Причина та механізм явища гіпертонічного кріогемолізу

Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ НАН УКРАЇНИ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Причина та механізм явища гіпертонічного кріогемолізу

Коваленко Світлана Євгенівна

Харків - 1999

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший

науковий співробітник

Гордієнко Євген Олександрович,

завідуючий відділом низькотемпе-

ратурного кріоконсервування

Інституту проблем кріобіології і

кріомедицини НАН України

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, професор, зав. відділом кріобіофізики Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України МОІСЕЄВ ВІКТОР ОЛЕКСІЙОВИЧ

Кандидат біологічних наук, доцент кафедри прикладної і молекулярної біофізики Харківського державного університету ГАТАШ СЕРГІЙ ВАСИЛЬОВИЧ

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця МОЗ України, відділ медичної біофізики, м. Київ.

Захист відбудеться "21" вересня 1999р. о 14-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за адресою: 310015, Харків - 15, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитись за адресою: 310015, Харків - 15, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розісланий "20" серпня 1999р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

докт. мед. наук, професор Гольцев А.М.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми.

Вивчення причин та механізмів сенсибілізації або підвищення резистентності клітин до охолодження є однією з центральних проблем кріобіології. Починаючи з 70-х років, кріо-біологи ретельно досліджували, головним чином, експериментально, явище гіпертонічного кріогемолізу як окремий випадок цієї загальної проблеми. В результаті проведених до теперішнього часу досліджень експериментально визначені головні закономірності цього явища на феноменологічному рівні, тоді як спроби його теоретичного аналізу враховують або тільки окремі сторони процесу гіпертонічного кріогемолізу, або, навпаки, оперують багатьма факторами, що так чи інакше торкаються цієї проблеми, без чіткого визначення їх внеску у пошкодження клітин за різноманітних умов проведення експерименту. Як походить з аналізу літератури, за теперішній час накопичена достатня кількість експериментальних даних і теоретичних ідей, які підготували грунт для здійснення послідовного точного фізичного аналізу процесів, які відбуваються протягом гіпертонічного кріогемоліза, та для створення теоретичної моделі цього явища. Актуальність теми дисертації з точки зору кріобіології підтверджується неодноразово висловленою в літературі цього профілю думкою, що гіпертонічний кріогемоліз може привносити суттєвий вклад у пошкодження клітин при низькотемпературному консервуванні біологічних об'єктів і що вивчення його механізму приведе до обгрунтування та здійснення нових засобів підвищення резистентності клітин до охолодження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертація виконана за плановою темою Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України "Побудова та експериментальна перевірка кількісної теорії кріоконсервування біоб'єктів", затвердженої постановою Бюро ВМББЕіКФ Президії НАН України від І4.0І.І996 р.

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи було створення теоретичної моделі явища гіпертонічного кріогемолізу, що пояснює його механізм і головні закономірності. Для досягнення поставленої мети вирішувались такі задачі:

1) побудувати теоретичну модель гіпертонічного кріогемолізу, яка враховує, що на клітини впродовж цього процесу сукупно діють декілька фізичних факторів: дегідратація та деформація еритроцитів, латеральний перерозподіл компонентів та термотропне структурне перетворення при 8-13°С у мембрані, ізотропне розтягнення та розрив мембрани.

2) на снові теоретичної моделі гіпертонічного кріогемолізу, що побудована, з'ясувати механізм цього явища і пояснити його головні закономірності;

3) провести експерименти, що підтверджують адекватність висунутих у дисертації теоретичних уявлень про гіпертонічний кріогемоліз.

Наукова новизна отриманих результатів. Висунуто нові уявлення про механізм гіпертонічного кріогемолізу. що надали можливість трактувати багаточисельні фактичні дані на основі невеликої кількості теоретичних передумов. Спираючись на побудовану теоретичну модель, пояснено основні закономірності процесу, що досліджувався. Отримано нові експериментальні дані, які підтверджують адекватність сформульованої у роботі теоретичної моделі гіпертонічного кріогемолізу. Проведені дослідження можуть служити теоретичною базою для цілеспрямованої дії за допомогою різноманітних впливань як на сенсібі-лізацію, так і на підвищення резистентності клітин до екстремальних фізико-хімічних факторів.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані в роботі результати можуть бути практично використовані при розробці нових і удосконаленні існуючих методів кріоконсервування еритроцитів та інших клітин під захистом проникаючих і не проникаючих крізь їхні мембрани кріопротекторів. З'ясування механізму гіпертонічного кріогемолізу дозволить уникнути пошкодження клітин на початкових етапах циклу низькотемпературного консервування.

Особистий внесок здобувача. Поданий у роботі огляд і аналіз літературних джерел, формулювання основних положень і висновків здійснені особисто автором дисертації. Експериментальна частина роботи виконана безпосередньо автором при консультативній допомозі співробітників відділу низькотемпературного консервування ІПКіК НАН України Гордієнко 0.І. та Коваленка І.Ф.

Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертації доповідались та обговорювались на Другому з'їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998 р.) і на Першому з'їзді Українського товариства кріобіології і кріомедицини (Харків, 1995 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 наукових робіт у журналах, збірнику наукових праць і тезах доповідей на наукових з'їздах.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 123 сторінках машинописного тексту і містить вступ, огляд літератури, розділ "Матеріали і методи", основну частину, яка складається з двох розділів, заключення та висновки, а також список використаних 110 літературних джерел. Текст дисертації містить 21 рисунок і дві таблиці на 12 сторінках.

2. Матеріали та методи дослідження

Об'єктом дослідження були еритроцити крові донорів, консервовані на середовищі "глюцигір" зі строком збереження до трьох діб. Клітини осаджували центрифугуванням крові протягом 15 хвилин при 300g;. Потім видаляли плівку лейкоцитів і плазму. До осадку еритроцитів додавали фізіологічний розчин у співвідношенні 1:10 та знову центрифугували за тих же умов. Після трьохкратного відмивання об'ємну концентрацію клітин доводили до 3% за рахунок розведення фізіологічним розчином.

В експериментах використовували водні розчини хлориду натрію марки ХЧ з концентраціями 0,4М, О,8М, 1,2М, 1,6М, 2М та розчини сахарози марки ХЧ на фізіологічному середовищі з концентраціями 0,8М, 1,2М, 1,6М.

Концентрація вільного гемоглобіну в супернатанті визначалася за відомою методикою (Касирський І.0., Олексієв Г.А., 1970).

Візуальне спостереження за еритроцитами протягом гіпертонічного кріогемолізу здійснювалось за допомогою спеціального пристрою до інвертованого мікроскопу МБІ-13, розробленого та виготовленого в ІПКіК НАН України. Під час кожного експерименту проводились фото та кінорегістрація процесу, який досліджувався.

Вимірювання інтенсивності розсіяного розбавленою суспензією еритроцитів світла під кутом 9° до напрямку падаючого пучка з довжиною хвилі 1 мкм здійснювалось на приладі, розробленому та виготовленому співробітниками ІПКіК НАН України спільно з НВФ "Кріокон" (м. Харків). Час 50%-вого гемолізу, що відбувається після занурення еритроцитів в 1М-ний водний розчин гліцерину, вимірювався за відомою методикою (Гордієнко Є.0., Паніна Ю.Є., Гордієнко 0.І., Коваленко І.Ф., 1998).

Статистична обробка результатів експериментів здійснювалась за загальновідомою стандартною методикою.

3. Результати дослідження та їх обговорення

В огляді літератури "Основні закономірності явища гіпертонічного кріогемолізу" надані результати експериментальних та теоретичних даних про гіпертонічний кріогемоліз за минулі 45 років і на основі аналізу літератури сформульовані його головні закономірності, що потребують теоретичного осмислення та узагальнення.

У п.3.1 третього розділу сформульована теоретична модель гіпертонічного кріогемолізу, яка полягає в наступному.

На першій стадії гіпертонічного кріогемолізу при зануренні еритроцитів людини у гіпертонічний розчин не проникаючої до клітин речовини з концентрацією вже після декількох секунд експозиції їх відносний об'єм визначається рівнянням

(1)

де - відносний об'єм клітини, і - поточний і початковий об'єм клітини, , - об'ємна частка внутрішньоклітинного гемоглобіну у вихідному стані, - концентрація не проникаючої до клітин речовини у позаклітинному розчині, - початкова концентрація електроліту в еритроциті.

Оскільки в експериментах з вивчання гіпертонічного кріогемолізу використовуються тільки суспензії з дуже невеликим гематокритом, то концентрацію електроліту поза клітинами можна вважати незмінною, оскільки будь-який можливий перерозподіл речовин між незрівнянно малим об'ємом клітин і великою кількістю оточуючого їх позаклітинного розчину електроліту суттєво не впливає на склад останнього. Очевидно, об'ємна частка гемоглобіну у зневодненій клітині дорівнює

(2)

Значення відповідає так званій гексагональній щільній упаковці молекул гемоглобіну. При ефективна в'язкість внутрішньоклітинного розчину дуже швидко збільшується, наприклад, відповідно до рівняння, аналогічного рівнянню Морі, Ототаке (Хаппель, Бренер, 1976):

 (3)

де - динамічна в'язкість розчину, в якому містяться молекули внутрішньоклітинного гемоглобіну. Таким чином, надмірне зневоднення еритроцитів гіпертонічними розчинами хлориду натрію призводить до значного збільшення ефективної в'язкості внутрішньоклітинного розчину за законом (3). Це відбувається, коли концентрація внутрішньоклітинного гемоглобіну наближається до або перевищує значення , тобто за значеннями концентрації позаклітинного розчину хлориду натрію, що привищують .

Оскільки згибання мембрани при зневодненні клітини відбувається дуже швидко, за час, характерний для зневоднення еритроцитів, то можна вважати, що деформація здійснюється при заданому (до початку зневоднення) розподілі компонентів мембрани вздовж її поверхні. Та згодом у мембрані, що зігнулася, починається більш повільний процес латерального перерозподілу компонентів мембрани (Гордієнко Є.0., Воїнова М.В., 1985). При цьому вільна енергія деформації біслою, що згинається, при заданій формі мембрани зменшується за рахунок концентрування "м'яких" компонентів (тобто компонентів мембрани з меншими модулями пружності) у ділянках мембрани з більшою кривизною, а також за рахунок переміщення більш "жорстких" компонентів в місця з меншою кривизною. Ефект латерального розділення компонентів мембрани є процесом активаційного типу і тому здійснюється за кінцевий термін (близько п'яти-десяти хвилин при 37°С).

Латеральне розділення компонентів мембрани, що відбувається у деформованій мембрані зневодненої клітини, сприяє структурному перетворенню в ній при наступному охолодженні, якщо воно має таку ж спрямованість, що й латеральне розділення компонентів мембрани при термотропному структурному перетворенні, яке спостерігається в діапазоні температур 13 - 8°С. До такого ж висновку призводить і аналіз поданих в огляді літератури експериментальних даних щодо схильності окремих компонентів мембрани до структурного перетворення на відміну від їх одноманітної суміші.

Якщо охолодження еритроцитів призводить до структурного перетворення в області температур 8-13°С, то в результаті цього перетворення площа поверхні його мембрани зменшується на декілька процентів. Для того, щоб це змінення площі відбулося насправді, відповідним чином повинна змінитися форма клітини. Якщо форма клітини при такому структурному перетворенні у її мембрані залишилася б незмінною, то у кінцевій точці цього перетворення в ній виникав би ізотропний натяг, який за законом Гука дорівнював би

(4)

де - відповідний модуль пружності біслойної мембрани еритроциту (0,4 H/м); і - площа поверхні, яка в середньому припадає на одну молекулу мембрани у рідкому і твердому стані у відсутності деформації.

Оскільки радіус кривизни мембрани еритроциту як у звичайному, так і у зневодненому стані змінює свій знак при переході від однієї ділянки мембрани до іншої, то сили, що виникають в мембрані внаслідок структурного перетворення, намагаються зсунути різні шари внутрішньоклітинного розчину відносно один одного і змінити форму клітини таким чином, щоб натяг мембрани обернувся в нуль. Характерний час перетворення форми еритроциту, за який у ньому зникає ізотропний натяг за рахунок структурного перетворення при ІЗ-8°С, можна оцінити як

(5)

де - характерний розмір еритроциту у напрямку зсуву окремих шарів внутрішньоклітинного розчину відносно один одного. У незневодненому або мало зневодненому стані внутрішньоклітинний розчин гемоглобіну в еритроциті має порівняно невелику в'язкість і тому, відповідно до (5), змінення форми клітини відбувається дуже швидко. При цьому ізотропний натяг мембрани, що виникає під час структурного перетворення в ній при охолодженні еритроцитів на другій стадії гіпертонічного кріогемолізу, практично дорівнює нулю. Однак, при характерний час може зростати у сотні і більше разів. Якщо у нормальному еритроциті , то за цей час сягає і більш високих значень.

З урахуванням висунутих уявлень у першому наближенні натяг, який виникає у мембрані еритроцита при структурному перетворенні, змінюється з часом як

де - швидкість охолодження, - інтервал температур, в якому відбувається структурне перетворення у мембрані.

Як відомо, середній час утворення макроскопічної пори в ізотропно розтягненій мембрані, визначається виразом (Гордієнко Є.0., Паніна Ю.Є., 1998р.):

(7)

Графік функції (7) надано на рис. 1(а і б) (криві 1). Як

Залежність ізотропного натягу, який виникає в мембрані клітини при структурному перетворенні в ній, від часу:

а -

б -

видно, навіть невеликий натяг, якщо він діє досить довго, викликає гемоліз, тоді як порівняно великий, але короткотерміновий натяг мембрани, може не спричинити гемолізу.

Залежності (6) за деяких значень параметрів подані на рис. 1(а, б). Як видно, при , що, згідно з викладеними вище уявленнями, відповідає незначному зневодненню еритроциту, натяг мембрани виявляється недостатнім для гемолізу. Але вже при значенні , яке відповідає більш значному зневодненню еритроциту перед охолодженням, натяги, що виникають в мембрані внаслідок структурного перетворення, достатні для гемолізу.

Як випливає з результатів проведених нами чисельних експериментів, натяг мембрани на другому етапі гіпертонічного кріогемолізу суттєво падає зі зменшенням швидкості охолодження суспензії клітин в області структурного перетворення у мембрані. Таким чином, із збільшенням (за абсолютною величиною) швидкості охолодження імовірність гемолізу помітно зростає.

Отже, побудована модель гіпертонічного кріогемолізу пояснює, чому більш швидке охолодження призводить до більшого гемолізу, ніж повільне. Очевидно, що пошкодження еритроцитів виникає, якщо час, за який у мембрані відбувається структурне перетворення, малий у порівнянні з характерним часом релаксації . За висунутими уявленнями зрозуміло, що будь-який вплив на суспензію еритроцитів, в результаті якого збільшується (зменшується) час релаксації , сенсибілізує (підвищує стійкість) клітин до гіпертонічного кріогемолізу.

У п.3.1, виходячи з фізичної моделі гіпертонічного кріогемолізу пояснені сформульовані у розділі 1 головні закономірності цього явища.

Зокрема, той факт, що чутливість еритроцитів на другій стадії гіпертонічного кріогемолізу зростає із збільшенням довготривалості експозиції клітин у гіпертонічному розчині хлориду натрію понадкритичної концентрації на першій стадії гіпертонічного кріогемолізу від нуля до 5-10 хвилин, пояснюється наступним чином. Необхідною умовою виникнення розриву у мембрані в результаті гіпертонічного кріогемолізу є здійснення в ній структурного перетворення при 13 - 8°С, що має місце лише у тому випадку, якщо у мембрані сталося латеральне розділення компонентів, з яких вона складається. Воно як раз і відбувається за час близько 5-10 хвилин. Таким чином, період, за який виникає чутливість еритроцитів до гіпертонічного кріогемолізу, ототожнюється з часом, необхідним для завершення латерального розділення компонентів у мембрані, що зазнає згибання. Це латеральне розділення, у свою чергу, є необхідною умовою для здійснення структурного перетворення у мембрані за 13-8°С. Таким чином, якщо довготривалість першої стадії гіпертонічного кріогемолізу недостатня для того, щоб у мембрані еритроциту відбулося латеральне розділення компонентів на першій стадії і, отже, виникло структурне перетворення у мембрані на другій стадії (за 13-8°С), гемоліз не виникає.

Інша закономірність, яка полягає у тому, що еритроцити стають більш чутливими до охолодження нижче температури 13 -8°С, якщо охолодженню передує експозиція клітин у гіпертонічних розчинах не проникаючої крізь мембрани клітин речовини з осмолярністю понад певне критичне значення (950 - 1300 міліосмолів), також випливає із висунутих теоретичних уявлень щодо гіпертонічного кріогемолізу. Дійсно, якщо осмолярність позаклітинного розчину не перевершує значення близько 1200 міліосмолів, то об'ємна концентрація гемоглобіну в еритроцитах не сягає значення 0,74, і тому час релаксації форми еритроциту під впливом зсуваючих внутрішньоклітинний білковий розчин напруг згідно з (5) залишається недостатньо великим для того, щоб у мембрані еритроцитів, в якій відбувається структурне перетворення, виникав би великий і тривалий натяг, достатній для утворення макроскопічного розриву у відповідності до (7). В цій ситуації реалізується випадок, який відповідає представленому на рис. 1а. Якщо ж зневоднюючий клітини розчин перевищує зазначену вище критичну концентрацію, то ефективна в'язкість внутрішньоклітинного білкового розчину у відповідності до (5) сягає аномально високих значень. При цьому, як витікає з (2) та (6), в процесі структурного перетворення у мембрані виникають натяги, що призводять до макроскопічного розриву, тобто до гемолізу. Цей випадок відповідає ситуації, яка представлена на рис.1б.

Додавання до суспензії еритроцитів поряд з хлоридом натрію або сахарозою проникаючого до клітин кріопротектору (при сталій осмолярності позаклітинного розчину) знижує пошкоджуючий ефект гіпертонічного кріогемолізу, бо при цьому об'єм еритроцитів по мірі надходження кріопротектору до клітин, збільшується, а ефективна в'язкість внутрішньоклітинного білкового розчину відповідно зменшується. Очевидно, ефект зниження чутливості еритроцитів до гіпертонічного кріогемолізу тим значніший, чим швидше проникає до еритроцитів розчинений у позаклітинному середовищі кріопротектор. Крім того, ясно, що збільшення концентрації проникаючого до клітин кріопротектору за незмінній сумарній осмолярності позаклітинного розчину, який містить як проникаючу, так і не проникаючу в клітини речовину, знижує чутливість еритроцитів до гіпертонічного кріогемолізу.

Якщо наприкінці першої стадії гіпертонічного кріогемолізу відмити клітини фізіологічним розчином, то наступне охолодження не призводить до суттєвого гемолізу, оскільки при цьому, навіть якщо у мембрані первісне зневодненої клітини відбулося латеральне розділення компонентів і внаслідок цього при наступному охолодженні виникає вище згадуване структурне перетворення у мембрані, об'єм клітин при їх відмиванні фізіологічним розчином відновлюється до початкового значення. При цьому час релаксації зменшується настільки, що ізотропний натяг мембрани у процесі її структурного перетворення не сягає необхідних для утворення макроскопічної пори значень.

Коли температура на другій стадії гіпертонічного кріогемолізу "миттєво" зменшується від значення, що перевищує 20°С, до температури нижче 10°С, а потім швидко підвищується до температури вище 20°С, гемоліз не відбувається, бо при цьому ізотропний натяг, що виникає у мембрані, хоча й може сягати порівняно великих значень, та час його дії виявляється надто малим для виникнення розриву мембрани у відповідності з (7).

Аналогічно у п.3.2 пояснено інші закономірності гіпертонічного кріогемолізу.

У п.4.1 надані результати візуального спостереження процесу гіпертонічного кріогемолізу під світловим мікроскопом. Результати експериментів підтверджують отримані іншими авторами дані, згідно з якими еритроцити, що були перенесені до помірно гіпертонічних розчинів хлориду натрію або сахарози, набувають форми кренованого у тороїдальній частині і сплющеного у області біля вісі симетрії, дискоциту. У більш концентрованих розчинах (1,2МNaCl і більше) еритроцити набувають форми дуже сплющеного дискоциту.

При переході суспензії еритроцитів, що охолоджується, крізь область температур 13 - 8°С креновані після десятихвилинної експозиції у помірно гіпертонічних розчинах хлориду натрію та сахарози клітини трохи округляються, що свідчить на користь висунутих в роботі уявлень про зменшення площі поверхні мембрани еритроциту при термотропному структурному перетворенні у зазначеній області температур.

Якщо ж ізотермічна експозиція на першій стадії гіпертонічного кріогемолізу здійснюється у розчинах хлориду натрію, концентрація яких дорівнює або перевищує 1,2М, то в процесі наступного охолодження до 0°С зі швидкістю 30°С/хв деякі клітини при переході крізь область температур 13-8°С трансформуються в сфери, після чого втрачають гемоглобін і перетворюються на тіні. Як час сферіфікації, так і час знебарвлювання при цьому за порядком величини становить 10с. При охолодженні ж еритроцитів, що були попередньо проекспоновані в 1,2М і 1,6М-них водних розчинах хлориду натрію або сахарози на протязі десяти хвилин, зі швидкістю 3°С/хв форма клітин в процесі переходу крізь область температур 13-8°С помітно не змінювалась, і знебарвлювання клітин не відбувалося.

Отримані у цьому підрозділі роботи результати мікроскопічного спостереження досить задовільно вкладаються у побудовану теоретичну модель гіпертонічного кріогемолізу.

Створена в роботі теоретична модель гіпертонічного кріогемолізу, зокрема, виходить з припущення, що сенсибілізація еритроцитів до охолодження при гіпертонічному кріогемолізі підвищується по мірі збільшення до декількох хвилин довготривалості експозиції клітин у гіпертонічному водному розчині хлориду натрію або сахарози пов'язана з явищем латерального розділення компонентів у деформованій мембрані. Якщо це припущення є слушним, то занурення еритроцитів після експозиції у гіпертонічному розчині хлориду натрію до гіпотонічного водного розчину проникаючої до клітин речовини буде призводить до наступних ефектів. Після декількох хвилин попередньої експозиції клітин у гіпертонічному водному розчині хлориду натрію подальший гіпотонічний гемоліз повинен відбуватися у більш короткий термін, ніж при нульовому терміні експозиції, тому що у результаті латерального розділення компонентів мембрани в ній з'являються окремі ділянки, збагачені менш тривкими ліпідами і, як наслідок, гемоліз буде відбуватися за більш короткий час. Для того, щоб підтвердити цей теоретичний прогноз, була експериментально вивчена залежність часу 50%-вого гемолізу еритроцитів у 1М-ному водному розчині гліцерину від довго тривалості експозиції у гіпертонічних водних розчинах методом світлорозсіювання. Попередня експозиція проводилася у водних розчинах хлориду натрію з концентраціями 0,4М, 0,8М, 1,2М і 2,ОМ та у розчинах сахарози на фізіологічному розчині (0,4М, 1,2М і 1,6М) за 37°С. Отримані результати надані у вигляді графіків на рис.2(а,б).

Залежність часу 50%-вого гемолізу в 1М-ному водному розчині гліцерину від тривалості попередньої експозиції еритроцитів в гіпертонічному водному розчині:

а - з концентраціями хлориду натрію 0,4М, 0,8М, 1,2М та 2М б - з концентраціями сахарози 0,4М, 1,2М та 1,6М.

Дійсно, із збільшенням довго тривалості експозиції клітин у гіпертонічних розчинах хлориду натрію та сахарози до де кількох хвилин час подальшого за цією експозицією гіпотонічного гемолізу значно зменшується в порівнянні з нульовою тривалістю експозиції. Як видно з наданих на рис.2(а,б) даних, із зростанням концентрації не проникаючої до клітин розчиненої у позаклітинному середовищі речовини зазначений ефект збільшується, що у світлі висунутих уявлень про гіпертонічний кріогемоліз трактується наступним чином. Попереднє зневоднення еритроцитів відбувається дуже швидко. При цьому мембрана еритроциту, що зневоднюється, на початку процесу гіпертонічного кріогемолізу деформується при незмінному (початковому) розподілі компонентів мембрани у зв'язку з тим, що характерний час латерального перерозподілу компонентів мембрани значно перевершує час зневоднення клітин. Потім відбувається більш повільний процес латерального перерозподілу, оскільки він призводить до зменшення вільної енергії деформації мембрани і, такім чином, є термодинамічно вигідним процесом. Але, з іншого боку, при цьому зменшується ентропія змішування, що з точки зору термодинаміки є невигідним ефектом. Оскільки зазначені ефекти діють у протилежних напрямках, ступінь латерального розділення залежить від величини деформації: чим більше деформація, тим більше ступінь латерального розділення. Таким чином, у більш гіпертонічному розчині, який, очевидно, призводить до більш значної деформації мембрани клітини, що зневоднюється, ефект латерального розділення компонентів мембрани більш наявний, і тому гіпотонічний гемоліз виникає швидше, ніж у менш гіпертонічному розчині.

Таким чином, отримані в роботі експериментальні результати підтверджують надані вище теоретичні прогнози і сформульовану в роботі фізичну модель гіпертонічного кріогемолізу.

У світлі висунутих уявлень про причину та механізм гіпертонічного кріогемолізу можна стверджувати, що внесок цього явища у кріопошкодження клітин залежить від умов низькотемпературного консервування. Якщо заморожування - відігрів еритроцитів здійснюється під захистом не проникаючого до клітин кріопротектору і довготривалість експозиції клітин у кріозахисному середовищі до початку охолодження становить близько 5-10 хвилин, то пошкодження клітин за рахунок гіпертонічного кріогемолізу може вносити суттєвий внесок до загального кріопошкодження. Навіть порівняно невелике пошкодження клітин на початкових етапах циклу низькотемпературного консервування багаторазово посилюється на наступних етапах. Враховуючи, що зазвичай під захистом не проникаючого до клітин кріопротектору охолодження здійснюється з високою швидкістю, можна помітити, що у цьому випадку як раз виконуються умови, за яких виникає пошкодження клітин за рахунок гіпертонічного кріогемолізу. Це пошкодження має місце ще до початку кристалізації у зразці, що заморожується, і може суттєво відбитися на результаті всього циклу кріоконсервування в цілому саме тому, що вихідний стан клітин дуже впливає на збереження клітин під час заморожування - відігріву. Якщо ж заморожування еритроцитів здійснюється під захистом проникаючого до клітин кріопротектору. то небезпека пошкодження клітин за рахунок гіпертонічного кріогемолізу значно знижується або зовсім відсутня. Наведені аргументи пояснюють, чому внесок гіпертонічного кріогемолізу до кріопошкодження за невеликої швидкості охолодження, яке, як правило, потребує наявності у кріозахисному середовищі порівняно великої кількості проникаючого кріопротектору, зневажено малий у порівнянні з іншими факторами.

Внаслідок значного розбігу значень клітинних параметрів у суспензії на протязі гіпертонічного кріогемолізу різні клітини зазнають гемолізу в неоднакові моменти цього процесу. Як випливає з висунутих нами теоретичних уявлень, у першу чергу руйнуються клітини з найменшими значеннями коефіцієнту лінійного натягу на границі розриву, що виникає в мембрані, та з найбільшими значеннями коефіцієнту поверхневого розтягу мембрани. Величини обох цих параметрів залежать від стану ліпідів і білків у мембрані та прилеглих до них шарів глікокаліксу. Тому будь-яке діяння, що призводить до змінення стану цих компонентів мембрани, очевидно, може відповідно вплинути на результат гіпертонічного кріогемолізу. З цієї причини перспективним, на наш погляд, залишається пошук засобів підвищення резистентності еритроцитів до гіпертонічного кріогемолізу під дією різноманітних фізико-хімічних факторів, які впливають на стан їхніх мембран.

Висунуті в роботі теоретичні уявлення щодо пошкодження еритроцитів людини при гіпертонічному кріогемолізі мають універсальний характер і в подальшому без принципових ускладнень можуть бути застосовані для аналізу кріопошкодження інших клітин.

Висновки

1) За нашого часу в результаті багаточисельних експериментальних досліджень визначено головні закономірності явища гіпертонічного кріогемолізу на феноменологічному рівні і тим самим підготовлено грунт для створення адекватної теоретичної моделі цього явища, що пояснює його експериментальне визначені закономірності.

2) Методами теорії пружності тонких оболонок, гідродинаміки за малих чисел Рейнольдса, термодинаміки необоротних процесів перервних систем і теорії імовірностей проведено фізично точний аналіз процесів, які при поєднаній дії викликають гіпертонічний кріогемоліз.

3) Показано, що рівень пошкодження еритроцитів людини внаслідок гіпертонічного кріогемолізу визначається концентрацією позаклітинного розчину, ступенем зневоднення клітин і латеральним розділенням складових компонентів їх мембран, в'язкістю внутрішньоклітинного білкового розчину, швидкістю охолодження клітинної суспензії і величиною ізотропного натягу клітинної мембрани, що виникає в результаті термотропного структурного перетворення в ній при 13-8°С.

4) Створена фізично точна теоретична модель гіпертонічного кріогемолізу, котра, на відміну від існуючих, ураховує основні фактори, що впливають на нього, і причинно-наслідкові зв'язки між ними, а також пояснює головні закономірності цього явища.

5) Визначено, що необхідною умовою для виникнення гіпертонічного кріогемолізу є зменшення на 3-5% площі, яка в середньому припадає на одну молекулу в недеформованій мембрані, внаслідок її термотропного структурного перетворення в області температур ІЗ-8°С.

6) Встановлено, що характерний час змінення форми зневодненого еритроциту під дією сил, які виникають внаслідок ізотропного натягу його мембрани, є прямо пропорційним ефективній в'язкості внутрішньоклітинного розчину та обернено пропорційним модулю ізотропного розтяжіння клітинної мембрани.

7) Методом світлової мікроскопії показано, що пошкодження еритроцитів при гіпертонічному кріогемолізі відбувається в області температур 13-8°С та супроводжується сферіфікацією та обезбарвленням клітин за декілька десятків секунд.

8) Методом малокутового світлорозсіяння встановлено, що час 50%-вого гемолізу еритроцитів в 1М-ному водному розчині гліцерину зменшується після попередньої 5-10 хвилинної експозиції клітин в гіпертонічних розчинах хлориду натрію та сахарози на 25-45%.

9) Явище гіпертонічного кріогемолізу вносить суттєвий вклад в загальне пошкодження еритроцитів при заморожуванні-відтаюванні, якщо позаклітинний розчин містить тільки не проникаючий в клітини кріопротектор і охолодження здійснюється з великою швидкістю, а саме зі швидкістю, при якій характерний час змінення форми зневодненого еритроциту значно перевищує час, за який відбувається термотропне структурне перетворення мембрани в області 13-8°С.

10) Гіпертонічний кріогемоліз не вносить суттєвого вкладу в результат кріоконсервування еритроцитів під захистом швидко проникаючого в клітини кріопротектора.

гіпертонічний кріогемоліз феноменологічний клітина

Список опублікованих за темою дисертації праць

І.Гордиенко Е.А.. Коваленко С.Е.Биофизическая модель явления гипертонического криогемолиза//Пробл. криобиологии.- 1996.-№4.-С.24-32.

2.Гордиенко Е. А. , Коваленко С. Е. Основные закономерности явления гипертонического криогемолиза//Пробл. криобиологии. -1997. -№З. -С.3-7.

3.Коваленко С.Е.Физическая модель явления гипертонического криогемолиза//Вестн. ХГУ. -№422. -Биофиз. вестн. -вып. 2. -1998. -С. 82-84.

4.Гордиенко О.И., Коваленко С.Е.Физический анализ взаимосвязи между механизмами явлений гипотонического гемолиза и гипертонического криогемолиза//Актуальные вопросы репродуктологии и криомедицины.-Харьков.-ХГМУ.-1998. -С.205-209.

5.Гордиенко Е.А., Коваленко С.Е., Пушкарь Н.С.Физическая модель сенсибилизации зритроцитов человека к охлаждению в гипертонических растворах//Тезисы 1 сьезда Украинского товарищества криобиологии и криомедицины.-1995.-Харьков.-С. 48-50.

6.Гордієнко Є.0., Коваленко С.Є.Причина та механізм явища гіпертонічного кріогемолізу/Тези доповідей II з'їзду Українського біофізичного товариства.-Харків.-1998.-С.201.

Анотації

Коваленко С.Є.Причина та механізм явища гіпертонічного кріогемолізу.- Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеню кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 кріобіологія і кріоме-дицина.- Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 1999.

Створена теоретична модель гіпертонічного кріогемолізу, який спостерігається при охолодженні клітинної суспензії після попередньої експозиції еритроциту в гіпертонічному розчині непроникаючої речовини. Показано, що пошкодження є результатом деформації, яка виникає в мембрані клітини при дегідратації еритроцитів і внаслідок термотропного структурного перетворення в мембрані, тоді як окремо ці фактори не пошкоджують клітини необоротно в широкому діапазоні швидкостей охолодження та концентрацій позаклітинного гіпертонічного розчину. Чисельні експерименти доводять, що при достатньо великих концентраціях позаклітинного розчину та достатньо швидкому охолодженні клітинної суспензії в мембрані еритроциту може утворюватися макроскопічна пора, і це призводить до необоротного пошкодження клітини. Модель пояснює головні закономірності цього явища, виходячи з невеликої кількості вихідних припущень.

Ключові слова: еритроцит людини, гіпертонічний кріогемоліз, теоретична модель, кріопошкодження.

Аннотация

Коваленко С.Е.Причина и механизм явлення гипертонического криогемолиза.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология и криомедицина.- Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины. Харьков, 1999.

Создана теоретическая модель гипертонического криогемолиза, который наблюдается при охлаждении клеточной суспензии после предварительной экспозиции эритроцитов в гипертоническом растворе непроникающего вещества. Показано, что повреждение является результатом деформации, которая возникает в мембране клеток при обезвоживании, и вследствие термотропного структурного превращения в ней, тогда как по отдельности эти факторы не повреждают клетки необратимо в широком диапазоне скоростей охлаждения и концентраций внеклеточного гипертонического раствора. Численные эксперименты доказывают, что при достаточно больших концентрациях внеклеточного раствора и достаточно быстром охлаждении клеточной суспензии в мембране эритроцита может образоваться макроскопический разрыв, и это приводит к необратимому повреждению клеток. Модель обьясняет основные закономерности этого явлення, исходя из небольшого количества исходных предположений.

Ключевые слова: эритроцит человека, гипертонический криогемолиз, теоретическая модель, криоповреждение.

Summary

Kovalenko S.E. The reason and mechanism of hypertonic cryohemolysis phenomenon.-Manuscript.

Thesis for scientific candidate`s degree on speciality 03.00.19 - cryobiology and cryomedicine.-Institute for problems of cryobiology and cryomedicine of the National Academy of Sciences of the Ucraine, Kharkov, 1999.

The theoretical model of hypertonic cryohemolisis observed during the cooling of cell suspension after preliminary erythrocyte exposure in hypertonic solution of nonpenetrating substance has been created. Damaging was shoun to be occured as a result of deformation, appearing in the cell membrane during the dehydration of erythrocytes and as a result of membrane thermotropic structural transition, while separately these factors don`t damage the cells irreversibly in a wide regions of cooling rates and extracellular hypertonic solution concentrations. Numerical experiments proved that under the extracellular solution concentrations large enough and rather rapid cooling rates of cell suspension the macroscopic pore can be formed, that leads to the irreversible cell damage. The model created explains the main regularities of this phenomenon determined experimentally basing on the small quanta of the input assumptions.

Key words: human erythrocyte, hypertonic cryohemolysis, theoretical model, cryoinjury.

Размещено на Allbest.ru