Вплив антиоксидантів та омепразолу на протизапальну активність, побічну дію та фармакокінетику індометацину

Вперше експериментально обгрунтовано і підтверджено в клініці необхідність включення до комплексу лікування хворих на ревматоїдний артрит препарату селени, розроблено показання до його застосування з використанням параметрів глутатіонової антиперекисної системи еритроцитів (активність селен-залежної глутатіонпероксидази).

На основі даних, отриманих в експерименті та клініці, патогенетично обгрунтовано схеми лікування хворих на ревматоїдний артрит індометацином та його поєднаннями з антиоксидантами. Показано, що призначення селени, аевіту, ретинолу та токоферолу істотно підсилює протизапальну дію індометацину і дозволяє зменшити ризик виникнення побічних ефектів.

Розроблений метод визначення індометацину в біологічних рідинах доступний для біохімічних лабораторій лікувальних закладів, дозволяє контролювати рівень фармакологічно активної форми препарату в плазмі крові в процесі фармакотерапії.

Впровадження результатів дослідження в практику

Результати досліджень впроваджено в навчальний процес кафедр фармакології, факультетської терапії та біохімії Вінницького державного медичного університету та кафедри фармакології Тернопільської державної медичної академії. Матеріали дисертаційної роботи впроваджено в клінічну практику ревматологічного відділення Вінницької обласної клінічної лікарні ім. М.І.Пирогова, ревматологічних відділень Хмельницької та Житомирської обласних лікарень.

Особистий внесок здобувача

Основні результати дослідження, викладені в дисертації, отримані особисто здобувачем. Планування етапів дослідження, облік, аналіз первинного матеріалу, статистична обробка результатів, розробка основних положень, висновків та практичних рекомендацій роботи виконані дисертантом особисто. В методі визначення індометацину в біологічному матеріалі дисертантом розроблено спосіб екстракції індометацину з плазми крові та спосіб усунення спотворюючого впливу гемоглобіну на точність визначення.

Апробація результатів дисертації

Основнi матерiали дисертацiї доповiдались на I Українськiй науковiй конференцiї за участю країн СНД “Актуальнi проблеми клiнiчної фармакологiї” (Вiнниця, 1993), на республіканському симпозіумі “Актуальні проблеми ревматології” (Одеса, 1995), пленумі асоціації та товариства ревматологів України “Актуальні питання ревматизму, дифузних хвороб сполучної тканини та ревматоїдного артриту” (Київ, 1995) на науково-практичній конференції “Еферентні методи лікування в клініці” (Вінниця, 1996), ІІ-му конгресі ревматологів України (Київ, 1997), ІІ-й Всеукраїнській конференції з клінічної фармакології (Вінниця, 1998), на засiданнях обласних наукових товариств фармакологів, ревматологів та терапевтiв.

Публікації

Результати роботи опубліковано у 5 статтях в наукових журналах, в 1 збірнику наукових праць і 6 матеріалах та тезах наукових з'їздів та конференцій різного рівня.

Матеріал, моделі та методи дослідження. Експериментальна частина дослiдження виконана на 273 щурах-самцях популяцiї Вiстар масою 120-250 г, яких утримували на стандартному рацiонi вiварiю.

Модель ревматоїдного артриту - ад'ювантний артрит (АА) щурiв вiдтворювали введенням повного ад'юванта Фрейнда (2 частини вазелiну, 1 частина ланолiну та вбита вакцина БЦЖ з розрахунку 5 мг/мл) пiд плантарний апоневроз задньої лапи щура в об'ємi 0,1 мл. АА розвивався у 80-90% тварин через 10-14 днiв пiсля введення i проявлявся у виглядi реактивного запального процесу суглобів кiнцiвок та хвоста.

Моделями ноцицептивної реакцiї служили тести термiчного та механiчного подразнення у щурiв. В ролi термiчного подразника використовували водяну баню з температурою 58о С, порiг ноцицепції оцiнювали за тривалiстю латентного перiоду вiдсмикування хвоста. У вiдповiдь на механiчне подразнення порiг ноцицепції вивчали на суглобах, уражених ад'ювантним артритом (Ф.П.Тринус та співавт., 1987).

Ульцерогенну дiю індометацину оцiнювали на щурах з ад'ювантним артритом після внутрішньошлункового введення препарату в дозі 5 мг/кг 5 днів. Важкiсть пошкодження слизової оболонки оцiнювали вiзуально. Дефекти дiаметром 1-2 мм вiдносили до виразок першого ступеня важкостi, 2-3 мм - до другого, а бiльше 3 мм - до третього ступеня. Перфоративнi та пенетруючi виразки вiдносили до пошкоджень четвертого ступеня важкостi.

Омепразол тваринам вводили перорально в дозi 50 мг/кг один раз на день протягом 5 днiв. В дослiд тварин брали не пізніше 3 год пiсля останнього введення iнгiбiтора.

При проведенні фармакокінетичних досліджень індометацин тваринам вводили в дозі 30 мг/кг. Концентрацiю iндометацину в плазмi кровi визначали розробленим нами методом (Н.А.Станиславчук и соавт., 1998). Параметри фармакокiнетики розраховували за двочастинною моделлю з урахуванням всмоктування (В.Н.Соловьев и соавт., 1980; А.А.Фирсов, 1981; В.К.Пиотровский, М.Вайс, 1988).

Вмiст вiльного токоферолу в плазмi кровi визначали по реакцiї Емерi-Енгеля з бато-фенантролеїном (Ю.М.Островський, 1979), а ретинолу - за реакцiєю з трифтороцтовою кислотою (С.Wang et al., 1978).

Вмiст вiдновленого глутатiону (Г-SH) в печiнцi визначали в глутатiонтрансферазнiй реакцiї (K.Asaoka, K.Takahashi, 1981). Фосфолiпiди в слизовiй оболонцi шлунка та гомогенатi печiнки визначали за методом, який грунтується на утвореннi гiдрофобного комплексу фосфолiпiдiв з амонiю феротiоцианатом (О.О.Пентюк та спiвавт. 1987). Концентрацiю загальних лiпiдiв в гомогенатi слизової оболонки та печiнки щурiв оцiнювали за реакцiєю з фосфорнованiлiновим реактивом. Вiдновлений глутатiон в гемолiзатi еритроцитiв хворих визначали по Е.Батлер та спiвавт. (1963) за реакцiєю з 5,5-дитiо-2-нiтробензойною кислотою (И.Н.Гадзиева, 1982). Активнiсть гама-глутамiлтранспептидази в гомогенатi слизової оболонки шлунка щурiв (КФ 2.3.2.2) оцiнювали по вивiльненню 4-нiтроанiлiну з гама-глутамiлнiтроанiлiду (Ceriotti, De Nadai-Frank, 1972, 1973). Активнiсть глутатiонредуктази (ГР) (КФ 1.6.4.2) оцiнювали за швидкiстю окислення NADPH в глутатiонредуктазнiй реакцiї (R.Рinto, W.Bartley, 1969) в модифікації R.Olinescu та співавт. (1994). Активнiсть глутатiонпероксидази (ГПО) (КФ 1.11.1.9) в еритроцитах кровi хворих визначали як описано (И.Н.Гадзиева, 1982). Супероксиддисмутазну (КФ 1.15.1.1) активність (СОД) в еритроцитах хворих визначали за здатністю ферменту пригнiчувати утворення формазану з нiтротетразолiю хлористого (В.Н.Чумаков и соавт., 1977). Рівень селену в плазмі крові визначали кінетичним методом (О.А.Ефременко и соавт., 1985). Вмiст продуктiв, що реагують з тiобарбiтуровою кислотою (ПР-ТБК) визначали як описано (Ю.А.Владимиров, А.И.Арчаков, 1972) і перераховували на малоновий диальдегiд за молярним коефiцiєнтом екстинцiї 1,56105. Кон'юговані дiєни (ДКон) та дiєнкетони (ДКет) в сироватцi кровi хворих визначали за методом, описаним Гавриловим В.Б. та Мiшкорудною М.I. (1988).

Статистичну обробку результатiв дослiдження виконували методами бiометрiї (Е.В.Гублер, 1978, В.Н.Носков, 1990).

В клініці обстежено 134 особи. З них було 104 хворих на ревматоїдний артрит та 30 практично здорових людей, якi склали контрольну групу. Дiагноз ревматоїдного артриту встановлювали на основi критерiїв Американської ревматологiчної асоцiацiї (АРА, 1987) i формулювали згiдно класифiкацiї М.Г.Астапенко (1982).

РЕЗУЛЬТАТИ РОБОТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

На першому етапі в експериментальній частині дослідження на моделі ад'ювантного артриту щурів було вивчено ефективність поєднання індометацину з антиоксидантами. Для дослідження було взято класичні природні антиоксиданти токоферол та ретинол у вигляді комбінованого препарату аевіту. Для порівняння оцінено ефективність синтетичного антиоксиданта дибунолу та селену - мікроелемента, який входить до складу простетичної групи основного антиоксидантного фермента глутатіонової антиперекисної системи глутатіонпероксидази. Селен застосовувався у вигляді препарату селена.

Було встановлено, що лікування індометацином зупиняє прогресування ад'ювантного артриту щурів і викликає навіть деякий його зворотній розвиток, про що свідчить зменшення об'єму запалених суглобів та підвищення порогу ноцицептивної реакції (табл. 1). Деякі протизапальні і, опосередковано, антиноцицептивні властивості виявлено у аевіту, дибунолу та селени, причому максимальний протизапальний ефект серед антиоксидантів справляв аевіт. За величиною протизапальної дії ефект аевіту наближався до такого у індометацину.

Поєднання антиоксидантів з індометацином сприяло прискоренню зворотнього розвитку ад'ювантного артриту. В усіх випадках фармакологічний ефект поєднань перевищував дію одного індометацину і носив неповний аддитивний характер. Максимальний протизапальний ефект зареєстровано при одночасному застосуванні індометацину з аевітом та селеною.

Таблиця 1. Вплив антиоксидантів та омепразолу на ефективність лікування ад'ювантного артриту індометацином (M ± m; n = 7)

Примітка: 1. “*” - достовірна відмінність щодо групи “АА без лікування”; 2. “**” - достовірна відмінність щодо групи “Індометацин”

Поріг ноцицепції та об'єм суглобів до лікування прийнято за 100%

Омепразол, не проявляючи власної протизапальної дії істотно потенціював фармакологічний ефект індометацину.

Отримані результати демонструють можливість підвищення ефективності протизапальної терапії індометацином шляхом поєднання з антиоксидантами та омепразолом.

З огляду на відсутність власної протизапальної дії у омепразолу і істотнє потенціювання ним протизапального ефекту індометацину, нами припущено, що омепразол може втручатись в фармакокінетику індометацину, особливо з урахуванням відомостей літератури про здатність омепразолу гальмувати активність мікросомальних монооксигеназ. У зв'язку з цим нами в експерименті оцінено наявність фармакокінетичної інтерференції між індометацином та омепразолом.

З'ясувалось (рис.), що індометацин швидко всмоктується з шлунково-кишкового тракту і через 30 хв реєструється в плазмі крові в досить високій концентрації (більше 50 мкг/мл). Максимальна концентрація зафіксована через 1 год і складає в середньому 74 мкг/мл. Під час -фази зареєстровано другий пік під'йому концентрації, що, очевидно, пов'язано з явищем кишечно-печінкової рециркуляції.

Омепразол істотно уповільнював елімінацію з організму незміненої форми індометацину. Різниця з контролем ставала помітною з четвертої години досліду і наростала до кінця спостереження. Через 12 год концентрація індометацину в групі “Омепразол” була більш ніж у 3 рази вищою ніж у контролі. Уповільнення елімінації індометацину з організму під впливом омепразолу обумовлено, очевидно, зменшенням швидкості його метаболічної інактивації, оскільки омепразол не справляє регуляторного впливу на ниркову екскрецію лікарських засобів. В той же час описана взаємодія омепразолу з лікарськими препаратами на рівні біотрансформації.

Оскільки клінічна цінність будь-якого препарату визначається співвідношенням ефективності та безпечності застосування, нами було оцінено ульцерогенну активність індометацину та його поєднань з антиоксидантами та омепразолом.

Було встановлено, що після п'ятиденного курсу лікування індометацином у всіх тварин в слизовій оболонці шлунка та 12-палої кишки виявляються виразки різних ступенів важкості. Застосування разом з індометацином антиоксидантів в усіх випадках супроводжувалось зменшенням частоти та важкості побічних ефектів (табл. 2). Серед антиоксидантів максимальні гастропротекторні властивості виявлено у ретинолу та токоферолу. Найкраще захищало слизову оболонку шлунку тварин поєднання селени з аевітом, тоді як при застосуванні лише селени спостерігали тільки тенденцію до зменшення кількості виразок. Призначення омепразолу забезпечило зниження ульцерогенної дії індометацину приблизно до 3,3 виразок на 1 тварину, причому переважно за рахунок важких ступенів ураження.

протизапальний індометацин омепразол біологічний

Таблиця 2. Динаміка ульцерогенного ефекту індометацину у тварин з ад'ювантним артритом при поєднанні з антиоксидантами та омепразолом (M±m; n=7)

Примітка: знаком “*” позначено достовірну відмінність щодо групи “Індометацин”

Про здатність токоферолу та селену зменшувати експериментальні виразки повідомляють і al-Moutairy A.R та Tariq M. (1996), які показали, що одночасне застосування селену разом з вітаміном Е посилює гастропротективний ефект як стосовно стресових виразок, так і стосовно виразок, обумовлених введенням нестероїдних протизапальних препаратів.

З'ясувалось, що фармакотерапія індометацином призводила до зниження в слизовій оболонці вмісту загальних ліпідів переважно за рахунок фосфоліпідів. Вміст останніх зменшувався до 30%, очевидно через активацію лiпiдної пероксидацiї в слизовiй оболонцi шлунку, про що свiдчило пiдвищення вмiсту в нiй малонового диальдегiду. Призначення аевіту сприяло збільшенню вмісту фосфоліпідів в слизовій оболонці при одночасному зростанні концентрації загальних ліпідів. Максимальний нормалізуючий вплив на метаболізм ліпідів справляло застосування аевіту разом з селеною.

В експерименті зареєстровано ще один побічний ефект індометацину. Було виявлено, що фармакотерапія індометацином поглиблює викликаний хронічним автоімунним захворюванням дефіцит ретинолу та токоферолу в плазмі крові щурів з АА. Додаткове введення цих вітамінів у вигляді аевіту забезпечувало повне відновлення вмісту вказаних вітамінів в плазмі крові.

Таким чином, в експериментальній частині дослідження обгрунтовано доцільність поєднання індометацину з антиоксидантними вітамінами та селеною, які проявляють власну протизапальну та гастропротективну активність забезпечують максимальний фармакологічний ефект таких поєднань та мінімальний ушкоджуючий вплив на шлунково-кишковий тракт і попереджають гіповітамінізуючий ефект індометацину та хронічного автоімунного запалення. Найперспективнішими для впровадження в клініку видаються поєднання індометацину з ретинолом, токоферолом та аевітом разом з селеною. Ефективність цих комбінацій і була досліджена у хворих на РА в клінічній частині роботи.

З цією метою обстежені хворі (104) були розподілені на 4 репрезентативні групи в залежності від отриманої терапії (індометацином, його поєднаннями з ретинолом, токоферолом, аевітом та селеною). У частини хворих досліджено вплив омепразолу на фармакокінетику індометацину. Про ефективнiсть лікування судили за загальноприйнятими суб'єктивними та об'єктивними клiнiчними ознаками, динамiкою рутинних бiохiмiчних показникiв активностi запального процесу, показникiв стану ПОЛ та антиоксидантної системи, якi оцiнювали на початку контрольованого лiкування i через 2 тижнi терапії.

Дослідження показали, що у хворих на РА має місце активацiя ПОЛ з накопиченням в плазмi кровi первинних та вторинних його продуктів та зниженням показників антиоксидантної системи відповідно активності ревматоїдного запалення.

Дослідження рівня загального селену в плазмі крові хворих на РА виявило істотне його зниження. Якщо у здорових цей показник становив 77,88±3,77 нг/мл, то у хворих на ревматоїдний артрит він був на рівні 51,49±2,6 нг/мл, тобто був зниженим на 33%. Мінімальний рівень селену спостерігали у хворих з максимальною активністю запального процесу. У таких пацієнтів концентрація загального селену в плазмі крові становила 38,13±4,6 нг/мл. Не зареєстровано істотної відмінності між рівнем селену у хворих з мінімальним та середнім ступенем активності РА. Хоча мала місце тенденція зниження цього показника у пацієнтів з середнім ступенем активності запального процесу. Отримані результати вказують на можливу причетність селену до патогенетичних механізмів формування хронічного автоімунного запального процесу і про необхідність включення до комплексу лікування таких хворих препаратів, до складу яких входить мікроелемент селен.

В ході двотижневого курсу лікування індометацином було досягнуто певної позитивної динаміки основних клінічних симптомів захворювання. Зменшилась інтенсивність больового синдрому, тривалість вранішньої скутості, збільшилась функціональна активність суглобів.

Застосування одночасно з індометацином ретинолу та токоферолу разом з селеною сприяло прискоренню зворотнього розвитку клінічних ознак захворювання (табл. 3). Значно швидше купірувався больовий синдром, про що свідчило зменшення величини суглобового та больового індексів. Вказані поєднання забезпечили більшу протизапальну активність і, як наслідок, зменшення індексу набрякання суглобів. За сумарною ефективністю терапії обидва поєднання були однакові. Додаткове застосування разом з індометацином аевіту та селени також прискорювало регрес клініки артриту. Найдинамічнішими були набряковий індекс та суглобовий рахунок - об'єктивні критерії ефективності протизапальної терапії.

Таблиця 3. Динаміка клінічних симптомів у хворих на РА під впливом лікування (M±m)

Примітка: “*” - достовірна відмінність щодо групи “Індометацин”

Наведені дані засвідчують очевидну клінічну ефективність застосування аевіту та селени разом з індометацином в комплексному лікуванні хворих на ревматоїдний артрит.

Лабораторні показники виявились менш чутливими до лікувального впливу індометацину. Протягом контрольованого терміну застосуванням індометацину не вдалось істотно загальмувати активність ПОЛ та досягти рівноваги з показниками антиоксидантної системи (АОС). Лише додаткове призначення антиоксидантів забезпечило значне зниження вмісту первинних та вторинних продуктів ПОЛ, сприяло зростанню більшості факторів антиоксидантного захисту, хоча повної нормалізації досліджених параметрів досягти не вдалось. Міра нормалізації балансу системи ПОЛ:АОС в основному відповідала динаміці клінічних проявів захворювання. У хворих, які разом з індометацином отримували аевіт та селену, спостерігали максимальне збільшення активності ГПО, яке склало 46,2±2,85%, що обумовлено включенням до комплексу лікування обох вітамінів та селени.

Нами проаналізована частота побічних ефектів індометацину при його поєднанні з антиоксидантами. Виявилось, що при застосуванні індометацину побічні ефекти зустрічались у 56% хворих. З них 70% склали побічні ефекти з боку шлунково-кишкового тракту. Під впливом токоферолу з селеною частота побічних ефектів індометацину скоротилась з 56 до 29%, а під впливом поєднання з селеною та ретинолом - до 42%. Максимально скорочувалась частота побічної дії індометацину, коли до комплексу лікування включали аевіт та селену - всього 22,2%.

Таким чином, проведені експериментальні та клінічні дослідження показали, що фармакотерапія індометацином характеризується недостатньою ефективністю та цілим рядом побічних ефектів і тому вимагає оптимізації як з точки зору підвищення ефективності, так і з огляду безпечності.

Включення до комплексу лікування хворих на ревматоїдний артрит ретинолу та токоферолу з селеною дозволило істотно підвищити ефективність терапії та зменшити подразнюючий вплив індометацину на шлунково-кишковий тракт. Максимальний оптимізуючий ефект справляло додаткове призначення аевіту та селени, яке забезпечило більш повну нормалізацію показників ПОЛ та антиоксидантної системи, нормалізацію вмісту селену в плазмі крові, підвищувало терапевтичну активність і викликало найменшу кількість побічних ефектів.

ВИСНОВКИ