Морфофункціональна характеристика оксидантної активності нейтрофільних гранулоцитів крові

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Морфофункціональна характеристика оксидантної активності нейтрофільних гранулоцитів крові

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Загальна характеристика роботи

нейтрофільний гранулоцит запалення

Вступ

Актуальність теми. Нейтрофільні гранулоцити (НГ) - фагоцитуючі клітини, які належать до найбільш філогенетично древньої ланки імунітету. Від ефективної дії клітин значною мірою залежить неспецифічна резистентність організму. Крім того, встановлено, що НГ є універсальними індикаторами будь-яких змін гомеостазу і важливою ланкою в ініціації імунних реакцій (Г.М. Бутенко, 1998; К.Ф. Чернушенко, 1997; O.W. Bjerrum, 1993; M. Kopes, 1992).

НГ мають різнобічний, потужний ефекторний потенціал, що забезпечує реалізацію захисних функцій організму. Одна з найбільш значущих функцій - антибактеріальна. ЇЇ ефективність та адекватність реакції на бактеріальне подразнення забезпечує киснезалежна система НГ. Реалізація бактерицидного механізму відбувається за рахунок утворення активних оксидантів та ферменту азурофільних гранул - мієлопероксидази (Ю.А. Мазинг, 1991; С. Dehloren, 1993).

В умовах патології, коли НГ зазнають постійного впливу різних подразливих факторів, відбувається виснаження бактерицидного потенціалу, що, в свою чергу, веде до загострення запальних захворювань та розвитку гнійно-септичних ускладнень (A. Carthy та співавт., 1991).

В науковій літературі недостатньо висвітлені зв'язки між оксидантною активністю (ОА) НГ та характером структурних змін цих клітин. Тому існує необхідність розробки морфофункціональних критеріїв оцінки стану НГ для індивідуальної оцінки ОА НГ крові в умовах клінічної патології, які дозволять визначити рівень та резервні можливості цього механізму захисту організму.

Зв'язок роботи з науковими програмами. Дисертаційна робота виконана в межах галузевої наукової програми Інституту клінічної та експериментальної хірургії АМН України за темою «Розробка нової неінвазивної технології управління клітинними механізмами неспецифічного захисту у хірургічних хворих», номер державної реєстрації 0193ИО42738.

Мета та задачі дослідження. Мета роботи - встановити зв'язок між особливостями структури НГ і рівнем ОА крові; розробити морфологічні критерії оцінки ОА НГ крові.

Для досягнення мети визначено такі задачі:

Вивчити ультраструктурну організацію неактивованих та активованих НГ.

Вивчити морфометричні характеристики НГ та виділити найбільш інформативні параметри клітин на ультраструктурному та світлооптичному рівнях.

Порівняти особливості будови НГ зі станом їх ОА.

Співставити результати ультраструктурних та світлооптичних методів досліджень.

Вивчити морфо-функціональну характеристику НГ в залежності від характеру запалення.

Наукова новизна одержаних результатів. Проведені дослідження дозволили встановити ряд нових положень: деякі якісні та кількісні особливості будови активованих НГ з різним рівнем ОА крові; морфо-функціональну характеристику НГ як системи; критерії морфо-функціональної недостатності (МФН) системи НГ; взаємозв'язок ступеня МФН системи НГ та рівня ОА крові; підвищення індексу люмінолзалежної хемілюмінесценції є не тільки результатом активації клітин, але й перекисного окислення ліпідів пошкоджених клітинних мембран; можливість використання морфометричних параметрів (площі клітин та оптичної щільності цитоплазми) для об'єктивної оцінки ОА крові; взаємозв'язок ступеня МФН системи НГ і характеру запалення.

Практичне значення одержаних результатів. Вище зазначені наукові розробки мають безпосередній вихід в клінічну практику, оскільки дозволяють шляхом оцінки простих морфометричних параметрів (площі клітин та оптичної щільності цитоплазми) дати індивідуальну оцінку стану системи НГ і визначити ступінь недостатності, що, в свою чергу, дозволяє встановити прогноз і вибрати більш обгрунтовану тактику лікування хворих.

Рекомендовано МОЗ України для впровадження в роботу клінічних лабораторій розроблений метод діагностики та контролю ефективності лікування післяопераційних гнійно-септичних ускладнень (інформаційний лист МОЗ України від 12.03.93.); методи визначення фагоцитарної активності лейкоцитів крові (інформаційний лист МОЗ України від 08.06.94) та резерву захисних сил організму (інформаційний лист МОЗ України від 8.06.94).

Особистий внесок дисертанта. Автором самостійно здійснені: відбір, розробка та впровадження методів дослідження НГ крові (ультраструктурних, морфометричних, функціональних); статистична обробка та узагальнення одержаних результатів і впровадження їх в клінічну практику. Дані досліджень співавторів публікацій за темою дисертаційної роботи не включені.

Апробація роботи. Основні матеріали і положення проведених досліджень були викладені та обговорені на конференції молодих вчених ІКЕХ АМН України (Київ, 1989); засіданні вченої ради ІКЕХ (Київ, 1993); конференції, присвяченій 25-річчю Клініки судинної хірургії у Львові (Львів, 1996); конференції, присвяченій 25-річччю ІКЕХ АМН України (Київ, 1997); науковій конференції «Сучасні медичні технології в хірургії» (Київ, 1997).

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 11 робіт. Одержано авторське свідоцтво на винахід. Впроваджено 4 раціоналізаторські пропозиції.

Обсяг дисертації та її структура. Дисертація викладена на 150 сторінках друкованого тексту. Робота складається з вступу, 6 розділів, висновків, списку використаних джерел, що містить 84 вітчизняних та 144 іноземних авторів. Робота ілюстрована 13 таблицями, 28 мікрофотографіями, 27 гісто- і морфограмами.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Вивчено НГ периферичної крові у 30 здорових осіб (контрольна група), у 50 хворих на лімфедему кінцівок та 150 хворих з хронічним запаленням органів травлення та гнійно-септичними ускладненнями.

Для електронно-мікроскопічного дослідження НГ готували за розробленими нами методами: виділяли шляхом диференційного центрифугування крові (позитивне рішення від 25.09.92 №501323), обробляли (авторське свідоцтво №1772749/28 від 01.07.92; посвідчення про раціоналізаторські пропозиції №14/90 від 23.03.90 та №21/90 від 06.04.90), ультратонкі зрізи отримували на ультрамікротомі УМТП-3 (посвідчення про раціоналізаторські пропозиції №17/90 від 27.03.90 та №29/90 від 25.05.90), контрастували уранілацетатом і цитратом свинцю, переглядали та фотографували на електронному мікроскопі JEM-100S.

На отриманих при однаковому збільшенні електронограмах оцінювали основні морфометричні параметри НГ: периметр клітини (1), площу клітини (2), площу азурофільних гранул (3). Виміри 2 і 3 проводили у відносних величинах до загальної площі масштабної сітки. Ще один параметр - грануло-клітинне відношення (4), обчислювали за формулою: (площа гранул / площу клітини) 100%.

Паралельно вимірювали площу клітин та визначали оптичну щільність цитоплазми НГ у фарбованих за Романовським - Гімзе препаратах крові. Активність мієлопероксидази визначали за методом Грехема Кноля. Всі виміри виконували на комп'ютерному аналізаторі зображення фірми «OPTON» з використанням програмного забезпечення науково-виробничої компанії «ЄВА» та світлооптичного мікроскопа ЛЮМАМ-3.

ОА крові хворих оцінювали за допомогою методу люмінолзалежної хемілюмінесценції (ХЛ) на спектрометрі ДЕЛТА-300. Критерієм рівня ОА НГ був індекс ХЛ (І_хл), який обчислювали за даними спонтанної (ХЛ_сп) і стимульованої (ХЛ_ст) in vitro цільної крові за формулою: І_хл = (ХЛ_ст - ХЛ_сп) / ХЛ_сп.

Цифрові дані обробляли методами параметричної та непараметричної статистики, а також з використанням графічного методу з побудовою графіків-морфограм за величиною площі клітин (2) та площі азурофільних гранул (3).

Одержані описові та морфометричні характеристики НГ співставляли з показниками функціональної активності клітин.

Основні результати дослідження. Дані електронно-мікроскопічних досліджень свідчать, що в крові в осіб контрольної групи переважали неактивовані НГ, які мають круглу форму з поодинокими відростками клітинної мембрани, сегментоване ядро та значний вміст рівномірно розміщених специфічних та азурофільних гранул; в крові хворих з запаленням - активовані НГ, для них характерна значна варіабельність форми і розмірів, а також вмісту цитоплазматичних гранул.

Активовані НГ характеризувалися певними порушеннями гранулярного апарату клітин і в першу чергу азурофільних гранул. Мобілізація гранул при активації клітин, утворення сполучень гранула - мікротрубочка (ГР-МТ), необхідних для транспортування гранул до місця фагоцитозу, дегрануляція та поява напівпустих та пустих гранул призводить до зниження загальної площі гранул. Слід відзначити, що часто спостерігали - різке зниження, а іноді й повну відсутність азурофільних гранул в цитоплазмі великих деструктивно змінених клітин.

Поліморфізм будови НГ підтверджений також результатами морфометричних досліджень основних параметрів клітин (коефіцієнт варіації в окремих випадках становив 62,0%). Для оцінки показників (периметру, площі клітин та гранул, ГР/КЛ співвідношення та оптичної щільності цитоплазми) використали аналіз розподілу даних, який надав можливість виділити для кожного з досліджених параметрів числові діапазони. Найбільш інформативним є ділення на діапазони, які мають відповідно: низькі, помірні, помірно підвищені та високі значення. Результати статистичного аналізу дозволили розглядати помірні значення, як такі, що характеризують норму, а інші - відображають різні рівні активації та деградації НГ. В цілому дані морфометричного аналізу свідчать, що при патології периметр та площа НГ більшості клітин помірно підвищені (38,3 та 40,0%), в контролі - клітин з такими параметрами значно менше (12 та 18,1%). При патології також значно збільшена кількість клітин зі зменшеними площею гранул та ГР/КЛ співвідношенням (36,0 та 40,0%), в контролі значення цих параметрів становили 3,3% та 1,6%. Отже, отримані результати морфометричного аналізу НГ на електронно-мікроскопічному рівні свідчать, що при патології, порівняно з відповідними показниками в контролі, відбувається збільшення периметру та площі клітин, з одночасним зменшенням площі гранул та питомої ваги гранул в цитоплазмі НГ. При відповідному аналізі на світлооптичному рівні також була відмічена поява НГ великих розмірів зі зниженою оптичною щільністю цитоплазми.

Показники функціональної активності НГ, які оцінювали за активністю мієлопероксидази та за І_хл, також значно коливались, тому їх вивчення проводили з позицій оцінки розподілу значень та виділення чотирьох їх числових діапазонів. Це забезпечило однаковий підхід до оцінки структурних та функціональних показників. Аналіз розподілу показників активності мієлопероксидази показав, що при зазначеній вище патології, збільшується до 38,3% частота виявлення низької активності ферменту, в контролі - 1,6%.

Показник ОА крові за І_хл також змінювався в широких межах у всіх дослідних групах. Оцінювали ОА в обстежених осіб, виходячи не із групових характеристик, а відповідно до діапазонів значень, які відображають її низький, помірний, помірно підвищений та високий рівень.

Співставлення рівня ОА за І_хл та активністю мієлопероксидази дозволило виявити тісний кореляційний зв'язок між цими показниками, крім групи осіб з високим рівнем ОА. Для них було характерно зниження активності ферменту. Це свідчить, що значне підвищення індексу люмінолзалежної хемілюмінесценції, відбувається завдяки процесам перекисного окислення ліпідів пошкоджених мембранних структур НГ.

Аналіз зв'язків між структурними та функціональними показниками показав, що при помірному та помірно підвищеному рівні ОА крові НГ нормальної будови з ознаками активації без пошкодження клітинних структур, морфометричні параметри помірні та помірно підвищені; при високій та низькій ОА крові зазнають пошкоджень структури значної кількості клітин, їх площа велика, але вміст гранул низький. Отже, велика площа клітин, навіть при візуальній оцінці, є непрямим критерієм функціональної неспроможності ОА НГ крові.

ОА, яку визначали за І_хл, - досить точний, але інтегративний показник стану НГ, тому для порівняння його зі структурною характеристикою необхідна інтегральна структурна характеристика НГ. Такою характеристикою є оцінка сукупності НГ як системи, представленої у вигляді графіків-морфограм, побудованих на основі даних морфометрії електронограм 7 випадково обраних клітин. Структура морфограм дозволяє охарактеризувати поліморфізм будови НГ.

В результаті аналізу були одержані графічні моделі системи НГ, які характеризувалися рядом ознак: прямою чи зворотною залежністю площі клітин (верхня крива) та площі азурофільних гранул (нижня крива); агрануляцією; наявністю достовірної відмінності між екстремумами; тенденцією до збільшення або зменшення розмірів клітин.

За даними статистичного та порівняльного аналізу морфометричних і ультраструктурних ознак визначені критерії МФН системи НГ І, ІІ та ІІІ ступеня залежно від будови морфограм: І ступінь - структура клітин нормальна, ІІ ступінь - поява патологічних змін, ІІІ ступінь - значні патологічні зміни в структурі НГ.

Аналіз частоти виникнення МФН різних ступенів в групах з різним рівнем ОА крові свідчить, що існує тісний зв'язок між ступенем МФН та рівнем ОА. При помірному рівні ОА крові більший відсоток становлять морфограми, які відносяться до І ступеня МФН системи НГ, при помірно підвищеному рівні ОА крові морфограми, які відносяться до ІІ ступеня, а при низькому та високому рівні ОА крові морфограми, які відносяться до ІІІ і частково ІІ ступеня МФН системи НГ (рис. 2).

Існує тісний кореляційний зв'язок між ступенем МФН системи НГ та характером захворювання: І ступінь характерний для донорів та хворих на лімфедему без запалення; ІІ ступінь - для хворих з хронічним локальним запаленням (хронічний панкреатит, калькульозний холецистит); ІІІ ступінь - для хворих з гнійно-септичними ускладненнями (хронічний холецистит з нагноєнням, гнійний холангіт, абсцес печінки, перитоніт).

Слід відзначити, що ознаки МФН системи НГ виявляли при всіх вказаних захворюваннях і нерідко - у донорів. Додаткове дослідження НГ крові донорів показало, що МФН системи НГ зумовлена наявністю надмалих клітин із малою площею та високою щільністю цитоплазми і ядра, що характерне для апоптозу. Отже, І ступінь МФН системи НГ можна розглядати як фізіологічний, відображає фізіологічну деградацію клітин, які виконали свою функцію.

Аналіз морфограм, побудованих за величиною площі клітин та площі азурофільних гранул, дозволив стверджувати, що МФН системи НГ пов'язана з порушеннями в киснезалежних структурах клітин (мембранах, гранулах), які відповідають за рівень ОА НГ крові, а отже забезпечують реалізацію їх ефекторного потенціалу.

За результатами порівняльної оцінки інформативності морфометричних показників, отриманих під час електронно-мікроскопічного та світлооптичного дослідженні, встановлено відповідність між показниками, а отже і можливість та достатність використання простих морфометричних параметрів площі НГ та оптичної щільності цитоплазми клітин для оцінки морфофункціонального стану системи НГ.

Отже, оцінка стану НГ з позицій системи та визначення ступеня МФН системи НГ, дозволила пов'язати структурні зміни в клітинах з їх функціональною характеристикою, а отже довести, що морфометричні дослідження на електронно-мікроскопічному та світлооптичному рівні сприяють найбільш точній характеристиці ОА НГ крові.

Висновки

1. Оксидантна активність нейтрофільних гранулоцитів крові тісно пов'язана з особливостями будови цих клітин. Існують якісні та кількісні її морфологічні еквіваленти на ультраструктурному та світлооптичному рівні.

2. Підвищення оксидантної активності нейтрофільних гранулоцитів проявляється якісними змінами (появою псевдоподій і виростів клітинної мембрани, мобілізацією гранул, утворенням комплексів гранула-мікротрубочка і вторинних фагосом) та кількісними змінами (збільшенням довжини клітинної мембрани і площі клітин та зменшенням площі гранул і оптичної щільності цитоплазми).

3. Високий рівень оксидантної активності нейтрофільних гранулоцитів крові при люмінолзалежній хемілюмінесценції, є результатом перекисного окислення ліпідів пошкоджених клітинних мембран, а не результатом повноцінного функціонування мієлопероксидазозалежного бактерицидного механізму киснезалежної системи.

4. Зниження активності мієлопероксидази супроводжується збільшенням розміру клітин (r = - 0,807), зменшенням вмісту азурофільних гранул та оптичної щільності цитоплазми (r = 0,872).

5. Показники оксидантної активності крові і морфологічні характеристики нейтрофільних гранулоцитів характеризуються високою варіабельністю, тому однозначної оцінки їх функціонального стану можна досягнути, застосовуючи критерії визначення морфо - функціональної недостатності системи нейтрофільних гранулоцитів. Морфофункціональна недостатність системи нейтрофільних гранулоцитів є інтегральною характеристикою комплексу морфологічних ознак, виявлених на ультраструктурному рівні, що відображає рівень оксидантної активності цих клітин.

6. Виділено три ступеня морфофункціональної недостатності системи нейтрофільних гранулоцитів залежно від особливостей перебудови киснезалежних структур: І ступінь - оксидантна активність у межах показників норми, ІІ ступінь - оксидантна активність помірно підвищена, ІІІ ступінь - оксидантна активність значно знижена, або значно підвищена, що свідчить про суттєві патологічні відхилення в системі нейтрофільних гранулоцитів крові. Встановлено достовірну кореляційну взаємозалежність перебігу хвороби, ступеня морфофункціональної недостатності системи нейтрофільних гранулоцитів та рівня оксидантної активності крові (r = 0,931).

7. На світлооптичному рівні морфометричні показники площі клітин та оптичної щільності цитоплазми нейтрофільних гранулоцитів є найбільш значущими характеристиками оксидантної активності нейтрофільних гранулоцитів крові. Перевищення 30% вмісту клітин, які мають велику площу (понад 140,0 мкм²) та низьку оптичну щільність цитоплазми (понад 40 ум. од.), свідчить про суттєве зниження бактерицидного потенціалу системи нейтрофільних гранулоцитів.

Практичні рекомендації

Пропонується для застосування в клінічних та наукових лабораторіях: метод діагностики та контролю ефективності лікування післяопераційних гнійно-септичних ускладнень; методи визначення фагоцитарної активності лейкоцитів крові та резерву захисних сил організму.

Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Антимикробная активность нейтрофильных гранулоцитов и методы ее определения в хирургической клинике. Сообщение І. Особенности кислороднезависимого бактерицидного механизма нейтрофильных гранулоцитов // Клин. хирургия. - 1991. - №2. - С. 45-47. Співавт: Медвецкий Е.Б., Хильченко Е.А.

2. Ультраструктурная характеристика клеточных взаимодействий нейтрофилов и анаэробных микроорганизмов при экспериментальной острой кишечной непроходимости // Клин. хирургия. - 1991. - №4. - С. 21-23. Співавт: Медвецкий Е.Б., Середин В.Г.

3. Антимикробная активность нейтрофильных гранулоцитов и методы ее определения в хирургической клинике. Сообщение ІІ. Особенности кислородзависимого бактерицидного механизма нейтрофильных гранулоцитов // Клин. хирургия. - 1991. - №11. - С. 51-55. Співавт: Медвецкий Е.Б., Хильченко Е.А.

4. А.с. 1772749 СССР, МКИ G 01 №1/28. Способ подготовки биологической ткани к растровой електронной микроскопии. - Заявлено 31.08.90; Опубл. 30.10.92, Бюл. №40. - 2 с. Співавт: Медвецкий Е.Б.

5. Новые возможности хирургического лечения синдрома хронической лимфовенозной недостаточности нижних конечностей // Актуальні проблеми судинної хірургії: Матеріали конф. присвяченої 25-річчю Клініки судинної хірургії у Львові. - Львів, 1996. - С. 91-92. Співавт: Чернуха Л.М., Дрюк Н.Ф.

6. Структурно - функциональная характеристика кислород-зависимой бактерицидной системы нейтрофильных гранулоцитов // Проблеми клінічної хірургії: Зб. наук. робіт, присвяч. 25-річчю Інституту клін. та експерим. хірургії АМН України. - К.: Клін. хірургія, 1997. - С. 252-258.

7. Микрохирургия лимфатических сосудов. Новые подходы к лечению лимфэдемы и синдрома хронической лимфовенозной недостаточности конечностей // Проблеми клінічної хірургії: Зб. наук. робіт, присвяч. 25-річчю Інституту клін. та експерим. хірургії АМН України. - К.: Клін. хірургія, - 1997. - С. 192-204. Співавт: Чернуха Л.М., Дрюк Н.Ф.

8. Характеристика оксидантной активности нейтрофилов крови при лимфэдеме нижних конечностей // Новые технологии в хирургии: Сб. науч. работ посвящ. 75-летию кафедры хирургии Киев. мед. акад. последиплом. образования МЗ Украины. - К., 1997. - С. 176.

9. Характеристика миелопероксидазозависимой бактерицидной системы нейтрофильных гранулоцитов крови у пациентов с гнойно-септическими заболеваниями // Клін. хірургія. - 1997. - №9-10. - С. 42-43.

Ультраструктурна характеристика нейтрофільних гранулоцитів крові у хворих на хронічний холецистит // Вісник морфології. - 1999. - 5, №1. - С. 6-8. Співавт: Гомоляко І.В.

Морфометрична характеристика нейтрофільних гранулоцитів крові // Вісник морфології. - 1999. - 5, №1. - С. 20. Співавт: Гомоляко І.В.

Взаємозв'язок між оксидантною та мієлопероксидазною активністю нейтрофільних гранулоцитів у гнійно-септичних хворих // Лаб. діагностика. - 1999. - №2. - С. 13-15.

Размещено на Allbest.ru