Ноотропні речовини як модулятори центральної глутаматергічної синаптичної передачі

Размещено на http://www.allbest.ru

Академия медичних наук україни

інститут фармакології та токсикології

14.03.05-Фармакологія

АВТОРЕФЕРАТ

Дисертації на здобуття наукового

ступеня кандидата медичних наук

Ноотропні речовини як модулятори центральної глутаматергічної синаптичної передачі

Андрєєв Павло Володимирович

Київ 1999

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у Донецькому Державному медичному університеті ім. М. Горького Міністерства охорони здоров'я України

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор АБРАМЕЦЬ Ігор Ігоревич, Донецький державний медичний університет, професор кафедри фармакології

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор Громов Леонід Олександрович, інститут фармакології та токсикології АМН України, керівник відділу нейрофармакології;

доктор медичних наук, професор Мамчур Віталій Йосипович, Днепропетровська державна медична академія, завідувач кафедри фармакології

Провідна установа: Одеський державний медичний університет, м.Одеса, кафедра фармакології

Захист відбудеться 14 жовтня 1999р. о 1500 годині на засіданні спеціалізованної вченої ради Д 26.550.01 в Інституті фармакології та токсикології АМН Украіни (252057, м. Киів, вул. Е. Потьє, 14).

З дисертацією можна ознаймитись у бібліотеці Інституту фармакології та токсиколгії АМН Украіни за адресою: (252057, м. Киів, вул. Е. Потьє, 14).

Автореферат розісланий ”13” вересня 1999 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук І.В.Данова

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. За теперішнього часу більшість дослідників розглядає ноотропні речовини як нейрометаболічні церебропротективні засоби, які шляхом оптимізації обмінних процесів у нервових та гліальних клітинах поліпшують функціональний стан мозку і полегшують навчання, а також формування та вилучення пам??ятних слідів у людини і тварин (Вороніна Т.А. 1991; Ковалев Г.И. 1990; Heise G.A., 1987). Поряд з цим було встановлено, що пірацетам полегшуе синаптичну передачу в мозку, про що свідчить збільшення амплітуди трансклозальних відповідей, обумовлене його дією (Giurgea C., Moyersoons F., 1978). Але природа прямої синаптотропної дії ноотропів до 90-х років не досліджувалась. В 1990 - 1992 рр японські та американські дослідники довели, що один з аналогів наибільш поширеної ноотропної речовини пірацетама - анірацетам в мілімолярних концентраціях підвищує хемосенситивність постсинаптичних АМРА/каїнатних рецепторів (Ito I. et al., 1990; Lynch G. et al., 1991). Ці факти вказують на можливу пряму и первинну синаптотропну дію ноотропів.

Водночас були сформульовані думки щодо психотропних засобів, до яких відносяться і ноотропні засоби, як алостеричних і метаболічних модуляторів пластичних властивостей центральних синапсів (Коміссаров И.В., Абрамець И.И. 1994).

У звязку з цим висувається гіпотеза, згідно з якою ноотропні речовини можуть бути алостеричними і метаболічними модуляторами постсинаптичних глутаматних рецепторів (ГР), які беруть участь в генерації ЗПСП і забезпечують міжнейронну синаптичну передачу. Саме синаптотропна дія ноотропів дозволяє пояснити їх здатність оптимізувати пам??ять і навчання у інтактних тварин, і, з іншого боку, дати більш повні уявлення щодо природи іхньої нейрометаболічної дії. Крім того, розробка проблеми первинної синаптотропної дії ноотропів може стати теоретичою основою для пошуку фармакологічних речовин з потенційною антиамнестичною активністю.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота виконана в рамках планової тематики НДР кафедри фармакології Донецького державного медичного університету ім. М. Горького МОЗ України “Розробка принципів створення ноотропів та їх комбінацій на основі гіпотези про психофармакологічні речовини як модулятори ефективності міжнейронних синаптичних зв'язків. Державний реєстраційний номер 0195V0001245.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було створення на основі експериментальних фактів гіпотези щодо ноотропних речовин як метаболічних модуляторів хемосенситив-ності центральних постсинаптичних глутаматних рецепторів. Для досягнення вказаної мети було поставлено такі завдання:

1.Дослідження впливу ноотропів різної хімічної будови на постсинаптичні АМРА/каїнатні і НМДА глутаматні рецептори.

2.Вивчити вплив ноотропів на пластичні властивості центральних глутаматергічних синапсів.

3.Оцінити значення впливу ноотропів на постсинаптичні глутаматні рецептори з точки зору їх модулюючої дії на пластичні властивості синапсів.

4.Виділити нейронні та синаптичні ефекти ноотропів, які спроможні бути інформативними критеріями вибору фармакологічних речовин з потенційною ноотропною активністю.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що пірацетам у мікромолярних концентраціях та інші досліджені ноотропні засоби здатні підвищувати внутрішньоклітинну концентрацію Са2+ у пірамидних нейронах ділянки СА1 гіпокампу і зернистих клітинах зубчастої закрутки. Цей ефект опосередкований активацією ГТФ залежних білків (можливо Gp) і усуваєтся дантроленом натрію, який пригнічує вивільнення Са2+ із цистерн ендоплазматичного ретикулума. Доведено, що спричинене ноотропними речовинами підвищення внутрішньонейрональної концентрації Са2+ активує кальмодулін, Са2+/кальмодулінзалежну протеїнкіназу ІІ і протеїнкіназу С, котрі фосфорилюють внутрішньоклітинні домени НМДА глутаматних рецепторів і АМРА/каїнатних рецепторів. Фосфорилювання іонофорних глутаматних рецепторів (ГР) спричиняє збілшення їхної хемосенситивності. Виявлено, що здатність ноотропних речовин полегшувати індукцію і збільшувати тривалість НМДА-залежної та НМДА-незалежної форм тривалої посттенанічної потенціації синаптичної передачі зумовлена переважним підвищенням хемосенситивності АМРА/каїнатних рецепторів і лише частково НМДА глутаматних рецепторів, що спричинине дією ноотропних речовин.Вперше встановлено, що залежність дії ноотропних речовин від їх концентрації на клітинному рівні описуєтся кривою, що має дзвоноподібну форму. В основі екстремальної залежності концентрація - ефект ноотропних речовин лежить, можливо, гомо- та гетерологічна десенситизація ділянок специфічного зв'язування ноотропних речовин у мембранах нервових клітин.

Практичне значення одержаних результатів. Виявлення клітинних механізмів, за допомогою яких ноотропні речовини підсилюють відповіді нервових клітин, опосередковані активацією НМДА ГР та АМРА/каїнатних рецепторів, створює раціональні передумови для комбінованого застосування лікарських речовин з ноотропною активністью у розрахунку на феномен потенційованого синергізму. Виявлення на підставі кореляційного аналізу нейронних та синаптичних ефектів, спричинених ноотропними речовинами, котрі значимо корелюють з їхньою антиамнестичною дією, у дослідах, пов'язаних з вивченням поведінки, дає змогу рекомендувати здатність досліджуванних речовин підсилювати відповіді нервових клітин, опосередковані активацією АМРА/каїнатних рецепторів, і збільшувати тривалість тривалої посттетанічної потенціації (ТПТП) синаптичної передачі у зрізах гіпокампу гризунів як прогностичні критерії для скринінга фармакологічних речовин з потенційною ноотропною активністю.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робата виконана самостійно. Збір матеріалу, освоєння методів, проведення досліджень, визначення показників та статистична обробка результатів здійснені особисто, творчо узагальнено отримані результати, зроблено заключення та сформульовано висновки і практичні рекомендації.

Апробація результатів дисертації Результати наукових досліджень доповідались на симпозиумі - нараді “Экспериментальна фармакологія - клініці” (Вінниця 1992), на міжобластній науково-практичній конференції, присвяченній 25-річному ювілею кафедри хвороб вуха, горла і носа факультету удосконалення лікарів (Донецьк 1994), на науковій конференції “Актуальні проблеми медицини Донбасу” (Донецьк 1996), на XV з'їзді Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998). За матеріалами дисертації опубліковано 10 наукових робіт, з них - 3 статті у фахових наукових журналах. ноотроп глутаматний рецептор

Структура і обсяг роботи. Дисертація викладена на 152 сторінках машинописуі включає вступ, огляд літератури, опис матеріалів і методів дослідження, чотири розділи результатів дослідження з обговоренням, заключення, висновок, практичні рекомендації, список використаних джерел. Бібліографія містить 170 найменувань, в тому числі зарубіжних авторів - 149. Робота містить 13 таблиць, 19 малюнків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Досліди проводились на мотонейронах ізольованого спинного мозку жаб та на ізольованих функціонуючих зрізах гіпокампу щурів.

Для підтримування іонного гомеостазу і живлення препарати спинного мозку жаб та зрізи гіпокампу щурів суперфузували сольовим розчином стандартного іонного складу (Комиссаров И.В., Абрамец И.И. 1989,1990). Для підримки сталості газового складу середовища аерували газовою сумішшю, яка мала у собі 95% кисню і 5% вуглекислого газу. Температура розчину регулювалася термостатом і в експерименті на зрізах гіпокампу підтримувалася у межах 30-32 С, а в експерименті на спинному мозку становила 18 С. Перед виконанням досліду зрізи проходили період адаптації до сольового середовища протягом години.

У першій серії дослідів подразнення мотонейронів здійснювали двома шляхами. Перший спосіб був такий: через мікропіпетку, кінчик якої поміщали поблизу (10-30 мкм) від кінчика відвідного мікроелектрода, під тиском підводили L-аспарагинову (АК) и L-глутамінову (ГК) кислоти в концентрації 30 мМ. Також досліджували ЗПСП мотонейронів, спричинені електричним подразненням, що його завдавали в ділянці дорсальних корінців спинного мозку, бічних стовпів і ретикулярної формації довгастого мозку (ДК-ЗПСП). Стимуляцію здійснювали прямокутними імпульсами струму надпорогової величини тривалістю 0,1 мс, частотою 0,1-0,2 Гц. Досліди виконувались на мотонейронах с мембранним потенціалом не менш як -60 мВ, що суттєво не змінювався протягом 2-3 годин. Мембранний потенціал мотонейронів відводили за допомогою скляних мікроелектродів, заповнених розчином КСl в концентрації 3 ммоль/л.

Електричну стимуляцію зрізів гіпокампу щурів здійснювали прямокутними імпульсами струму надпорогової величини тривалістю 0,1 мс, частотою 0,1-0,2 Гц за допомогою біполярних ніхромових електродів діаметром 0,08 мм з відстанню між електродами 0,05 мм. Подразнення завдавали в ділянках: колатералей Шаффера в радіальному шарі СА1, хілуса зубчастої закрутки, де проходять волокна перфорантного шляху, молекулярного шару СА3, де проходять моховидні волокна, що йдуть від зернистих клітин зубчастої закрутки до проксимальних ділянок дендритів пірамідних нейронів СА3.

У другій серії дослідів реєстрували популяційні (п) ЗПСП пірамідних нейронів радіального шару ділянки СА1 і нейронів зубчастої закрутки (НЗЗ) гіпокампу. Відведення пЗПСП здійснювалось від апікальних дендритів на відстані 200-300 мкм від шару пірамідних нейронів за допомогою скляних мікроелектродів, заповнених ізотонічним розчином хлорида натрію з опіром кінчика 5-10 мОм.

Реєстровані потенціали були оцифровані за допомогою 10-розрядного АЦП з частотою 20кГц, оброблені на персональному комп?ютері IBM РС/АТ 386 і фіксовані на гнучких магнітних дисках.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Модулюючий вплив ноотропів на постсинаптичні НМДА ГР.

При суперфузії препарату спинного мозку сольовим розчином, що містив досліджувані ноотропи (пірацетам-100 мкМ, етімізол-100 мкМ, диметиламіноетанол (ДМАЕ) -1000 мкМ і карбацетам-30 мкМ), спостерігали збільшення амплітуди пізніх компонентів ДК-ЗПСП, а також амплітуди відповідей, спричинених АК (табл. 1).

В умовах блокади іонних каналів НМДА ГР кетаміном або іонами магнію ноотропні речовини не впливають на деполяризаційні відповіді, спричинені дією АК, і на залишкові компоненти полісинаптичних ДК-ЗПСП.

Повільний розвиток ефекту ноотропних речовин і його збереження після видалення їх із перфузійного середовища дає підставу думати про участь в реалізації потенціюючого впливу ноотропів вторинних посередників та активованих вторинними посередниками протеїнкіназ. Для перевірки цього припущення було вивчено вплив інгібіторів протеїнкінази А (бутамид 100 мкМ), кальмодуліну (трифторперазин 1 мкМ), протеїнкінази С (поліміксину В сульфат 250 мкМ) на ефекти ноотропів. На тлі суперфузії спинного мозку бутамідом відмічали майже цілковите пригнічення потенціюючого впливу етімізолу і зменьшення потенціюючого впливу пірацетаму на досліджувані відповіді мотонейронів незначно, але статистично достовірно зменшувався (табл. 1). В умовах блокади кальмодуліну відмічали істотне зменшення потенціюючого впливу ДМАЕ на досліджувані відповіді мотонейронів. Інгібування Са2+/діацилгліцерин-стимульованої протеїнкінази С поліміксином В сульфатом призводило до цілковитого пригнічення потенціюючого впливу карбацетаму на спричинені АК деполяризаційні відповіді і ДК-ЗПСП мотонейронів, не впливаючи на потенціюючі ефекти інших ноотропних речовин (табл. 1).

Таблиця 1.

Вплив інгібіторів протеїнкіназ та кальмодуліну на обумовлений ноотропами приріст амплітуд ЗПСП, спричинених аплікацією L-аспарагінової кислоти (АК) та стимуляцією дорсальних корінців (ДК-ВПСП) відповідей мотонейронів

Ноотропні речовини	Концентрація (мкМ/л)	Змінення амплітуд ЗПСП на фоні дії різних інгібіторів протеїнкіназ и кальмодуліну (МSх*t) в % к вихідної
		Контроль	Бутамід 100 мкМ/л	Трифтор- Перазин 1 мкМ/л	Поліміксину В сульфат 250 мкМ/л
		ДК-ВПСП	АК	ДК-ВПСП	АК	ДК-ВПСП	АК	ДК-ВПСП	АК
Пірацетам	100	127,55,5	133,55,8	113,52,2	111,52,4	129,04,7	129,54,3	125,0 4,6	131,04,9
Етімізол	100	132,53,7	139,03,9	104,52,2	107,52,1	128,53,9	135,54,1	133,5 3,8	132,03,6
ДМАЕ	1000	148,04,2	145,54,3	138,55,5	135,95,8	109,52,3	108,52,4	150,0 4,4	144,04,2
Карбацетам	30	135,04,6	142,54,9	133,04,0	145,04,6	127,04,1	139,04,4	107,0 2,2	109,52,3

*- величини статистично достовірно відмінні від контролю при Р=0,05

Таким чином антиамнестична дія етімізолу і пірацетаму можливо пов'язана з цАМФ-залежним фосфорилюванням НМДА рецепторно-канального комплексу. Дія ДМАЕ і карбацетаму пов'язана з фосфорилюванням НМДА ГР за допомогою Са2+-кальмодулінзалежної протеїнкінази II і протеїнкінази С відповідно.

У другій серії дослідів в якості моделі для дослідження відповідей нейронів гіпокампу щурів, опосередкованих активацією НМДА ГР, було використано короткотермінову потенціацію пЗПСП пірамідних нейронів ділянки СА1, спричинених електричною стимуляцією колатералей Шаффера, що була індукована 2-х хвилинною аплікацією НМДА (120 мкМ).

Досліджувані ноотропи по-різному впливали на потенціюючу дію НМДА на синаптичну передачу. На тлі попередньої дії протягом 15 хвилин на зрізи гипокампу пірацетаму (100 мкМ) спостерігали статистично недостовірну тенденцію до збільшення потенціюючого впливу НМДА на амплітуду пЗПСП пірамидних нейронів. На тлі впливу інших ноотропів НМДА спричиняв достовірно більше зростання амплітуди пЗПСП у порівнянні з контролем (табл. 2).

Ноотропні речовини призводили до збільшення амплітуди пЗПСП пірамидних нейронів ділянки СА1, спричинених електричною стимуляцією колатералей Шаффера (табл. 2).

В умовах блокади НМДА ГР потенціюючий вплив НМДА не розвивався, а потенціюючий вплив ноотропів на амплітуду пЗПСП, спричинених електричною стимуляцією коллатералей Шаффера, не змінювався.

Логічно припустити, що інгібітори кальмодуліну і протеїнкіназ можуть порушувати функцію НМДА ГР і в гіпокампі.

Таблиця 2.

Вплив ноотропних речовин на амплітуду пЗПСП пірамідних нейронів ділянки СА1 гіпокампу и спричинену НМДА їх короткотривалу потенціацію

Ноотропні речовини	Концентрація (мкМ)	Змінення амплітуди пВПСП (МSх*t) в % к исходной
		У відсутності НМДА	На тлі дії 120 мкМ НМДА	Вплив НМДА на тлі дії кетаміну (30 мкМ)
Контроль		100	125,75,3	103,32,2
Пірацетам	100	105,12,2	136,26,9	105,41,7
Етімізол	100	122,35,6	168,410,3	124,64,4
Нооглутил	20	114,53,3	176,416,2	115,33,9
Карбацетам	30	112,73,1	161,512,2	113,43,2

*- величини статистично достовірно відмінні від контролю при Р=0,05

На тлі дії інгібіторів відбувалося змінення потенціюючого впливу етімізолу, нооглутилу і карбацетаму на спричинену НМДА потенціацію синаптичної передачі. На тлі блокади протеїнкінази А бутамідом відмічали зниження потенціюючого впливу етімізолу на потенціацію синаптичної передачі. На ефекти нооглутилу і карбацетаму бутамід не впливав (табл. 2). Дія на зрізи трифторперазину і поліміксину В сульфату призводила до значного ослаблення впливу всіх ноотропних речовин на спричинювану НМДА короткотермінову потенціацію пЗПСП пірамідних нейронів (табл. 2.).

Проте дія пірацетама, а також інгібіторів кальмодуліну і протеїнкінази С на НМДА ГР в спінальних мотонейронах жаб і пірамідних нейронах гіпокампу щурів дещо розрізнялась. Ці відмінності можуть бути наслідком неоднакової морфофункціональної організації НМДА ГР пірамідних нейронів гіпокампу і спінальних мотонейронів. Крім того, у цих двох типів нейронів ділянки специфічного зв'язування ноотропів і НМДА ГР можуть мати різну локалізацію.

Модулюючий вплив ноотропів на постсинаптичні АМРА/каїнатні рецептори.

Дослідження впливу ноотропів на відповіді нейронів, опосредкоовані активацією АМРА/каїнатних рецепторів, проводили на пЗПСП зернистих нейронів зубчастої звивини (НЗЗ), які виникають при електричній стимуляції перфорантного шляху.

Відсутність впливу ноотропів на величину парного полегшення і збереження їх дії за умов блокади синаптичної предачі свідчить, що ноотропні речовини не впливають на пресинаптичне вивільнення глутамату.

На тлі дії інгібіторів гуанілатциклази (метиленовий синій 50 мкМ), кальмодуліну (сполука W-7, 10 мкМ), протеїнкінази А (бутамід 100 мкМ) і протеїнкінази (поліміксину В сульфат 100 мкМ) амплітуда пЗПСП НЗЗ, спричинених електричною стимуляцією перфорантного шляху, не змінювалася. Проте на тлі дії інгібітора кальмодуліну потенціююча дія ноотропів не розвивалася (табл. 3). Інгібування протеїнкінази С спричиняло специфічну депресію ефектів досліджуваних ноотропних речовин (табл. 3).

Таблиця 3.

Вплив інгібіторів протеїнкіназ, гуанілатциклази і кальмодуліну на ефекти ноотропних речовин.

Ноотропні речовини	Концентрація (мкМ)	Відносні зміни пЗПСП нейронів в % до вихідної, (МSх*t)
		У відсутності інгібіторів	На тлі попередньої дії протягом 30 хвилин
			Бутамиду (100 мкМ)	Метилено-вого синього (50 мкМ)	W-7 (10 мкМ)	Поліміксину В сульфат (100 мкМ)
Пірацетам	60	126.43,7	127.36,0	126.85,0	103.35,9*	88.314,2*
Етімізол	30	140.212,9	141.324,4	141.09,8	102.45,7*	44.214,9*
Карбацетам	6	145.916,3	153.613,5	153.217,1	106.27,2*	36.716,6*
Нооглутил	4	156.014,2	151.617,8	149.919,9	104.37,7*	55.311,5*

* - величини статистичесно достовірно відмінні від контролю при Р<0,05

На основі того, що інгібітор кальмодуліну пригнічує ефекти усіх ноотропних речовин, не впливаючи при цьому безпосередньо на амплітуду пЗПСП, можна припустити, що потенціюючий вплив ноотропів на відповіді НЗЗ, опосередковані активацією АМРА/каїнатних рецепторів, зумовлений підвищенням внутрішньо-нейрональної концентрації Са2+ та активацією високоафінного Са-зв'язуючого білка кальмодуліну, з наступною активацією останнім ферменту Са-кальмодулінзалежної протеїнкінази II.

Для визначення можливого джерела підвищення Са2+ вивчали дію на ефекти ноотропів речовин, які по-різному впливають на метаболізм кальцію у нервовій клітині.

Потенціюючий вплив ноотропних речовин змінювався тільки на тлі дії речовин, які впливають на вивільнення Са2+ з внутрішньоклітинних депо (табл. 4). Як на тлі блокади катіонних каналів НМДА ГР кетаміном, так і в умовах блокування потенціалзалежних Са2+-каналів, (низькопорогових і високопорогових) іонами нікелю і ніфедипіном відповідно, потенціюючий вплив ноотропів на відповіді нейронів зубчастої звивини гіпокампу, опосередковані АМРА/каїнатними рецепторами, не змінювався (табл. 4).

Таблиця 4.

Вплив речовин, які впливають на транспорт іонів Са2+, на ефекти досліджуваних ноотропних речовин.

Ноотропні речовини	Концентрація (мкМ)	Відносні зміни амплітуди пЗПСП в % до вихідної, (МSх*t)
		В відсутність речовин	На тлі попередньої дії протягом 30 хвилин
			Кетаміна (30 мкМ)	Нікелю хлоріду (30 мкМ)	Ортованадату натрія (0.3 мкМ)	Дантролену натрія (20 мкМ)	Ніфедипіну (10 мкМ)
Пирацетам	60	126.43,7	120.46,7	118.77,6	142.28,8	104.010,3*	122.23,1
Етімізол	30	140.212,9	147.713,4	149.313,7	164.913,1	115.78,8*	137.610,7
Карбацетам	6	145.916,3	152.415,7	147.715,8	175.115,2	120.410,7*	147.811,4
Нооглутил	4	156.014,2	150.315,4	155.415,7	182.416,1	114.37,7*	150.712,2

*- величини статистично вірогідно відмінні від контролю при Р<0, 05

Сукупність цих даних засвідчуе, що в основі спричиненого мікромолярними концентраціями пірацетаму та іншими досліджуваними ноотропними речовинами підвищення хемосенситивності АМРА/каїнатних рецепторів лежить підвищення внутрішньоклітинної концентрації Са2+ внаслідок вивільнення його з внутрішньоклітинних сховищ.

Водночас вищезгадані дослідження базуються на припущенні, що ноотропи певним чином активують сполучену з ГТФ-залежними білками фосфоліпазу С, оскільки їхні ефекти модулюються речовинами, які впливають на чутливі до інозитолполіфосфатів внутрішньоклітинні депо Са2+ (табл. 5). Для підтвердження цього припущення проведено серію дослідів з речовинами, які по-різному взаємодіють з ГТФ-залежними білками. Зокрема, використовували фторид алюмінію та мезатон, які активують мембранні ГТФзалежні білки, а також літію сульфат, котрий порушує пластичні властивості синапсів у гіпокампі та неостріатумі.

За умов активації ГТФзалежних білків фторидом алюмінію або мезатоном не спостерігали потенціюючого ефекту ноотропних речовин.

На тлі суперфузії зрізів сольовим розчином, що містив літію сульфат у концентрації 2мМ, потенціюючий вплив ноотропів виявлявся менше у порівнянні з їхньою дією в безлітієвому середовищі. Використання ноотропних речовин на тлі більш високої концентрації літію сульфату (20 мМ) мало наслідком більш чітке зниження їх потенціюючого впливу.

Вірогідно, що пірацетам в субмілімолярних концентраціях та інші досліджувані ноотропи за допомогою ГТФзалежних білків підсилюють гідроліз фосфоінозитидів і сприяють накопиченню в нейроні вторинних посередників Са2+ та діацилгліцерину, які, у свою чергу, активують протеїнкіназу С і кальмодулінзалежну протеїнкіназу II. Останні фосфорилюють канальні домени АМРА/каїнатних рецепторів, внаслідок чого зменшується їх десенситизація і збільшується амплітуда трансмембранних струмів, що лежать в основі моносинаптичних ЗПСП, які забезпечують міжнейронні зв'язки.

Модулюючий вплив ноотропів на глутаматергичну синаптичну передачу.

Наступним кроком у дослідженні впливу ноотропів на центральну глутаматергичну синаптичну передачу було вивчення впливу ноотропів на феномен тривалої посттетанічної потенціації (ТПТП) синаптичної передачі. Досліджено вплив ноотропних речовин на усі форми ТПТП.

Як модель для дослідження НМДА-залежної форми ТПТП синаптичної передачі використовували ТПТП, що виникала в синаптичній системі перфорантний шлях - зернисті клітини зубчастої звивини. Реєстрували пЗПСП нейронів зубчастої звивини, що спричиняються над - і підпороговою високочастотною тетанічною стимуляцією перфорантного шляху.

При використанні максимальних параметрів стимуляції ноотропні речовини суттєво не впливали на експресію ТПТП синаптичної передачі. При зменшенні інтенсивності тетанічних стимулів до рівня стимулів, що спричиняють пЗПСП зернистих клітин зубчастої звивини, також спостерігали розвиток ТПТП синаптичної передачі. Амплітуда пЗПСП зернистих нейронів зубчастої звивини зростала майже на 50% на 30 хвилині і поверталася до вихідних величин через 67.54,3 хвилин. Дія ноотропних речовин за умов максимальної надпорогової тетанічної стимуляції спричинялася до збільшення тривалості ТПТП синаптичної передачі на 15,52,3, 45,54,7, 72,44,8 і 88,79,2 хвилин для пірацетаму, етімізолу, нооглутилу і карбацетаму відповідно.На тлі використання ноотропних речовин за умов підпорогової стимуляції спостерігали розвиток ТПТП синаптичної передачі.

Дослідження впливу ноотропних речовин на НМДАнезалежну форму ТПТП синаптичної передачі проводили на синаптичній моделі: мохоподібні волокна-дендрити пірамідних нейронів ділянки СА3 гіпокампу.

Усі досліджувані ноотропні речовини збільшували тривалість ТПТП, а також спричиняли збільшення амплітуди ПС порівняно з контрольною экспресією ТПТП у цій синаптичній системі. Причому це було найбільш притаманно нооглутилу і карбацетаму, і мінімально - пірацетаму. Досліджувані ноотропні речовини у синапсах пірамідної ділянки СА3 полегшують індукцію ТПТП синаптичної передачі при тетанічній стимуляції мохоподібних волокон імпульсами підпорогової величини, які у відсутності попередньої дії ноотропів не здатні спричиняти тривалу потенціацію синаптичної передачі.

Як синаптичну модель для дослідження низькочастотної форми ТПТП синаптичної передачі використовували синапси, утворені дендритами пірамідних нейронів ділянки СА1 і колатералями Шаффера. Колатералі Шаффера подразнювали надпороговою низькочастотною тетанічною стимуляцією. Після тетанічного подразнення колатералей Шаффера протягом 10 - 15 хвилин спостерігалася зворотна депресія пЗПСП пірамідних нейронів ділянки СА1, коли амплітуда пЗПСП пірамідних нейронів ділянки СА1 зменшувалася на 20-30% щодо вихідної величини. Після цього, починаючи з 20-ї хвилини, спостерігалася відстрочена ТПТП синаптичної передачі, що досягала максимальної величини через 30-40 хвилини.

Вплив карбацетаму, нооглутілу та етімізолу на ТПТП синаптичної передачі в системі колатералі Шаффера - пірамідні нейрони ділянки СА1, спричинену низькочастотною стимуляцією, визначається трьома моментами: зменшенням депресії пЗПСП, збільшенням їх амплітуди і тривалості експресії ТПТП. Пірацетам послаблює вплив депресії пЗПСП пірамідних нейронів ділянки СА1, уповільнює спад ТПТП синаптичної передачі і не справляє істотного впливу на амплітуду пЗПСП. Найбільш активними щодо впливу на ТПТП синаптичної передачі, обумовленої низькочастотною тетанічною стимуляцією синаптичних входів, є нооглутил і карбацетам, менш активним етімізол.

Таким чином, вплив ноотропних речовин на різноманітні форми ТПТП синаптичної передачі визначається трьома ефектами: зниження порога ТПТП, збільшення амплітуди потенційованих ЗПСП та істотне збільшення тривалості ТПТП синаптичної передачі.

Останнім етапом у вивченні впливу ноотропів на центральну глутаматергічну синаптичну передачу було дослідження залежності ефектів ноотропних речовин від їхньої концентрації. Доведено, що залежність потенціюючого впливу ноотропних речовин на відповіді нейронів зубчастой звивини, опосередковані активацією АМРА/каїнатних рецепторів мала дзвоноподібну

Залежність НМДА потенціюючого ефекту від концентрації ноотропної речовини також мала екстремальний характер

Досліджували вплив різних концентрацій ноотропів на електричну збудливість нейронів гіпокампу, котру опосередковано оцінювали за амлітудою популяційних спайків пірамідних нейронів ділянки СА1 гіпокампу, спричинюваних електричним подразненням аксонів цих нейронів, що проходять в альвеолярному шарі. Всі ноотропи, що вівчались, викликали підввищення амплітуди популяційних спайків пірамідних нейронів ділянки СА. Цо свідчить про підвищення електричної збудливості ноотропами нервових клітин. Крива залежності доза - ефект також мала дзвоноподібну форм.

На підставі виявлених залежнотей різних ефектів, спричинених ноотропами, від їх концентрації розраховані величини ЕС50 ефектів ноотропних речовин, котрі наведені у таблиці 9. На підставі даних наведених в табл.9, зроблена матриця кореляції різних відов активності досліджуваних ноотропів, котра дозволяє висловити деякі думки щодо можливих зв'язків між клітинними та системними ефектами ноотропів. Встановлено статистично вірогідний кореляційний зв'язок (r=+0,9) між здатністю речовин збільшувати хемосенситивність АМРА/каїнатних рецепторів та можливістю пролонговувати ТПТП в синаптичній системі перфорантний шлях-зернисті клітини зубчастої звивини.

Досліджували вплив різних концентрацій ноотропних речовин на тривалість класичної НМДАзалежної форми ТПТП синаптичної передачі в системі перфорантний шлях - зернисті клітини зубчастой звивини. Встановлено що, ноотропні речовини концентраційнозалежним засобом збільшують тривалість НМДАзалежної форми ТПТП синаптичної передачі в системі перфорантний шлях - зернисті клітини зубчастой звивини.

Спричинене ноотропами збільшення амплітуді ЗПСП за рахунок зменшення десенситизації АМРА/каїнатних рецепторів сприяє активації більшого числа НМДА ГР (шляхом зменшення Мg блоку їх іонних каналів) протягом тетанічної стимуляції. Це забезпечує зниження порога індукції та збільшення тривалості експресії ТПТП синаптичної передачі. Таким чином, спричиненє ноотропами збільшення хемосенситивності АМРА/каїнатних рецепторів вносить значний вклад в індукцію та експресії ТПТП. В свою чергу підвищення хемосенситивності іонофорних глутаматних рецепторів не корелює з антиамнестичною дією ноотропів. З останнім видом активності ноотропів значимо корелюють (r=+0,7) обумовлені дією ноотропів підвищення електричної збудливості нейронів і пролонгування ТПТП синаптичної передачі.

Таблиця 8.

Величина ЕС50 (мкМ) різних эффектів досліджуємих ноотропних речовин.

Речовина	Підвищення хемосенситивності НМДА ГР	Підвищення хемосенситивності АМРА /каїнатних рецепторів	Підвищення электричної збудливості нейронів	Пролонгація ДПТП синаптичної передачі	Антиамнестична дія мкМ/кг
Пірацетам	213,2	8314	50,4	87077	1600450
Этимизол	112,4	273,8	0,70,1	111,9	62
Карбацетам	10,1	30,2	0,50,03	20,2	193
Нооглутил	0,80,1	1,30,1	0,40,02	1,50,1	163
Глицин **	0,50,3	-	-	222,4	1800450

*- дані запозичені з роботи (Комиссаров И.В., Лещинская Е.Я., 1995)

** - дані запозичені з роботи (Гарибова Е.Л. и соавт.,1990)

Виявлені на підставі кореляційного аналізу нейронні та синаптичні ефекти, спричинені ноотропними речовинами, котрі значно корелюють з їх антиамнестичною дією у дослідах, пов'язаних з вивченням поведінки дозволяє рекомендувати спроможність досліджуваніх речовин посилювати відповіді нервових клітин, опосередковані активацією АМРА/каїнатних рецепторів, і збільшувати тривалість тривалої посттетанічної потенціації синаптичної передачі в зрізах гіпокампу гризунов як прогностичні критерії для скринінга фармакологічних речовин з потенційною ноотропною активністю.

ВИСНОВКИ

Встановлено, що пірацетам, карбацетам, етімізол, нооглутил збільшують амплітуду відповідей спинальних мотонейронів, опосередкованих активацією НМДА глутаматних рецепторів. Карбацетам, етімізол, нооглутил, але не пірацетам, виявляють НМДА-сенсибілізуючу дію у дослідах на нейронах зрізів гіпокампу щурів.

Доведено,що спричинене ноотропами підвищення хемосенситивності НМДА глутаматних рецепторів має у своїй природі метаболічну модуляцію НМДА рецепторно-канальних комплексів, що зумовлена підвищенням активності протеїнкіназ і фосфорилюванням внутрішньоклітинних доменів рецепторів.

Встановлено, що пірацетам, карбацетам, етімізол, нооглутил у мікромолярних концентраціях збільшували амплітуду відповідей нервових клітин гіпокампу щурів, опосередкованих активацією АМРА/каїнатних рецепторів.

Сенсибілізуючий вплив пірацетаму, карбацетаму, етімізолу і нооглутилу на неНМДА глутаматні рецептори зумовлено підвищенням активності кальмодуліну, кальмодулінзалежної протеїнкінази ІІ и Са2+-діацилгліцеринзалежної протеїнкінази С, активність яких ноотропні речовини стимулюють за участю фосфоінозитидази С і регуляторних Gp-білків.

Виявлено, що досліджені ноотропні речовини полегшують індукцію та збільшують тривалість НМДАзалежної та НМДАнезалежної форм тривалої посттетанічої потенціації синаптичної передачі у різних синаптичних системах гіпокампу щурів.

Встановлено,що залежність впливу досліджених ноотропних речовин на хемосенситивність іонофорних глутаматних рецепторів і на тривалість пластичних синаптичних феноменів від їх концентрації описується кривою, що має дзвоноподібну форму. Зменшення еффектів ноотропних речовин в залежності від збільшення їх концентрації зумовлено гомо- та гетерологічною десенситизацією ділянок специфічного зв?язування ноотропів у мембранах нервових клітин.

Виявлено значимі кореляції між спричиненим ноотропними речовинами підвищенням хемосенситивності АМРА/каїнатних рецепторів і пролонгуванням тривалої посттетанічної потенціації та антиамнестичною дією ноотропів.

Як нейронні ефекти, що можуть бути використані для скринінга фармакологічних речовин з потенційною ноотропною активністю, рекомендується сенсибілізуючий вплив досліджених ноотропних речовин на відповіді нейронів, опосередковані активацією АМРА/каїнатних рецепторів, і здатність пролонгувати тривалу посттетанічну потенціацію синаптичної передачі у зрізах гіпокампу ссавців. Центральні нейрони жаб для відбору ноотропів непридатні.

CПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Абрамец И.И., Андреев П.В., Комиссаров И.В., Самойлович И.М., Титиевский А.В. Ноотропы потенцируют ответы нервных клеток, вызываемые активацией НМДА-глутаматных рецепторов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-1993.-№1.-С.51-53.

Абрамец И.И., Андреев П.В., Комиссаров И.В., Самойлович И.М. Потенциация ноотропами нейронных ответов, опосредуемых активацией не НМДА глутаматных рецепторов // Нейрофизиология.-1994.-Т.26, №5.-С.365-372.

Абрамец И.И., Андреев П.В., Самойлович И.М. 2,4-динитрофенилглицин как агонист метаботропных глутаматных рецепторов // Архив клинической и экспериментальной медицины.-том.7, №2.-С.156-160.

Андреев П.В. Влияние ноотропов на ответы нейронов, опосредованные НМДА глутаматными рецепторами // Вопросы экспериментальной и клинической медицины (сборник статей).- Донецк.:“Лебедь”.-выпуск 2, том 1.-1998.-С.8-10.

Андреев П.В. Влияние ноотропных веществ на длительную посттетаническую потенциацию в различных синаптических системах гиппокампа крыс // Вопросы экспериментальной и клинической медицины (сборник статей).- Донецк.:“Лебедь”.-выпуск 3, том 1.-1999.-С. 5-8.

Андреев П.В. Количественные закономерности действия ноотропных веществ // Вопросы экспериментальной и клинической медицины (сборник статей).- Донецк.:“Лебедь”.-выпуск 3, том 2.-1999.-С.-9-11.

Абрамец И.И., Самойлович И.М., Андреев П.В. Нейронная модель для отбора фармакологических веществ с потенциальной антиамнестической активностью // Експериментальна фармакологія - клініці (тези доповідей).-Вінниця-Київ,1992.-С.3-4.

Абрамец И.И., Андреев П.В. Ноотропы как модуляторы хемосенситивности постсинаптических глутаматных рецепторов // Материалы межобластной научно-практической конференции посвященной 25-летнему юбилею кафедры болезней уха горла и носа факультета усовершенствования врачей.-Донецк, 1994.-С.70.

Андреев П.В. Участие протеинкиназ и других внутриклеточных ферментов в потенциирующем влиянии ноотропов на ответы нейронов, опосредуемые активацией не НМДА глутаматных рецепторов // Актуальные проблемы медицины Донбасса (тезисы докладов научной конференции).-Донецк, 1996.-С.11.

Андреєв П.В. Адекватність використання мотонейронів спинного мозку жаби як моделі для дослідження взаємодії ноотропів і глутаматних рецепторів // Фізіологічний журнал.-1998.-том 44, №3.-С.14.

АННОТАЦІЇ

Андрєєв П.В. Ноотропні речовини як модулятори центральної глутаматергичної синаптичної передачі.-Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за фахом 14.03.05 - Фармакологія. Інститут фармакології та токсикології АМН України, Київ, 1999 .

Захищається наукова праця, котра містить експериментальні дані щодо ноотропних речовин як метаболічних модуляторів хемосенситивності центральних постсинаптичних глутаматних рецепторів. Доведені результати дослідження впливу ноотропних речовин на функції постсинаптичних АМРА/каїнатних, НМДА глутаматних рецепторів в центральних нейронах жаб і щурів, на феномен тривалої посттетанічної потенціації в нейронах гіпокампу щурів. Доведено, що в основі підвищення хемосеситивності постсинаптичних глутаматних рецепторів єопосередкованє ГТФзалежними білками підвищення внутришньонейрональної концентрації Са2+ з послідовною активацією кальмодуліну, Са/кальмодулінзалежної протеїнкінази ІІ і протеїнкінази С. Активація протеїнкіназ сприяє фосфорилюванню внутришньоклітинних доменів глутаматних рецепторів і підвищенню їх хемосенситивності.

Здатність досліджуваних речовин підсилювати ефекти нервових клітин, опосередковані активацією АМРА/каїнатних рецепторів, та збільшувати тривалисть тривалої посттетанічної потенціації у зрізах гіпокампу гризунів можуть бути використовані як критерії для скринінгу речовин с потенційною ноотропною активністю.

Ключові слова: ноотропи, модуляція, глутаматні рецептори, гіпокамп, глутаматергічні синапси.

Андреев П.В. Ноотропные вещества как модуляторы центральной глутаматергической синаптической передачи.-Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.05. - Фармакология. Институт фармакологии и токсикологии АМН Украины, Киев, 1999 .

Диссертация посвящена изучению механизмов действия ноотропных средств, поиску новых методов для отбора средств с потенциальной ноотропной активностью. Цель работы заключалась в формировании на основе экспериментально полученных данных гипотезы о ноотропных веществах как метаболических модуляторах хемосенситивности центральных постсинаптических глутаматных рецепторов. В первой части работы изучено влияние ноотропных веществ (пирацетама, диметиламиноэтанола, этимизола, нооглутила и карбацетама) на постсинаптические АМРА/каинатные и НМДА глутаматные рецепторы в центральных нейронах лягушки и крысы. Установлено, что в основе повышения хемосенситивности постсинаптических глутаматных рецепторов лежит опосредованное ГТФ-зависимыми белками повышение внутринейрональной концентрации Са2+ с последующей активацией кальмодулина, Са/кальмодулинзависимой протеинкиназы II и протеинкиназы С. Активация протеинкиназ приводит к фосфорилированию внутриклеточных доменов глутаматных рецепторов и повышению их хемосенситивности.

Во второй части работы приведены результаты исследования влияния ноотропных веществ на феномен длительной посттетанической потенциации синаптической передачи в нейронах гиппокампа крысы. Ноотропные вещества облегчали индукцию, а также увеличивали продолжительность длительной посттетанической потенциации синаптической предачи, что убедительно доказывает потенцирующее действие ноотропов на центральную глутаматергическую синаптическую передачу. Показано что в основе потенцирующего влияния ноотропов на синаптическую передачу лежит модулирующее влияние ноотропных веществ на постсинаптические глутаматные рецепторы.

Также исследованы количественные закономерности действия ноотропных веществ на рецепторном и синаптическом уровнях. Показана экстремальная форма зависимости эффектов ноотропных веществ от их концентрации. Снижение эффектов ноотропных веществ по мпере увеличения их концентрации объясняется гомо- и гетерологической десенситизацией участков спецефического связывания ноотропов. Установлена достаточно тесная корреляционная связь между способностью ноотропных веществ к повышению хемосенситивности АМРА/каинатных рецепторов и пролонгацией длительной посттетанической потенциации синаптической передачи. Однако повышение хемосенситивности ионофорных глутаматных рецепторов не корелирует с антиамнестическим действием ноотропов. С антиамнестическим действием значительно корелируют вызываемое ноотропами повышение электрической возбудимости нейронов и пролонгирование длительной посттетанической потенциации синаптической предачи.

Способность исследуемых веществ усиливать ответы нервных клеток, опосредованные активацией АМРА/каинатных рецепторов, и увеличивать продолжительность длительной посттетанической потенциации в срезах гиппокампа грызунов предложена в качестве критериев для скрининга веществ с потенциальной ноотропной активностью. Зделан вывод о нецелесообразности использования мотонейронов спинного мозга лягушки в качестве модели для отбора фармакологических веществ с потенциальной ноотропной активностью.

Ключевые слова: ноотропы, модуляция, глутаматные рецепторы, гиппокамп, глутаматергические синапсы.

ANNOTATION

Andreev P.V. Nootropic drugs as modulators of central glutamatergic synaptic transmission.-Manuscript. Dissertation for seeking a degree of kandidate of medical sciences in speciality 14.03.05 - Pharmacology. Institute of Pharmacology and Toxicology of AMS of Ukraine, Kiev, 1999.

It is defending a scientific work which contains experimental data about nootropic drugs as metabolic modulators of chemosensitivity of central postsynaptic glutamate receptors. There were adduced results of iinvestigation of the nootropic drugs' influence on the functions of postsynaptic kainate receptors in central neurons of the frog and the rat, on the phenomenon of long-term potentiation in the hippocamp's neurons of the rat. It is established that modulated by GTP-depending proteins increase of intraneuronal concentration Ca2+ with subsequent activation ofcalmodulin, Ca/calmodulin-depending protein kinase II and protein kinase C. Activation of protein kinases leads to phosporylation of intracellular domains of glutamate receptors and their chemosensitivity increase.

The ability of examined substances to intensify responses of nerve cells, mediated by activation of kainate receptors and to increase duration of long-term potentiation in the hippocamps sections of the rodents were offered as criteria for screening of substances with potential nootropic activity.

Key words: nootropic drugs, modulation, glutamate receptors, hippocamp, glutamatergic synapses.

Размещено на Allbest.ru

...