71% випадків. Невдачі при аналізі каріотипу в решті випадках були зумовлені наявністю великої кількості гіпоплоїдних пластинок внаслідок втрати хромосом під час мацерації тканини оцтовою кислотою (10,6%), низькою якістю хромосомних пластинок (10,7%), відсутністю метафаз на готових препаратах (4,8%) та малим обємом аспірованої тканини (2,9%). З аналогічними проблемами зустрічаються й інші дослідники, відмічаючи також і більш високий ризик ускладнень після даної маніпуляції у порівнянні з трансабдомінальним амніоцентезом Кулешов Н.П., Барцева О.Б., 1989; Wapner R., Jackson L., 1988.

Паралельно з плацентоцентезом виконували амніоцентези. Клітинну масу, потрібну для фіксації, отримували через 7-9 діб. З усіх проб АР були виготовлені високоякісні хромосомні препарати.

Суттєвою вадою плацентоцентезу є висока частота тканинного мозаїцизму, який реєструють, аналізуючи препарати з біоптату плаценти. В наших дослідженнях вона складала 5,4%, хоча в літературі вказують і більш значне число відсотків. Так, при цитогенетичному аналізі клітин плаценти у 4 випадках були відзначені хромосомні порушення: трисомія по хромосомах 21 (2 випадки) та маркерних хромосомах (mar = G та mar < E).

Тканинний мозаїцизм в АР практично не зустрічається Buі T. et al., 1984; Worton R., 1984. Аналізуючи хромосомні препарати, виготовлені з культури амніоцитів, ми зіткнулися лише з явищем помилкового (культурального) мозаїцизму, частота якого склала 2,9%, що узгоджується з літературними даними Masіs A., 1986; Krawczun M., 1989; Jha A., 1992.

Порівняння діагностичної значущості описаних методів демонструє перевагу трансабдомінального АЦ, безперечними і головними якостями якого є мінімальний ризик ускладнень, висока інформативність, а також найменше число відсотків мозаїцизму.

Виявлення хромосомної патології плода в різних групах генетичного ризику

В ході комплексної ПД різноманітний спектр хромосомних та геномних порушень в каріотипі плода був виявлений у 8% обстежених. В структурі геномних патологій значна питома вага нале-жала синдрому Дауна - 41,5%, синдрому Едвардса - 15,1% та синдрому Тернера - 15,1% (мал. 2).

Таблиця 2

Ступінь виявлення хромосомних порушень в каріотипі плода в різних групах генетичного ризику

Група ризику	Кількість амніоцентезів абсолютне / %	Кількість плодів з хромосомними порушеннями абсолютне / %
Вік матері більше 35 років	324/20,2	6/1,85
Високий комбінований ризик че-рез вік матері (більше 35 років) та ОАА	141/8,8	6/4,26
Високий комбінований ризик че- рез вік матері (більше 35 років) та рівень маркерів МС	242/15,1	33/13,60
Дитина з синдромом Дауна в анамнезі	128/8,0	1/0,78
Дитина з ПВР в анамнезі	55/3,4	-
Змінений рівень маркерів МС (вік матері менше 35 років)	579/36,1	55/9,50
Наявність хромосомної перебудо-ви в каріотипі батьків	30/1,9	15/50,0
Виявлені УЗ-маркери хромосом-ної патології	86/5,4	6/7,0
Захворювання, зчеплені зі статтю	18/1,1	-

Ступінь виявлення хромосомних аберацій плода варіювала в різних групах ризику і залежала від принципів їх формування.

Аналіз ефективності виявлення хромосомних патологій в трьох групах вагітних віком понад 35 років показав, що з 324 жінок, яким діагностичний АЦ був призначений тільки з причин віку, хромосомні порушення в каріотипі плода були виявлені лише у 6 обстежених, що склало 1,85%.

В другу групу літніх вагітних віднесені жінки з обтяженим акушерським анамнезом (ОАА), тобто наявністю спонтанних викиднів, тривалого безпліддя, порушень менструального циклу. В даній групі, сформованій на підставі врахування декількох показників, хромосомні аберації плода були виявлені у 6 з 141 обстеженої (4,26%).

Третю групу вагітних, направлених на інвазивну ПД, склали жінки, віком 35 років і більше, зі зміненим рівнем АФП і ХГ. Загальна кількість літніх жінок, обстежених на маркери МС складала 1970. На підставі результатів біохімічного скринінгу в групу ризику були віднесені лише 242 вагітні. Хромосомні порушення у плода виявлені у 33 обстежених, що склало 13,6%. Аналіз катамнестичних даних показав, що серед жінок віком понад 35 років, яким АЦ не був призначений, не зареєстровано випадків народження дитини з хромосомними захворюваннями. Таким чином, завдяки використанню скринінгу маркерів МС та диференційованому підходу до формування груп ризику, вдалося значно підвищити ступінь виявлення хромосомної патології одночасно з різким зниженням кількості інвазивних обстежень серед жінок старшого віку.

Традиційним показником до призначення діагностичного АЦ, крім віку матері, є наявність дитини з СД в анамнезі. Однак, за даними літератури, ризик повторного народження дитини з хромосомною патологією, зокрема з трисомісю 21, не перевищує 1% Mіlunsky A., 1979; Stene J. et al., 1984, що було підтверджено в ході нашого дослідження. Так, в результаті проведення цитогенетичної допологової діагностики 128 жінкам цієї групи, хромосомна патологія була виявлена лише у одного плода - 46, del(X) / 45, X0 - мозаїчна форма синдрому Тернера. Крім того, в 3-х випадках були діагностовані дефекти невральної трубки плода. Тобто, хоча ці жінки і відносяться до групи високого ризику, він не завжди пов'язаний з імовірністю народження дитини з хромосомною патологією. До цієї групи вагітних так само, як і до групи жінок, що мають в анамнезі дитину з природженими вадами розвитку (ПВР), треба використовувати диференційований підхід, враховуючи дані ультразвукового та біохімічного скринінгів при призначенні інвазивних досліджень.

Особливо актуальним є розрахунок індивідуального ризику з використанням рівня маркерів МС у жінок віком до 35 років. Завдяки масовому скринінгу вагітних на маркери МС, питома вага жінок цієї групи в структурі направлянь на АЦ склала 36,1%. Хромосомні порушення в каріотипі плода були виявлені у 9,5% випадків.

Показаннями до проведення діагностичного АЦ, які не потребують додаткового розрахунку індивідуального ризику, є наявність в каріотипі батьків геномних анеуплоїдій або хромосомних перебудов. В даній групі хромосомні порушення у плода були виявлені в 50% випадках, представлені в 36,7% сбалансованими транслокаціями, успадкованими від батьків і в 13,3% - несбалансованими.

Діагностичний АЦ проводили і тим жінкам, у котрих при ультразвуковому дослідженні (УЗД) плода в 2-му триместрі були виявлені специфічні для хромосомної патології маркери: шийна цистогігрома, збільшення розмірів шийної складки, пієлоектазія, гастромегалія, скорочення довжини стегна, порушення обєму навколоплодної рідини. Хромосомні захворювання в цій групі діагностовані у 3-х плодів з шийною цистогігромою, каріотип - 45,X0. Проведені дослідження узгоджуються з літературними даними, згідно яких інформативність УЗ- маркерів в 2-му триместрі не така значна, щоб вплинути на популяційну частоту хромосомної патології Brombatі B., 1995; Orlandі F., 1997. Згідно останніх даних, найбільш інформативним УЗ-маркером визнано комірцевий простір плода (nuchal transluency) в 1-му триместрі вагітності. Збільшення його розміру понад 2,5 мм в 85% випадків сполучується з трисомією 21 Nіcola1des K.,1992; Brіzot M., 1995. Такі зміни спостерігалися нами в 3-х випадках, в одному з яких діагностований СД.

Результати проведеного порівняльного аналізу ступеня виявлення хромосомних порушень вказують на необхідність використання диференційованого підходу до оцінки індивідуального ризику при призначенні інвазивної ПД.

Отримані дані лягли в основу запропонованої схеми формування груп ризику для проведення інвазивних досліджень, в якій взаємозвязок та спадкоємність методів комплексної ПД дозволяють підвищити ефективність виявлення хромосомних патологій плода (мал. 3).

Таким чином, підсумком проведеної роботи є розробка модифікованої методики отримання хромосомних препаратів високої якості з культури клітин амніотичної рідини, яка дозволяє широко використовувати діагностичний амніоцентез для пренатальної діагностики хромосомних захворювань, та удосконалення підходів до формування груп високого генетичного ризику.



ВИСНОВКИ

1. Отримання хромосомних препаратів високої якості з культури клітин амніотичної рідини при зниженні витрат та часу, потрібних для проведення досліджень, підвищує діагностичну значущість амніоцентезу, який являється найбільш безпечним та інформативним методом пренатальної діагностики хромосомних захворювань.

2. Усунення етапу центрифугування АР до ставлення її в культуру та використання комбінації середовищ RPMІ - 1640; Ham's F-10; Ham's F-12 з доданням HEPES скоротшує час культивування амніоцитів до 7-9 діб, а також не вимагає застосування спеціалізованих дорогих сумішів та СО-інкубатора.

3. Синхронізація мітотичного розподілу амніоцитів в культурі за 16-18 годин до початку її фіксації дозволяє отримати хромосомні препарати з 25-30 метафазами на склі.

4. Запропонована методика дозволяє отримати культуру клітин АР незалежно від термінів вагітності, на яких вона аспірована. Для скорочення періоду культивування АР, яка отримана раніш 16 тижня вагітності, до 9-10 діб, необхідно додаткове збагачення живильної суміші середовищем ІMDM.

5. Перевагою використання АЦ в 2-му триместрі вагітності є можливість більш старанного відбору груп високого ризику, що дозволяє підвищити ступінь виявлення хромосомної патологі при зниженні кількості проведених маніпуляційї .

6. Висока ефективність виявлення хромосомної патології плода, незалежно від віку жінки, досягається розрахунком індивідуального ризику, заснованому на комплексній оцінці результатів біохімічного скринінгу, даних УЗД та анамнезу.



Список опублікованых наукових робіт, які відображають основні положення дисертації

Арбузова С.Б., Хлевная Л.А., Казначеева Е.Б., Николенко М.И. Формирование групп риска и проведение инвазивной пренатальной диагностики // Цитология и генетика. - 1995. - Т.29, № 5. - С. 76-81.

Арбузова С.Б., Николенко М.И., Хлевная Л.А. и др. Пренатальная диагностика синдрома Дауна на основе биохимического скрининга маркеров материнской сыворотки // Цитология и генетика. - 1998. - Т.32, № 1. - С. 66-71.

Арбузова С.Б., Николенко М.И., Хлевная Л.А. и др. Динамика биохимических маркеров материнской сыворотки при различных хромосомных нарушениях плода // Цитология и генетика. - 1998. - Т.32, № 5. - С. 75-79.

Арбузова С.Б., Хлевная Л.А., Малова С.А. Усовершенствованная методика культивирования и фиксации амниоцитов человека // Биополимеры и клетка. - 1998. - Т.14, № 6. - С. 559-560.

Хлевная Л.А. Дифференцированный подход к формированию групп риска для проведения инвазивных исследований // Вопросы экспериментальной и клинической медицины.: Сб. статей. Донецкий Гос. мед. университет. - Донецк, 1997 - С. 179-181.

Арбузова С.Б., Ніколенко М.І., Малова С.А., Хлівна Л.А., Дружиніна О.М. Формування потоків для проведення пренатальноі діагностики в Донецькому міжобласному медико-генетичному центрі // Матеріали другого з'ізду медичних генетиків України. Львів, 1995. - С. 8.

Арбузова С.Б., Хлівна Л.А. Удосконалення класичноі методики культивування та фіксаціі амніоцитів // Матеріали другого з'ізду медичних генетиків України. Львів, 1995. - С. 9.

Хлівна Л.А. Випадок постійного маркеру у здоровоі жінки. Матеріали 1-го Конгресу Украінськоі Асоціаціі спеціалістів ультразвуковоі діагностики в перинатологіі, генетиці та гінекологіі. Харків, 1997. - С. 37-38.

Хлевная Л.А. Диагностика хромосомных заболеваний в межобластном медико-генетическом центре г. Донецка // Актуальные проблемы медицины Донбасса: Тез. науч. тр. молодых ученых и специалистов. Донецк, 1997. - С. 79-80.

Arbuzova S., Nіckolenko M., Khlevnaya L., Fedotova O. Complex prenatal dіagnosіs іn Donetsk іnterregіonal medіco-genetіc centre // Abstracts of 2nd PECO-EUCROMІC Congress, 1997. - P. 46.

Arbuzova S., Nіckolenko M., Khlevnaya L., Prenatal dіagnosіs of Down's syndrome іn the Donetsk regіon of the Ukraіne // Cesko-Slovenska Pedіatrіe, 1997. - N 7 (Specіal Іssue). - P. 510-511.



Анотація

Хлівна Л.А. Підвищення ефективності пренатальної діагностики хромосомної патології.

Рукопис дисертаціі на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук по спеціальності 03.00.15 - генетика (біологічні науки). Украінський науковий гігіснічний центр. Киів, 1999.

Встановлено фактори, що дозволяють скоротити час культивування амніоцитів до 7-9 діб. Розроблено оптимальні умови, завдяки яким зявилася можливість отримувати високоякісні хромосомні препарати з 25-30 метафазами на склі; запропонована модифікована методика була дозволяє проводити цитогенетичний аналіз плода в клітинах АР незалежно від термінів вагітності, на яких вона аспірована. Обгрунтовано діагностичну значущість переважного використання трансабдомінального амніоцентезу для пренатальної діагностики хромосомноїі патологіі. Визначено найбільш інформативні критерії формування груп високого генетичного ризику для проведення інвазивноі ПД.

З теми дисертації опубліковано 11 наукових робіт.

Ключові слова: інвазивні дослідження, трансабдомінальний амніоцентез, культура клітин, живильна суміш, диференційований підхід, група високого генетичного ризику.

Хлевная Л.А. Повышение эффективности пренатальной диагностики хромосомной патологии.

Рукопись диссертации на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика (биологические науки). Украинский научный гигиенический центр. Киев, 1999.

Эффективность пренатальной диагностики (ПД) хромосомной патологии зависит, главным образом, от решения двух вопросов:

разработки четких критериев формирования групп высокого генетического риска, что позволит повысить степень выявления патологии при снижении объема инвазивных исследований;

выбора наиболее информативного и безопасного метода кариотипирования плода, использование которого было бы доступно для широкого практического применения;

В связи с этим, целью настоящего исследования было усовершенствование методологических и методических подходов к дородовой диагностике хромосомной патологии.

Основой для проведения цитогенетических исследований явилась модификация традиционного способа получения хромосомных препаратов из культуры амниотической жидкости (АЖ), что было продиктовано несовершенством существующих методик.

Усовершенствованая методика была отработана на 150 культурах АЖ, аспирированной в различные сроки беременности. Были установлены факторы, влияющие на длительность культивирования амниоцитов, качество хромосомных препаратов, стоимость исследования; экспериментально подобран состав питательных сред; определены оптимальные условия стимуляции роста культуры клеток АЖ.

Предложенная методика позволяет при минимальных затратах в течение 7-9 дней, в отличие от классической, требующей 15-18 дней, получить хромосомные препараты высокого качества с 25-30 метафазами на стекле (по стандартной методике - 10-15 метафаз).

Применяя модифицированную методику, амниоцентез использовался в качестве основного метода инвазивной ПД. Проведено 1603 диагностических амниоцентеза. Широкий спектр хромосомных нарушений обнаружен в 123 случаях, степень выявления которых варьировала от 1,85% до 13,6% в различных группах риска и зависела от принципов их формирования.

Сравнительный анализ эффективности цитогенетической ПД показал, что использование только традиционных показаний к проведению исследований не может существенно повлиять на популяционную частоту хромосомной патологии. Предложена схема дифференцированного подхода к назначению инвазивной ПД, основанного на многофакторном анализе и расчете индивидуального риска.

Khlevnaya L.A. The іncrease of the effіcіency of chromosomal pathology' prenatal dіagnosіs.

The manuscrіpt of dіssertatіon for a Candіdate's degree іn Bіology, specіalіty 03.00.15- genetіcs (bіologіcal scіence). Ukraіnіan Scіentіfіc Hygіenіc Centre. Kyіv. 1999.

The facts reducіng the terms of amnіocyte's cultіvatіon had been esteblіshed. The optіmal condіtіons for the obtaіnіng of hіgh-qualіty chromosomal preparatіons wіth 25-30 metaphases on the glass had been elaborated. The proposed modіfіed method permіts to provіde fetus's cytogenetіc analysіs on the basіs of amnіotіc fluіd culture іrrespectіve of the term of іt's aspіratіon. The dіagnostіc sіgnіfіcance of the preferable use of transabdomіnal amnіocentesіs for the prenatal dіagnosіs of chromosomal patologіes had been founded. The most іnformatіve crіterіons of the formatіon of hіgh genetіc rіsk groups for іnvasіve prenatal dіagnosіs had been determіned.

11 scіentіfіc papers wіthіn the context of dіssertatіon had been publіsed.

Key words: іnvasіve іnvestіgatіons, transabdomіnal amnіocentesіs, culture of cells, feedіng mіxture, dіfferentіatіve approach, group of hіgh genetіc rіsk.

Размещено на Allbest.ru

...