Вплив інгібіторів аніонного транспорту і модифiкаторів цитоскелета на бар`єрні характеристики еритроцитів в умовах осмотичного стресу

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ВПЛИВ ІНГІБІТОРІВ АНІОННОГО ТРАНСПОРТУ І МОДИФІКАТОРІВ ЦИТОСКЕЛЕТА НА БАР'ЄРНІ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЕРИТРОЦИТІВ В УМОВАХ ОСМОТИЧНОГО СТРЕСУ

ЛУПІЛОВА НАТАЛІЯ ОЛЕКСАНДРІВНА

УДК 57.043: 612.111.45: 577.112

03.00.19 - кріобіологія і кріомедицина

Харків - 1999

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі кріофізіології клітини Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук,

старший науковий співробітник

БОНДАРЕНКО ТЕТЯНА ПЕТРІВНА

ІПКіК НАН України, зав. відділом біохімії і фармакології

нейрогуморальних систем

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, старший науковий співробітник

ГОРДІЄНКО ЄВГЕН ОЛЕКСАНДРОВИЧ

ІПКіК НАН України, зав. відділом низькотемпературного консервування

Доктор біологічних наук, професор

ПЕРСЬКИЙ ЄВГЕН ЕФРАІМОВИЧ

ХДУ, професор кафедри фізіології людини та тварин, зав. сектором лабораторної діагностики

Провідна установа: Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, відділ біохімії м`язів

Захист відбудеться “18” травня 1999 року о 13 - 30 годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01. при

Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України,

310015, Харків - 15, вул. Переяславська, 23

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІПКіК НАН України

310015, Харків - 15, вул. Переяславська, 23

Автореферат розісланий “15” червня 1999 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

докт. мед. наук, професор Гольцев А.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Серед факторів, що реалізують свою дію на клітини в умовах охолодження та здатних викликати їхнє пошкодження, можна виділити декілька основних, виключивши механічні, що супроводжують кристалізацію та рекристалізацію. Це, передусім, група факторів, пов'язаних з ефектами самої температури, - температурозалежні (холодовий шок, постгіпертонічний та ізотермічний лізіс). Дія таких факторів опосередкована модифікацією комплексу цитоскелет-мембрана під впливом дегідратації. В останній час у літературі з'явилися відомості про те, що міра дегідратації є фактором, що здатний не тільки викликати пошкодження, але й фактором, що підвищує тривкість клітин до дії несприятливих умов [Бондаренко В.А., 1988, Бондаренко Т.П., 1994, Песина Н.И., 1993].

До цього часу накопичений достатній обсяг експериментальних даних про те, що однією з причин пошкодження еритроцитів при охолодженні є порушення в мембрані комплексу цитоскелет-біслой, а розвиток чутливості еритроцитів в значній мірі визначається рН та іонною силою середовища, які контролюють транспорт аніонів. Перерозподіл аніонів між клітиною та середовищем супроводжується зміною осмотичного стану клітини під контролем білків цитоскелета. Згідно сучасним уявленням, однонапрямковий струм аніонів, а також їхній обмінний транспорт забезпечує білок смуги 3, що має каналоподібну структуру. Використання інгiбiторів аніонного транспорту різного механізму дії, а також модифікаторів цитоскелета, є тим методологічним підходом, що дозволяє наблизитися до зрозуміння механізмів функціювання системи транспорту аніонів, надто вагомих для підтримання клітинного гомеостазу.

При постановці подібних експериментів вельми важливо враховувати те, що транспортні процеси, якi реалізуються в клітині, є температурозалежними у тому сенсі, що температура контролює швидкість модифікації елементів клітини, у тому числі, і структур, що формують канали для транспорту катіонів, аніонів і макромолекул. А це означає, що необхідним є аналіз термодинамічних характеристик транспортних систем, зокрема, протонів, відповідальних за підтримання внутрішньоклітинного рН.

Метою даної роботи є вивчення бар'єрних характеристик еритроцитів з нормальним та модифікованим цитоскелетом за умов дії осмотичних факторів середовища, що містять електроліти та неелектроліти.

Згідно поставленій меті роботи необхідно було вирішити наступні задачі:

1. Проаналізувати поведінку еритроцитів за умов дії сильного осмотичного стресу по інтегральному показнику (виходу гемоглобіну) та за допомогою флуоресцеіндіацетату (флуоресцирує лише в живій клітині) у залежності від початкового стану цитоскелета в умовах норми та часткової дегідратації.

2. Оцінити особливості транспорту аніонів та протонiв в еритроцитах за умов гіпертонічного впливу середовища та варіюванні його складу при використанні інгібіторів аніонного транспорту різної дії (діпірідамол, ДІДС) та модифікаторів цитоскелета (гемін та часткова дегідратація).

3. Дослідити термодинамічні характеристики входу та виходу протонів в еритроцитах при гіпертонічному впливі за умов модифікації клітин дегідратацією та інгібіторами аніонного транспорту.

Наукова новизна одержаних результатів

Оцінка стану еритроцитів по інтегральному показнику (виходу гемоглобіну) дала можливість отримати загальну картину зміни поведінки еритроцитів при дії сильного осмотичного тиску розчинів зовнішнього середовища, згідно якій часткова дегідратація, що передує дії гіпертонії, сприяє підвищенню стабільності клітин.

Аналіз схоронності еритроцитів з використанням флуоресцеіндіацетату ускладнений з-за екранування флуоресценції гемоглобіном. Тонкі механізми, що лежать в основі цих досліджень, були отримані при вивченні стану транспортних систем, що забезпечують підтримання клітинного гомеостазу. Зміна рН клітини має двофазний характер: фаза закислення відбиває вихід аніонів хлору, фаза залуження - транспорт сульфату в еритроцити. Встановлено, що використання інгібіторів аніонного транспорту призводить до зрушення кількісного співвідношення між чистим виходом хлориду та його виходом в обмін на сульфат.

Практичне значення одержаних результатів

Одержані в роботі результати дозволяють зробити висновок, що обмінний транспорт CI-/SO42- більш чутливий до гіпертонічного впливу та дії iнгiбiторів аніонного транспорту і модифікаторів, ніж чистий вихід хлориду. Інгібуючий ефект модифікаторів аніонного транспорту визначається як природою самого інгібітора, так і складом гіпертонічного середовища, в яке потрапляють клітини при охолодженні.

Неконкурентні інгібiтори, блокатори аніонного каналу (типу діпірідамола), ефективно блокують транспорт аніонів у неелектролітному середовищі. Специфічні необоротні інгібітори, блокатори транспортного сайту (типу ДІДС), виявляють інгібуючий ефект поза залежністю від складу середовища.

Особистий внесок здобувача

Винесені на захист положення та результати одержані дисертантом особисто. Роботи, які мають відношення до теми дисертації, що опублікувалися у співавторстві з Бондаренко Т.П., Рамазановим В.В., відображують результати, що стосуються загального планування експерименту та підготовки матеріалів до друку.

Автор самостійно провів аналіз отриманих результатів, зробив висновки до роботи.

Основні матеріали дисертаційної роботи доповідалися та обговорювалися на: Конференції молодих вчених ХДУ (1996 р., м.Харків), II з'їзді УБФТ (1998 р., м.Харків), III з'їзді Білоруського товариства фотобіологів та біофізиків (1998 г., Мінськ).

Публікації

Матеріали викладені на 10 сторінках друкованого тексту і мicтять вступ, огляд літератури (1 роздiл), матеріали і методи досліджень (2 роздiл), результати досліджень та їх обговорення (3 роздiл), заключення, висновки, 25 ілюстрацій (25 сторiнок), 14 таблиць (14 сторiнок), додаток (8 сторiнок), а також список літератури, який мiстить 166 найменувань літературних джерел (17 сторiнок).

Загальна методика та основні методи дослідження

Експерименти проводилися на еритроцитах свіжої донорської крові людини, отриманої з Харківської обласної станції переливання крові. Бар'єрну функцію мембран клітин контролювали по інтегральному показнику - виходу гемоглобіну, що визначали спектрофотометрично на приладі СФ-4А з проточною кюветою при 543 нм і виражали у відсотках по відношенню до кількості гемоглобіну в клітинах до взяття їх в експеримент (цю величину приймали за 100 %). Для визначення 100 %-ного гемолізу еритроцити руйнували тритоном Х-100 (0,1 %). Спектри флуоресценції еритроцитів реєстрували на спектрофотометрі МРГ-2А фірми Хітачі, використовуючи флуоресцентний зонд ФДА (флуоресцеіндіацетат) [Владимиров Ю.А, Добрецов Г.Е.,1980]. При аналізі еритроцитів методом рН-метрії використовували клітини з 2 %-ним гематокритом, що вносили у термостатуєму комірку з рН-електродом. Функціювання аніонного каналу еритроцитів оцінювали по динаміці зміни рН суспензії клітин і реєстрували за допомогою самописця Ендім (ГДР).

Використовували інгібітори аніонного транспорту діпірiдамол і ДІДС фірми “SIGMA” (США). Константу інгібування транспорту протонів у клітину визначали графічним методом Діксона [Уэбб Л., 1966]. Статистичну обробку результатів проводили за методом Стьюдента - Фішера [Зайцев Г.Н.,1984].

ВЛАСНІ РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Поведінка клітин при охолодженні та заморожуванні в значній мірі зумовлена змінами стану плазматичної мембрани та білкового цитоскелета. Асоціація білкового цитоскелета з інтегральними компонентами плазматичної мембрани забезпечує постійність внутрішньоклітинного середовища і залежить від температури, рН, концентрації іонів у середовищі. Білковий цитоскелет здатний змінювати свій структурний стан за умов дії таких факторів, як температура та осмолярність. Механізм регулювання стану цитоскелета, а також і його стабільність полягає в підтриманні певної концентрації білка в одиниці об'єму внутрішньоклітинного розчинника. Внутрішньоклітинна вода у нормі контролює як структуру, так і функцію клітини, а спроможність білків зв'язувати воду корелює з осмотичною активністю клітини [Аксенов С.И., 1990].

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис.1. Вплив початкової тонічності середовища на схоронність еритроцитів до охолодження (37 - 0 оС, 1) та переносу у 4,00 М NaCl (0 - 0 оС, 2). Час інкубації на кожному етапі 10 хвилин

Одержані нами результати (рис.1), а також роботи інших авторів [Бондаренко В.А., 1988, Бондаренко Т.П., 1994, Песина Н.И., 1993], показують, що осмотична поведінка еритроцитів залежить від ступеня обезвожування на етапі перед зміною умов середовища. Чутливість еритроцитів до температурного і осмотичного шоку знижувалася в умовах, коли клітину заздалегідь витримували у 0,45 М розчині NaCl.

При використанні розчинів з більшою або меншою осмоляр- ностю відбувалося зростання чутливості еритроцитів. При збільшенні осмолярності вище 0,65-0,80 М відзначалося зростання чутливості як до зниження температури, так і осмолярності, що вказує на подібність механізмів сенсибілізації. Оцінка стану еритроцитів по інтегральному показнику (виходу гемоглобіну) дає можливість отримати загальну картину, проте не дозволяє говорити про тонкі механізми, що лежать в основі цих змін. Тривкість клітин, збереження та підтримання клітинного гомеостазу контролюється складним комплексом різноманітних транспортних систем, серед яких значна роль належить транспорту аніонів.

Тому, ми вважали доцільним простежити за тими змінами, що відбуваються у транспорті аніонів в еритроцитах за умов дії гіпертонічного стресу та температури. Цим питанням присвячений наступний розділ наших досліджень.

2. Особливості транспорту аніонів та протонів при гіпертонічному впливі середовища та варіюванні його складу

До цього часу накопичена достатня кількість експериментальних даних про те, що однією з причин пошкодження еритроцитів при охолодженні є порушення в мембрані комплексу цитоскелет-біслой [Kaplan J.H., Keegh F.A.,1982], а розвиток чутливості еритроцитів до холодового шоку в значній мірі визначається рН та іонною силою середовища, що якраз і контролюють транспорт аніонів [Козлов М.М., Маркин В.С.,1986].

Рис.2. Зміна рН (а) та швидкості залуження (б) у суспензії еритроцитів при зміні концентрації Na2SO4 в зовнішньому середовищі: 1 - 120 мМ Na2SO4 + 0 мМ сахарози; 2 - 60 мМ Na2SO4 + 150 мМ сахарози; 3 - 30 мМ Na2SO4 + 225 мМ сахарози; 4 - 3 мМ Na2SO4 + 293 мМ сахарози; 5 - 0 мМ Na2SO4 + 300 мМ сахарози

Це стало посилкою для проведення експериментів по оцінці транспорту аніонів хлориду та сульфату в еритроцитах, підданих дії розчинів з різною іонною силою та оброблених інгібіторами аніонного транспорту. З даних, приведених на рис.2, видно, що в ізотонічному середовищі відбувається закислення, а після цього зрушення рН у лужну сторону (рис.2 а, крива 1).

Тобто можна говорити про те, що зміна рН являє собою двофазний процес. Аналіз швидкості залуження в залежності від концентрації аніонів SO42- у зовнішньому середовищі (рис.2 б) показав, що швидкість залуження зростає з підвищенням концентрації Na2SO4, досягаючи максимума при 84 мМ, а після цього крива виходить на плато. Максимальна швидкість залуження спостерігалася у диапазоні концентрацій Na2SO4 у зовнішньому середовищі від 84 до 120 мМ, що може вказувати на можливий зв'язок котранспору сульфату та протону.Використання інгібіторів аніонного транспорту в цих умовах показало, що зростання концентрації інгібіторів супроводжується збільшенням закислення середовища та зниженням швидкості залуження Na2SO4 (рис.3 а). Зростання концентрації діпірідамола (рис.3 а) до 200 мкМ не супроводжувалося блокуванням фази закислення, тоді як ДІДС при концентрації вище 1 мкМ призводить до інгібування означеного процесу (рис.3 б).

На рис.4 представлені результати дослідження впливу інгібіторів аніонного транспорту на фазу закислення в різноманітних середовищах. У сульфатному та у сахарозному середовищах діпірідамол незначно інгібує транспорт протонів з клітини (10 - 15 %), тоді як у середовищі, яке містить Cl- , цей інгібітор викликає значний ефект (75 % інгібування). Дія ДІДС не залежить від складу середовища, ефект інгібування складає при його концентрації 20 мкМ 85 - 95 % (рис.4 б).

Рис.3. Вплив зміни рН суспензії еритроцитів у середовищі, що містить 120 мМ Na2SO4, у залежності від концентрації інгібіторів аніонного транспорту

а - діпірідамол: 1 - контроль, 2 - 10 мкМ, 3 - 20 мкМ, 4 - 50 мкМ, 5 - 70 мкМ, 6 - 100 - 200 мкМ;

б - ДІДС: 1 - контроль, 2 - 0,5 мкМ, 3 - 0,7 мкМ, 4 - 1,0 мкМ, 5 - 1,2 мкМ, 6 - 1,5 мкМ, 7 - 2,0 мкМ, 8 - 5,0 мкМ, 9 - 10 мкМ, 10 - 20 мкМ

При гіпертонічних концентраціях електроліту (вище 500 мМ Na2SO4) (рис.5) блокується як фаза закислення, так і фаза залуження. В експериментах з використанням фіксованої концентрації Na2SO4 (120 мМ) та зростаючої концентрації сахарози відбувалося також блокування обох фаз рН-кривої. Інгібування другої фази в інтервалі часу, що досліджувався було практично повне при концентрації сульфату 2 М, а сахарози 1,2 М, проте фаза закислення у цьому випадку блокується лише частково.

Отримані нами дані дають підстави зробити висновок, що обмінний транспорт CI-/SO42-, представлений фазою залуження, більш чутливий до дії iнгiбiторiв, що досліджувалися, ніж чистий вихід CI- у фазі закислення, і він не блокується діпірідамолом.

Рис.4. Вплив діпірідамола (а) і ДІДС (б) на залуження суспензії еритроцитів у середовищі, яке містить:

1 - 120 мМ Na2SО4; 2 - 300 мМ сахарози; 3 - 260 мМ сахарози + 20 мМ NaCl

Рис.5. Вплив гіпертонічних розчинів на динаміку зміни рН суспензії еритроцитів у середовищах, що містять Na2SO4 (a):

1 - 120 мМ, 2 - 300 мМ, 3 - 500 мМ, 4 - 800 мМ, 5 - 1 М, 6 - 1,5 М, 7 - 2,0 М, а також Na2SO4 + сахарозу (б):

1 - 120 мМ Na2SO4 + 0 мМ сахарози, 2 - 120 мМ Na2SO4 + 300 мМ сахарози, 3 - 120 мМ Na2SO4 + 600 мМ сахарози, 4 - 120 мМ Na2SO4 + 900 мМ сахарози, 5 - 120 мМ Na2SO4 + 1 М сахарози, 6 - 120 мМ Na2SO4 + 1,2 М сахарози

Це вказує на те, що два засоби транспорту аніонів мають різні механізми реалізації. Оскільки SO42- має порівняну з CI- афінність до транспортного сайту і зв'язування його не залежить від рН середовища інкубації, можна вважати, що зв'язування даного аніону не заважає чистому виходу хлориду у першій фазі. Блокування каналів доступу сульфату до транспортного сайту діпірідамолом також не перешкоджує струму хлориду, що виходить, а фаза закислення при цьому стає більш виразливою, тобто вихід CI- з клітини у фазі закислення здійснюється без участі транспортного сайту, по градієнту електрохімічного потенціалу (канальний механізм). ДІДС у порівнянні з діпірідамолом інгібує як фазу залуження, так і фазу закислення у сульфатному середовищі і значно блокує закислення у сахарозному середовищі, що не містить CI-.

Різна чутливість фаз закислення та залуження до інгібітора аніонного транспорту ДІДС визначається, скоріш за все, різною чутливістю до нього канального та обмінного типів транспорту аніонів. Його афінність до аніонного каналу буде підвищуватися у випадку більшого перерозподілу транспортного сайту на зовнішню сторону мембрани. Слід особливо відзначити, що обмін аніонів СI- на SO42- (фаза залуження) більш чутливий до осмотичного впливу, ніж канальний транспорт. Певно, механізм просторової переорієнтації гідрофобних сегментів білка смуги 3 у транспортному циклі обміну аніонів, більш чутливий до впливу гіпертонічного середовища, що деформує мембрану, ніж вихід аніонiв CI- у випадку канального механізму, що не потребує конформацiйних змін переносника.

Більш повна картина впливу модифікаторів аніонного транспорту на вхід протонів в еритроцити за умов реалізації гіпертонічного фактора проілюстрована у таблиці 1, де приведений відсоток інгібування транспорту протонів при дії різноманітних факторів середовища по відношенню до транспорту за умов ізотонії по Na2SO4.

Видно, що в умовах ізотонії у фазі закислення еритроцити після обробки геміном у присутності ДІДС поводять себе як необроблені клітини. При дії діпірідамола в контрольних та оброблених клітинах транспорт протонів інгібується на 8,5 %. В умовах гіпертонії по Na2SO4 у фазі закислення відбувається інгібування транспорту, при цьому у випадку обробки геміном інгібування посилюється на 10 % у порівнянні з контрольними зразками. При дії в цих умовах ДІДС в еритроцитах, оброблених геміном, інгібування посилюється на 12 %. У випадку діпірідамола інгібування транспорту протонів зростає на 22,5 % в контрольних зразках і на 28 % в еритроцитах, оброблених геміном. Виявлений нами значний інгібуючий ефект діпірідамола (табл.1) можна пояснити, припустивши, що гіпертонічний вплив призводить до зміни електростатичної структури входу аніонного каналу. Можливість такого припущення доводиться результатами, одержаними при порівнянні контрольних та оброблених геміном еритроцитів. У обох випадках інгібування транспорту діпірідамолом відбувається на 22 %.

Таблиця 1

Відсоток інгібування транспорту протонів в еритроцитах у присутності інгібіторів аніонного транспорту (за 100% прийнято інгібування транспорту протонів в ізотонічному середовищі по Na2SO4)

Все це дає змогу говорити, що гіпертонічний вплив як у випадку контрольних, так і оброблених геміном еритроцитів, супроводжується модифікацією структурної поверхні мембрани і, зокрема, електростатичної структури входу аніонного каналу.

Оскільки стан білків цитоскелета регулюється у клітині двома факторами: температурою та осмолярністю середовища, для повного зрозуміння транспортних процесів за умов дії модифікаторів та інгібіторів аніонного транспорту необхідно розглянути і внесок температурного фактора, а саме кінетичних характеристик транспортних процесів при різних температурах.

3. Дослідження термодинамічних характеристик транспорту протонів крізь мембрану еритроцитів у залежності від складу середовища

Транспортні процеси є температурозалежними. Температура контролює швидкість модифікації структурних елементів клітини, у тому числі, елементів, що формують канали для транспорту. Це пов'язано, передусім, з впливом температури на процеси асоціації та дисоціації компонентів цитоскелета один з одним та з компонентами мембрани. Як видно з графіка температурної залежності транспорту протонів з клітини у середовищах з різною тонічністю (рис.6) в ізотонічних умовах (120 мМ Na2SO4) виявляються 2 лінійних відрізка у діапазоні температур (1 - 6,5 оС та (6,5 - 57) оС. Виявлений ізлом у нашому випадку при (6,5 1,5) оС може бути пов'язаний зі зміною структурно-функціонального стану аніонного каналу при зміні температури. Скоріш за все, цей ізлом відбиває зміну транспорту CI- у сульфатному середовищі. Це узгоджується з літературними даними про те, що в мембрані еритроцитiв поблизу 8 оС (6,5 оС - 9,5 оС) відмічається термотропний структурний перехід, що зумовлений зміною функції білка смуги 4.1, який контролює взаємодію елементів цитоскелета з мембраною і, передусім, з білком смуги 3, що відповідає за транспортні функції. Гіпертонічний вплив електролітного середовища супроводжується появою декількох крапок перегину та зміщенням ізлому з (6,5 1,5) оС до (15 2,0) оС, що може бути результатом гіпертонічного впливу на фазовий стан ліпідів. Таке уявлення співпадає з даними літератури.

Обробка геміном зміщувала ізлом з (6,5 1,5) оС до (30 2,5) оС. ДІДС в еритроцитах, що оброблені геміном, викликав на температурній кривій появу відрізків, що характерні для гіпертонічних умов. Однаковий стан транспортних систем при впливі таких факторів як гемін, інгібітори, гіпертонія дають підстави вважати, що першорядне значення для транспорту аніонів та протонів має модифікація цитоскелета. У частково дегідратованих еритроцитах ізлом з (6,5 1,5) оС зміщується у (37 3,0) оС. При внесенні таких еритроцитів у гіпертонічні середовища ізлом зміщується на 3 або 13 оС в залежності від складу середовища.

Обробка 0,45 М розчином NaCl немов би нівелювала ефекти температури при гіпертонічному впливі. Мембранний транспорт у цілому, за своєю суттю, є ізотермічним та ізобаричним процесом за рахунок того, що постійність температури забезпечується високою теплопровідністю тканин або середовища, а постійність тиску - зв'язком з атмосферою.

Спроможність таких систем учиняти роботу по зміні об'єму при постійному тиску визначається лише вільною енергією Гіббса (G*) і у цьому відношенні заслуговує уваги аналіз зміни цієї величини при переході крізь крапки ізлому від низькотемпературного до середньотемпературного відрізку на термодинамічній кривій, коли температура ще не виявляє впливу на інактивацію процесів транспорту (“теплова інактивація”).

Рис.6. Вплив температури на транспорт протонів з клітини у середовищах, що містять:

1 - 120 мМ Na2SO4;

2 - 800 мМ Na2SO4;

3 - 120 мМ Na2SO + 900 мМ сахарози

Та хоча зміни вільної енергії незначні, на рівні (1 - 7) %, треба відзначити, що при дії гіпертонічних розчинів для контрольних еритроцитів зміни даного параметру складають 2 % для електролітного і 5 % - для неелектролітного середовищ. У випадку дегідратованих клітин даний параметр змінюється однаковим чином. Він зростає на 1 % в умовах гіпертонії як по електролітам, так і неелектролітам, що є ще одним підтвердженням того, що дегідратовані клітини набувають підвищеної тривкості до осмотичного впливу

ВИСНОВКИ

1. Системи аніонного транспорту мають важливе значення у підтриманні клітинного гомеостазу в екстремальних умовах, зокрема, за умов дії низьких температур. Результати, що були отримані під час роботи з використанням інгібіторів аніонного транспорту і модифікаторів цитоскелета, поширюють існуючі уявлення щодо механізмів функціювання транспортних систем і дозволяють зробити рекомендації відносно використання діпірідамола для неелектролітних, а ДІДС для електролітних та неелектролітних середовищ за умов дії гіпертонічного фактора, що реалізується під час охолодження.

2. Осмотична поведінка еритроцитів контролюється осмотичним тиском розчинів середовища на початкових етапах. Стабільність клітин в умовах дії сильного тривалого осмотичного стресу (4,00 М NaCl, 3 години) зростає при осмолярності середовища 800 мОсм.

3. Зміна внутрішньоклітинного рН містить у собі 2 фази: фазу закислення та фазу залуження. Остання більш чутлива до гіпертонічної дії, інгібіторів аніонного транспорту та модифікаторів цитоскелета.

4. Модифікуючий ефект геміну залежить від складу середовища: його дія сильніше проявляється в електролітних середовищах.

5. При 6,5  1,5 оС на термодинамічній кривій відмічається ізлом, який супроводжується зміною термодинамічних параметрів транспорту протонів, що співпадає з термотропним переходом білка смуги 4.1, контролюючого взаємодію мембрани з білком смуги 3, що формує анiонний канал.

6. Гіпертонічний вплив супроводжується інгібуванням транспорту протонів, яке посилюється зі зростанням температури і зміщенням ізлому з (6,5 1,5) оС, що може бути пов'язано з фазовими переходами ліпідів.

7. Помірна гіпертонія (800 мОсм) “полегшує” транспорт протонів. Зміна термодинамічних параметрів транспорту протонів в інтервалі температур (1-25) оС у гіпертонічних середовищах відповідає таким характеристикам при (20-57) оС для ізотонічних умов.

Перелік робіт, опублiкованих за темою дисертації

Бондаренко Т.П., Лупилова Н.А. Осмолярность и температура среды как факторы, контролирующие поведение эритроцитов // Пробл. криобиологии.- 1997.- №4.- С. 24 - 27.

Бондаренко Т.П., Лупилова Н.А. Исходные условия и устойчивость эритроцитов к осмотическому стрессу. 1.Флуоресцентные исследования // Пробл. криобиологии.- 1998.- №1.- С. 43 - 48.

Рамазанов В.В., Лупилова Н.А., Бондаренко Т.П. Транспорт протонов в эритроцитах при гипертоническом воздействии // Пробл. криобиологии.- 1998.- №4.- С. 71-73.

Рамазанов В.В., Лупілова Н.О., Бондаренко Т.П. Дія інгібіторів аніонного транспорту на зміну рН суспензії еритроцитів у сульфатному середовищі // Тези доповідей II з`їзду УБФТ.- Харків.- 1998.- С. 78.

Лупилова Н.А., Рамазанов В.В., Бондаренко Т.П. Исследование изменений рН суспензии эритроцитов, подвергнутых сочетанному действию анионов сульфата и ингибиторов анионного транспорта // Тезисы докладов III cъезда Белорусского общества фотобиологов и биофизиков.- Минск.- 1998.- С. 124.

АНОТАЦІЇ

Лупілова Н.О. Вплив інгібіторів аніонного транспорту і модифiкаторів цитоскелета на бар`єрні характеристики еритроцитів в умовах осмотичного стресу.- Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія і кріомедицина. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 1999.

Дисертацію присвячено вивченню бар`єрних характеристик еритроцитів з нормальним та модифікованим цитоскелетом за умов дії осмотичних факторів середовища, що містять електроліти і неелектроліти. Отримані результати дозволяють зробити висновок, що обмінний транспорт Cl-/SO42- більш чутливий до гіпертонічного впливу та дії інгібіторів аніонного транспорту і модифікаторів цитоскелета, ніж чистий вихід хлориду.

Ключові слова: еритроцит, охолодження, гіпертонічний стрес, інгібітори аніонного транспорту.

Лупилова Н.А. Влияние ингибиторов анионного транспорта и модификаторов цитоскелета на барьерные характеристики эритроцитов в условиях осмотического стресса.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология и криомедицина. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 1999.

Диссертация посвящена изучению барьерных характеристик эритроцитов с нормальным и модифицированным цитоскелетом в условиях действия осмотических факторов среды, включающей электролиты и неэлектролиты.

Объектом исследования служили эритроциты свежей донорской крови человека. В работе использовались спектрофотометрические, флуориметрические и рН-метрические методы исследования.

Полученные в работе результаты позволяют сделать вывод о том, что обменный транспорт Cl-/SO42- более чувствителен к гипертоническому влиянию и действию ингибиторов анионного транспорта и модификаторов цитоскелета, чем чистый выход Cl-.

Ингибирующий эффект модификатора анионного транспорта определяется как химической природой самого ингибитора, так и составом среды, в которую попадают клетки при охлаждении. Неконкурентные ингибиторы (типа дипиридамола) эффективны в неэлектролитных средах. Специфические блокаторы транспортного сайта (типа ДИДС) проявляют ингибирующий эффект как в электролитных, так и неэлектролитных средах.

Гипертоническое воздействие сопровождается ингибированием транспорта протонов, которое усиливается с ростом температуры. Действие гипертонического стресса реализуется на гидрофобном фрагменте анионного переносчика - белка полосы 3, что способствует усилению ингибирующего влияния дипиридамола в присутствии модификатора цитоскелета - гемина. В условиях гипертонического стресса взаимодействие ингибитора с анионным переносчиком из двухфазного (для изотонии) переходит в однофазный процесс.

В условиях умеренной гипертонии (800 мОсм) “облегчается” транспорт протонов. Изменение термодинамических параметров транспорта протонов в гипертонических средах при температурах 1-25 оС соответствует таковым для изотонических условий при температурах 20-57 оС.

Ключевые слова: эритроцит, охлаждение, гипертонический стресс, ингибиторы анионного транспорта.

Lupilova N.A. The influence of anion transport inhibitors and cytoskeleton modificators on barrier characteristics of erythrocytes under the osmotic stress.- Manuscript.

The thesis for scientific degree of a candidate`s biological sciences on speciality 03.00.19 - cryobiology and cryomedicine. - Institute for Problems of Criobiology and Criomedicine of the Academy of Sciences of the Ukraine, Kharkov, 1999.

The thesis is devoted to investigation of RBC barrier properties with normal and modified cytoskeleton under media osmotic factors witch consists of electrolytes and nonelectrolytes. The obtained results allow to suggest that exchange transport Cl-/SO42- is more sensitive to hypertonic influence and effect of anion transport inhibitors and cytoskeleton modificators, rather than pure efflux chloride.

Key words: erythrocyte, cooling, hypertonic stress, anion transport inhibitors.

Размещено на Allbest.ru