Експрес-оцінка хімічних факторів водного та повітряного середовища на підставі еритроцитарної моделі

Размещено на http://allbest.ru

УКРАЇНСЬКИЙ НАУКОВИЙ ГІГІЄНІЧНИЙ ЦЕНТР

Слюсаренко Ганна Володимирівна

УДК [614.777+614.71]:615.9:612.111

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ЕКСПРЕС-ОЦІНКА ХІМІЧНИХ ФАКТОРІВ ВОДНОГО ТА ПОВІТРЯНОГО СЕРЕДОВИЩА НА ПІДСТАВІ ЕРИТРОЦИТАРНОЇ МОДЕЛІ

14.02.01 -гігієна

Київ 1999

Дисертація є рукописом.

Робота виконана в Науково-дослідному інституті загальної і комунальної гігієни ім. О.М.Марзеєва Міністерства охорони здоров'я України.

НАУКОВИЙ КЕРІВНИК:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Антомонов Михайло Юрійович, Науково-дослідний інститут загальної та комунальної гігієни ім. О.М.Марзєєва Міністерства охорони здоров'я України, завідувач лабораторії

ОФІЦІЙНІ ОПОНЕНТИ:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Томашевська Людмила Анатолієвна, Український науковий гігієнічний центр Міністерства охорони здоров'я України, провідний науковий співробітник

доктор медичних наук, професор Степаненко Геннадій Панасович, Національний медичний університет ім. 0.0. Богомольця Міністерства охорони здоров'я України, професор кафедри пропедевтики гігієни, військової та радіаційної гігієни

ПРОВІДНА УСТАНОВА: Інститут екогігієни і токсикології імені Л.І.Медведя, відділ гігієни полімерів та токсичних відходів і лабораторія мутагенезу, Міністерство охорони здоров'я України, м.Київ

Захист відбудеться ''14'' травня 1999 року о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.604.01 в Українському науковому гігієнічному центрі за адресою: 253660, м. Київ-94, вул. Попудренка, 50

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Українського наукового гігієнічного центру, м. Київ, вул. Попудренка, 50

Автореферат розісланий ''13'' квітня 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Б.Ю.Селезньов

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми: Серед головних проблем XX століття найбільш значною є екологічна, яка пов'язана зі зміною середовища та умов життя людини (Сердюк А.М., 1996). Результати гігієнічних та екологічних спостережень за станом забруднення головних об'єктів навколишнього середовища (повітря, води та грунту) в Україні свідчать, що ситуація може бути кваліфікована як екстремальна (Кундієв Ю.І., Гончарук Є.Г. та ін., 1995). Сучасні підходи до гігієнічної оцінки якості середовища вимагають включення до системи гігієнічного контролю великої кількості різноманітних біоіндикаторів, використання біотестування.

Зростання антропогенного навантаження на джерела водопостачання, низька ефективність роботи водопровідних очисних споруд, часто незадовільний стан систем розподілу води обумовлюють необхідність пошуку альтернативних рішень забезпечення населення нашої країни якісною водою та її гігієнічної оцінки на різних етапах водопідготовки (Волощенко О.И„ Прокопов В.А. и др., 1991; Прокопов В.А., Тетенева И.А. и др., 1995).

В умовах різноманітного за своїм складом забруднення атмосферного повітря десятками токсичних речовин (Присяжнюк В.Е. и др., 1995) актуальним є їх індивідуальне та комплексне гігієнічне дослідження.

Важливим моментом при цьому є вибір адекватних методів дослідження. Система крові - одна з найрухливіших систем, яка швидко реагує на зміни гомеостазу організму внаслідок хімічного пошкодження (Трахтенберг И. М. и др., 1987). У гігієнічній практиці використовується ряд методів визначення еритроцитарних характеристик: базофільної зернистості (Лазарова С., Стоев С., Ибритимов Н. 1995), ферментативної активності (Власкина С.Г., Мамаева Е.М., 1994), цитометричних показників (Аверьянова Н.И, Аксенова В.М. и др., 1995) та ін.. Біотестування з використанням еритроцитів дає можливість вивчати гемотоксичність проб забрудненої води та повітря, їх кінетику та порогові характеристики. Дослідження Е.Г. Давлетова (1974), В.А. Вороніна, В.В.Лентякова (1989), В.О. Кравчука, І.Н. Міхайленко (1991), С.Г. Власкіної, Е.М. Мамаєвої (1994), French C.L., Baldwin L.A. (1995) та ін. свідчать про перспективність застосування у гігієнічній практиці методів визначення гемолітичних властивостей еритроцитів та конформаційних властивостей гемоглобіну, зокрема, кислотної резистентності еритроцитів та вмісту лігандних форм гемоглобіну, що можуть бути індикаторами гемотоксичності.

Одним з актуальних завдань токсикології є оптимізація методів дослідження токсичних процесів, котрі виникають в організмі при дії багатьох активних речовин (Кундиев Ю.И., Микульская И.А., 1993). Удосконалення еритроцитарних тестів для гігієнічної оцінки хімічних факторів навколишнього середовища з використанням математичного моделювання сприятиме оптимізації методів токсикологічних досліджень, що є актуальним для токсикології та гігієни.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами: Дослідження виконано в межах науково-дослідної роботи відділу прикладної фізіології та біохімії НДІ загальної та комунальної гігієни ім. О.М.Марзєєва "Разработка методических подходов к оценке общетоксического комбинированного действия водных и воздушных загрязнителей (на модели системы крови)" (Шифр ОК.92.16.474, № ДР 0193U039169).

Мета дослідження: розробити методичні підходи до використання еритроцитарної моделі для гігієнічної експрес-оцінки токсичної дії хімічних факторів навколишнього середовища.

Задачі дослідження: 1. Визначити закономірності ізольованої дії (залежності "час - ефект" та "концентрація - ефект") деяких хімічних факторів навколишнього середовища (продуктів хлорування та озонування води, органічних розчинників, солей важких металів) на гемотоксичність з використанням еритроцитарної моделі іn vitro.

2. Дослідити гемотоксичність проб водного та повітряного середовища на еритроцитарній моделі іn vitro.

З. Зіставити результати досліджень з гемотоксичності та мутагенності хімічних факторів водного та повітряного середовища з даними щодо загальної токсичності цих факторів.

4. Розробити методику розрахунку параметрів гемотоксичності як допоміжних характеристик при гігієнічній оцінці хімічних факторів навколишнього середовища.

Наукова новизна одержаних результатів: В роботі вперше досліджено залежності "доза-ефект" для гемотоксичної дії хімічних речовин на еритроцитарній моделі іn vitro.

Вперше встановлено закономірності впливу фенолу, ацетату свинцю та хлоралгідрату на процес метгемоглобінутворення. Подальший розвиток дістало дослідження впливу на метгемоглобінутворення бензальдегіду, бензолу, біхромату калію, бутанолу-1, гідрохінону, дихлоретану, монохлороцтової кислоти, нітрату свинцю, нітрату церію, оцтової кислоти, селеніту натрію, тетрахлориду вуглецю, формальдегіду, фурфуролу, хлориду лантану, хлориду стронцію.

На підставі проведених досліджень вперше розроблено методику розрахунку параметрів гемотоксичності з використанням еритроцитарної моделі та математичного моделювання.

Практичне значення одержаних результатів: Доведена можливість використання еритроцитарної моделі для гігієнічної експрес-оцінки ефективності роботи очисних споруд в залежності від способу водопідготовки, а також забруднення повітряного середовища міст України (на прикладі проб аерозольної частини повітря Донецька, Сєвєродонецька, Маріуполя, Рівного, Сум, Севастополя).

Впровадження результатів дослідження: Матеріали дослідження використовувались у практичній роботі Київводоканалу при розробці нових технологічних режимів водопідготовки.

На основі отриманих результатів видано інформаційний лист по проблемі "Гігієна навколишнього середовища" № 86-98 "Експрес-метод визначення гемотоксичності хімічних факторів на підставі еритроцитарної моделі'' (Київ: Укрмедпатентінформ, 1998), який впроваджено в Інституті екогігієни і токсикології ім. Л. І. Медведя та у НДІ "Еластік" при оцінці нешкідливості матеріалів та виробів, що контактують з кров'ю, та виробів і матеріалів медичного призначення.

Результати досліджень впроваджено у навчальний процес медичного факультету кафедри пропедевтики гігієни, військової та радіаційної гігієни (курс лекцій та практичних занять з пропедевтики гігієни, розділ "Методи гігієни") та факультету підвищення кваліфікації викладачів гігієни медичних вузів україни (програма первинного циклу) Національного медичного університету їм. 0.0. Богомольця МОЗ України.

Особистий внесок здобувача: Дисертант особисто проаналізував відповідну літературу, самостійно виконав планування та проведення досліджень, аналіз отриманих результатів, підготовку матеріалів до друку. В роботі використано результати досліджень мутагенності повітря, виконаних кандидатом біологічних наук, старшим науковим cпівробітником, завідувачем лабораторії біоіндикації мутагенів О.М. Дуганом. Математичну обробку результатів досліджень виконано за участю молодшого наукового співробітника лабораторії математичних методів у гігієні В. О. Єлізарова. Об'єм самостійних досліджень становить 85-90%.

Апробація результатів дисертації: Результати дослідження оприлюднено на XIII з'їзді гігієністів України "Пріоритетні проблеми гігієнічної науки, медичної екології, санітарної практики та охорони здоров'я" (Київ, 1995), на наукових семінарах в УНГЦ МОЗ України, Інституті онкології та радіології МОЗ України.

Публікації: Результати дисертації опубліковані в 4 статтях у наукових журналах, в З статтях у збірниках наукових праць, у 1 тезах XIII з'їзду гігієністів України, за матеріалами роботи виданий 1 інформаційний лист.

Обсяг та структура дисертації: Дисертація викладена на 146 сторінках машинопису, ілюстрована ІЗ рисунками та 43 таблицями і складається із вступу, 5 розділів, висновків, списку використаних літературних джерел (зі 221 найменувань, з яких 119 вітчизняних та країн СНД і 102 іноземних) та 5 додатків.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи досліджень

Були використані наступні методики: визначення кислотної резистентності еритроцитів (Базарнова М.А 1982), визначення вмісту окси-, дезокси- та метгемоглобіну (Кушаковский М.С., 1968; Веnеsch R.Е., Веnesch R.Е., Yung S., 1973), напівкількісне дослідження мутагенності хімічних речовин (Аmes еt al., 1973) з використанням двох тест-штамів Salmonella typhymurium (ТА 100 і ТА 98) та печінкової фракції 8-9, отриманої від 6 самців щурів лінії Вістар.

Проведено 58 серій експериментів, з них 47 з вивчення гемотоксичності та 11 з вивчення мутагенності. В експериментах було використано 28 проб крові барана.

В цілому досліджено 19 хімічних речовин, які були переважно водними або убіквітарними забруднювачами (ацетат свинцю, бензальдегід, бензол, біхромат калію (БК), бутанол-І, гідрохінон, дихлоретан, монохлороцтова кислота (МХО), нітрат свинцю, нітрат церію, оцтова кислота (ОК), селеніт натрію, тетрахлорид вуглецю (ТХВ), фенол, формальдегід, фурфурол, хлоралгідрат, хлорид лантану, хлорид стронцію), 7 типів проб води, котрі були одержані на різних етапах водопідготовки (вихідна вода (ВВ), хлорування (дози активного хлору 5 мг/л та 10 мг/л), озонування (дози озону 4,25 мг/л та 6 мг/л), відстоювання, фільтрація, вторинне озонування та вторинне хлорування), 6 типів проб аерозольної частини атмосферного повітря міст України (Донецьк, Маріуполь, Рівне, Севастополь, Сєверодонецьк, Суми).

Лімітуючою ознакою при обгрунтуванні ГДК досліджених хімічних речовин була переважно санітарно-токсикологічна, за винятком бензальдегіду, гідрохінону, фурфуролу, фенолу (органолептична) та ОК (загальносанітарна). З метою з'ясування чутливості та інформативності запропонованих методів гігієнічної експрес-оцінки вибрані речовини, що характеризуються різним класом небезпеки та різними типами тропного впливу на людину.

Результати експериментів оброблено за допомогою загальноприйнятих методів математичної статистики, також проведено математичне моделювання динаміки гемолізу.

Результати досліджень та їх обговорення

еритроцитарний гігієнічний гемотоксичність

Експериментальне дослідження включало п'ять етапів. Перший (підготовчий) - відпрацювання методик, вивчення впливу консерванту диметилсульфоксиду (ДМСО) на гемоліз клітин. Другий - визначення можливості застосування еритроцитарної моделі для з'ясування гемотоксичності хімічних речовин-забруднювачів води та повітря. Третій - аналіз гемотоксичності проб води та повітря. Четвертий - дослідження мутагенної активності деяких хімічних речовин, а також проб води на різних етапах водопідготовки. П'ятий - розробка методики розрахунку параметрів гемотоксичності.

Використання еритроцитарної моделі для визначення гемотоксичності хімічних речовин

На підготовчому етапі досліджень була визначена оптимальна концентрація гемолітичного розчину (0,0001 н НСІ) та проведені експерименти з вивчення можливої дії ДМСО (в концентраціях 5, 10, 15, 20, 25та 30мкл/л), котрий є розчинником проб води та повітря, на процес гемолізу еритроцитів. В результаті з'ясовано, що у вказаному діапазоні концентрацій ДМСО не впливав на швидкість гемолізу еритроцитів.

З використанням методу визначення кислотної резистентності еритроцитів проведені дослідження 19-ти хімічних речовин-забруднювачів на наявність гемотоксичності. Усі речовини були послідовно титровані з урахуванням їх розчинності.

В результаті проведення серії експериментів спостерігалися три типи реагування "речовина-еритроцит": позитивний, негативний та нейтральний, які наведені на рис.1.

До речовин, які демонструють позитивний тип реагування, віднесли МХО, формальдегід, ОК, фурфурол, бензальдегід та фенол. Ці речовини проявляли виражену гемолітичну активність. Для них характерна наступна залежність "концентрація-ефект": з послідовним зменшенням концентрації речовини показник часу 50°/о-го гемолізу клітин наближався до контролю. Це дозволило визначити концентрації речовин, які зменшували процес контрольного гемолізу у два рази. Для МХО ця концентрація складала 0,0065 мг/мл, для ОК - 0,0012 мкл/мл, для формальдегіду - 5 мг/мл, для бензальдегіду - 0,19 мкл/мл, для фурфуролу -11,2 мкл/мл, для фенолу - 0,55 мг/мл. Також було розхраховано інтегральні характеристики процесу гемолізу та залежність мала такий вид: у=a+bx (де у -інтегральні оцінки динаміки, х - значення концентрації фактора, а, b - коефіцієнти моделі).

До речовин з нейтральним типом реагування були віднесені хлоралгідрат, хлорид лантану, БК та нітрат церію, які не справляли вірогідного впливу на швидкість гемолізу у дослідженому діапазоні концентрацій (Див. Рис. 1).

До речовин з негативним типом реагування віднесли бензол, дихлоретан, нітрат свинцю, хлорид стронцію, ацетат свинцю, гідрохінон, ТХВ, бутанол-1 та селеніт натрію. Показник часу 50%-го гемолізу для речовин цієї групи був або суттєво більшим за контрольний (наприклад, для нітрату свинцю у концентраціях 4 мг/мл (3 хв), 2 мг/мл (3,97 хв), 1 мг/мл (3,585 хв) контроль (1,76 хв)) або взагалі не міг бути визначений (Див. Рис. 1 - на прикладі ацетату свинцю) через відсутність вірогідних ознак гемолізу протягом часу спостереження, імовірно, у зв'язку з проходженням антагоністичного процесу ущільнення мембран еритроцитів. На користь цього свідчить підвищення показника екстинції еритроцитарної суміші при відсутності утворення осадку.

За результатами визначення вмісту лігандних форм гемоглобіну досліджувані речовини було розділено на 2 групи. Першу групу склали хлоралгідрат, хлорид стронцію, хлорид лантану, селеніт натрію, бутанол-1 та дихлоретан. Додавання цих речовин суттєво не змінювало вміст окси- дезокси- та метгемоглобіну у тест-системі. До другої групи віднесли фенол, ацетат свинцю, нітрат свинцю, формальдегід, нітрат церію. Додавання цих речовин суттєво підвищувало вміст метгемоглобіну та, відповідно, знижувало вміст окси- та дезоксигемоглобіну. Наприклад, додавання формальдегіду у концентраціях 0,5-2 мг/мл у 3,8 рази підвищувало вміст метгемоглобіну в еритроцитах. Для фенолу (10-5 мг/мл) підвищення вмісту метгемоглобіну складало 1,3-1,7 рази, для ацетату свинцю (1-0,1 мг/мл) у 2,1-2,7 рази, для нітрату свинцю (4-І мг/мл) у 3,4-3,7 рази. Нітрат церію при несуттєвому впливі на вміст метгемоглобіну знижував вміст оксигемоглобіну у 1,2 - 1,7 рази та підвищував вміст дезоксигемоглобіну у 2,3 - 3,4 рази. Було визначено концентрації, які найбільш змінюють процес утворення лігандних форм. Для нітрату церію це 0,2 мг/мл, для фенолу - 7 мг/мл, для ацетату свинцю - 0,2 мг/мл, для нітрату свинцю - 4 мг/л, для формальдегіду - 2 мг/мл. Отже, визначення вмісту лігандних форм гемоглобіну дозволило вивчити вплив важких металів та інших токсичних речовин на конформаційні властивості гемоглобіну.

Характер впливу досліджених речовин на динаміку вмісту окси-, дезокси- та метгемоглобіну в еритроцитах відрізнявся від їх впливу на процес гемолізу: речовини, що активно впливали на вміст лігандних форм гемоглобіну, належали до різних груп за впливом на процес гемолізу еритроцитів. Очевидно, це пов'язано з різними механізмами дії речовин на еритроцити (вплив на мембрану еритроцитів, або безпосередньо на гемоглобін). Таким чином, визначення вмісту лігандних форм гемоглобіну доповнює визначення кислотної резистентності еритроцитів при вивченні гемотоксичності хімічних забруднювачів. Особливо це має значення для солей важких металів, котрі, за даними нашого дослідження, здатні гальмували процес гемолізу еритроцитів.

Експериментальні дані щодо перевірених на гемотоксичність речовин були проаналізовані з урахуванням їх класів небезпеки, лімітуючих показників шкідливості та загальнотоксичних властивостей. Відзначається висока чутливість та інформативність методу визначення кислотної резистентності еритроцитів для окремих речовин-забруднювачів нейротропної дії. Не було виявлено вірогідної залежності між лімітуючими показниками шкідливості речовин та їх гемолітичними властивостями, котрі було досліджено на еритроцитарній моделі.

Використання еритроцитарної моделі для експрес-аналізу проб води та повітря

За допомогою тесту визначення кислотної резистентності еритроцитів був проведений аналіз середньомісячних проб питної води (червень 1996 року), отриманої з Дніпровського водопроводу на різних етапах водопідготовки, та проб аерозольної частини атмосферного повітря деяких міст України (Донецьк, Маріуполь, Рівне, Севастополь, Сєверодонецьк, Суми).

Результати експериментального дослідження гемотоксичності проб питної води за допомогою даного тесту наведені у таблиці 1.

Таблиця 1. Залежність показника екстинції суміші від часу гемолізу для проб питної води на різних етапах водопіготовки

Час, хв	Показники екстинції суміші в досліджених пробах води, опт. од.
	контроль	1	2	3	4	5	6	7
0	0,5800*	0,5925*	0,4870***	0,6040	0,5710*	0,6021	0,5250*	0,5530**
0,5	0,5245	0,5123*	0,4415**	0,5445*	0,5390*	0,5572*	0,4805**	0,5345*
1,0	0,4610	0,4452*	0,3960**	0,4755*	0,4840*	0,4785*	0,4375*	0,4975**
1,5	0,4075	0,3872*	0,2955***	0,3865*	0,4055	0,4168*	0,3970*	0,4455*
2,0	0,3630	0,3386*	0,1710***	0,2965**	0,3270*	0,3481*	0,3570*	0,3805*
2,5	0,3230	0,3062*	0,0965***	0,2285**	0,2610*	0,2860**	0,3000*	0,3075*
3,0	0,2890	0,2789	0,0640***	0,1765**	0,2105*	0,2294**	0,2614*	0,2560*
3,5	0,2600	0,2592		0,1400**	0,1730**	0,1869**	0,2060**	0,2250*
4,0	0,2340	0,2341		0,1070**	0,1435**	0,1487**	0,1595**	0,1950*
4,5	0,2110	0,2109			0,1210**	0,1812*		0,1715*
5,0	0,1920	0,1876			0,1080**			0,1535*
Т501	3,10	2,51*	1,60**	1,90**	2,21**	2,46*	2,85*	2,75*

Примітка. Т₅₀¹ - показник часу 50%-го гемолізу еритроцитів у хвилинах

* р<0,05; ** p<0,01; *** p<0,005 у порівнянні з контролем

Одержані результати свідчать, що первинне хлорування вихідної води (ВВ -проба 1) призводить до утворення гемотоксичних продуктів (з групи хлорорганічних речовин). Найбільша вираженість цього ефекту спостерігалася при використанні дози активного хлору 5 мг/л (проба 2- вихідна вода (ВВ) + 5 мг/л активного хлору), котра майже вдвічі прискорювала гемоліз еритроцитів (Т₅₀ - 1,6 хв; проба 1 - 2,51хв, контроль - 3,1 хв), тоді як доза 10 мг/л активного хлору - проба 3 (Т₅₀ - 1,9 хв) та озонування (проба 4 - ВВ+ 4,25 мг/л озону, Т₅₀ = 2,21 хв; проба 5 - ВВ+6 мг/л озону, Т₅₀ = 2,46 хв) були менш токсичними. Проби після технічного ланцюга: 6 - ВВ після озонування, коагуляції, відстоювання, фільтрації та хлорування та 7 - ВВ після хлорування, коагуляції, відстоювання, фільтрації та вторинного хлорування, практично не відрізнялися від контролю.

Таким чином використання активного хлору для знезаражування питної води у літній час різко підвищувало її гемотоксичність (Т₅₀ скорочувався майже вдвічі), що, очевидно, пов'язано з утворенням більшої кількості хлорорганічних речовин. Підвищення гемотоксичності води під впливом було менш вираженим (Т₅₀ скорочувався у 1,4- 1,2 рази). В кінці технічного ланцюга водопідготовки показники гемотоксичності питної води суттєво не відрізнялися від контрольних.

Отримані нами дані узгоджуються з результатами досліджень лабораторії Київводоканалу вмісту органічних сполук у воді, згідно з якими після хлорування у дозі 5 мг/л різко підвищувався вміст карбонових кислот (С14, С18), 2,4,6-трихлорфенолу, хлороформу, бромдихлорметану, дибромхлорметану, трихлоретену, дихлор- і трихлороцтових кислот, а після застосування активного хлору у дозі 10 мг/л - зменшувався вміст карбонових кислот (С12, С14, С16, С18) та дибромхлорметану.

Таким чином можна зробити висновок про можливість застосування методу визначення кислотної резистентності еритроцитів для експрес-оцінки гемотоксичності проб питної води невідомого складу, зокрема, в умовах гігієнічної оцінки застосування нових засобів водоочищення.

Результати аналізу гемолітичної активності проб аерозольної частини атмосферного повітря 6-ти міст України наведено на рисунку 2.

Як видно з рисунка 2, концентрати проб повітря міст Маріуполя, Донецька та Сєвєродонецька прискорювали процес гемолізу: показник часу 50°/о-го гемолізу (Т₅₀) для проби повітря міста Маріуполь становив 1,96 хв (р<0,001), для проби Донецька -2,11 хв (р<0,001), для Сєвєродонецька - 2,32 хв (р<0,001) при 2,76 хв контролі. Гемолітична активність проб повітря міст Рівне та Суми була нижчою, ніж у попередніх містах, проте вищою ніж у контролі (2,43 хв (р<0,05) і 2,56 хв (р<0,05).

Проба повітря міста Севастополя за гемолітичною активністю статистично не відрізнялась від контролю (Т₅₀ - 2,65 хв (р<0,05)).

За даними Державного комітету України з гідрометеорології (1992) рівень забруднення повітря міст Донецька, Маріуполя та Сєверодонецька був вищий за середній, а Донецьк та Маріуполь були віднесені до ряду міст з найбільшим рівнем забруднення повітря міст Суми, Рівне та Севастополь був нижчим за середній, що співпадає з результатами наших досліджень.

Порівняльний аналіз дозволяє зробити висновок про наявність якісного зв'язку між гемотоксичністю проб атмосферного повітря та вмістом у ньому ряду токсичних речовин (за даними Укргідромету), які мають виражену гемолітичну активність згідно з результатами наших досліджень, а також вказує на можливість використання методу визначення кислотної резистентності еритроцитів для експрес-тестування гемотоксичності проб атмосферного повітря невідомого складу.

Використання тесту Еймса для оцінки мутагенної активності хімічних факторів водного та повітряного середовища

Була проведена серія експериментів по визначенню мутагенної активності як індивідуальних хімічних речовин, так і вищевказаних проб води і повітря.

Серед досліджених речовин мутагенну активність мали формальдегід, нітрат свинцю, дихлоретан, БК та ацетат свинцю. Мутагенні властивості бутанолу-1, ОК та селеніту натрію встановлено не було.

Спостерігалася чітка відповідність між дослідженнями гемотоксичності та мутагенності проб питної води та атмосферного повітря. Наприклад, максимальна мутагенна активність була зареєстрована для проби води, хлорованої у дозі 5 мг/л (для дослідження за допомогою тест-штаму ТА98 при метаболічній активації (МС+) показник К (співвідношення Хо /Хк досліду до контролю) складав 11,5, без метаболічної активації (МС-) К - 11,0; при використанні тест-штаму ТА100 при МС+ К складав 7,2, при МС- К дорівнював 0,3). Мутагенна активність проб озонованої води також була значно нижчою, ніж хлорованої (для тест-штаму ТА98 при МС+ показник К складав 2,2, при МС- - 5,0; для тест-штаму ТА100 при МС+ показник К дорівнював 3,0, при МС- він складав 4,0).

Для проб аерозольної частини повітря міст України, як і у попередньому випадку, спостерігалася одночасна присутність гемотоксичної та мутагенної активності.

Найбільш високі показники мутагенності у переважній більшості дослідів були зафіксовані у повітрі міста Маріуполь. Показник К для цього міста був максимальним як при МС+ штамів ТА 98 (29,0) та ТА 100 (7,3), так і при МС- для тест-штамів (ТА 98 - 20,5; ТА 100 - 7,5).

Щодо Донецька, то показники мутагенної активності були дещо нижчими за аналогічні показники Маріуполя: показник К для штаму ТА 98 при МС+ складав 19,5, при МС- - 15,6, для штаму ТА 100-8,2 та 6,2, відповідно.

Повітря міста Сєверодонецьк мало середню мутагенну активність: показники мутагенності були нижчі ніж у Донецьку та Маріуполі, але вищі, ніж у Рівному та Сумах. Рівні мутагенної активності проб атмосферного повітря міст Суми та Рівне були приблизно однаковими. Мутагенність повітря цих міст була слабкою.

Мінімальними були показники мутагенності проб повітря міста Севастополь: для тест-штаму Salmonella typhimurium ТА 98 при МС+ показник К складав 4,7; при МС- - 3,4, для тест-штаму ТА 100 при МС+ показник К складав 1,6; при МС- - 1,5.

Використання методики розрахунку параметрів гемотоксичності для гігієнічної оцінки хімічних речовин-забруднювачів води та повітря

Одержані нами результати дозволили провести аналіз гемотоксичності та мутагенності вивчених сполук, виявити мінімальні гемолітичні концентрації хімічних речовин (МГК) (при яких значення функції буде дорівнювати контрольному із врахуванням довірчого інтервалу) за допомогою методики розрахунку параметрів гемотоксичності.

Для розрахунку параметрів гемотоксичності хімічних речовин ми використовували математичний опис залежностей "концентрація (х) - час (1) - ефект (у)". Залежність від часу (1) оцінювалася за допомогою інтегральних показників (А,В,С), котрі і були значеннями ефекту (у) при розрахунку МГК. Хоча за даною методикою математично були перевірені всі 19 речовин, однак визначення МГК може бути визнане адекватним лише для речовин, які мали гемолітичний ефект.

Таким чином, встановлені МГК можуть бути використані як додаткові характеристики для хімічних речовин, котрі мають гемолітичні властивості. При використанні методики розрахунку параметрів гемотоксичності можливим є визначення МГК будь-якої речовини-гемолітика.

ВИСНОВКИ

1. Випробувані у роботі методи визначення кислотної резистентності еритроцитів та вмісту окси-, дезокси- та метгемоглобіну дозволяють дати порівняльну експрес-оцінку гемотоксичності індивідуальних хімічних речовин-забруднювачів і проб водного та повітряного середовища невідомого складу.

2. Були розраховані інтегральні показники гемолізу та виявлена математична залежність їх від концентрації. Встановлено існування трьох типів залежності резистентності еритроцитів від концентрації хімічної речовини (позитивного, негативного та нейтрального), котрі зв'язані з різними механізмами дії. При позитивному типі реагування (бензальдегід, монохлороцтова та оцтова кислоти, фенол, формальдегід, фурфурол) домінує процес безпосереднього руйнування еритроцитарної мембрани з подальшим виходом вмісту клітини назовні. При негативному типі (ацетат свинцю, бензол, бутанол-1, гідрохінон, дихлоретан, нітрат свинцю, селеніт натрію, тетрахлористий вуглець, хлорид стронцію) гемоліз клітин відсутній та, можливо, має місце процес ущільнення мембран еритроцитів. При нейтральному (біхромат калію, нітрат церію, хлоралгідрат, хлорид лантану) спостерігається відсутність явних ознак впливу на гемоліз еритроцитів у порівнянні з контролем. Визначення вмісту лігандних форм гемоглобіну доповнює визначення кислотної резистентності еритроцитів при вивченні гемотоксичності хімічних забруднювачів. Особливо це має значення для солей важких металів, котрі, за даними нашого дослідження, здатні гальмували процес гемолізу еритроцитів.

3. Доведені зміни гемотоксичності та потенційної мутагенності води в залежності від стадії водопідготовки (на прикладі питної води, що отримана із Київського водопроводу у літній період 1996 року). При хлоруванні питної води у дозі 5 мг/л активного хлору показники гемотоксичності були максимальними (вірогідне перевищення контролю майже вдвічі), рівень мутагенності за тестом Еймса у 11,5 разів перевищував контроль.

4. Озонування питної води (яка була отримана із Київського водопроводу у літній період 1996 року) поліпшувало показники гемотоксичності та потенційної мутагенності у порівнянні із хлоруванням. Використання озону для знезаражування зменшувало рівень гемотоксичності води у 1,5 рази та її потенційну мутагенність у 3,8 рази у порівнянні із хлоруванням.

5. За результатами досліджень гемотоксичності проб атмосферного повітря 6 міст України (Донецьк, Сєверодонецьк, Рівне, Маріуполь, Суми, Севастополь) найбільш несприятливим виявилось повітря міст Маріуполя (показники гемолізу у 1,4 рази перевищували контроль). Донецька ( у 1,3 рази), Сєвєродонецька (у 1,2 рази). Показники гемолізу проби аерозольної частини повітря міста Севастополь відповідали контрольним.

6. За допомогою розробленої нами методики розрахунку параметрів гемотоксичності речовин-забруднювачів води та повітря були встановлені їх мінімальні гемолітичні концентрації, які можуть бути використані як допоміжні характеристики при гігієнічній оцінці речовин з явним гемолізуючим ефектом.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ОСНОВНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Слюсаренко А.В., Дуган А.М. Корреляция между общей токсичностью и потенциальной мутагенностью на примере исследования проб воды из Днепровского водопровода // Доклады академии наук. - 1998. - № 11. - С. 187 - 191.

2. Слюсаренко А.В. Исследование закономерностей изолированного действия приоритетных водных и воздушных загрязнителей на моделях системы крови // Проблеми екологічної медичної генетики і клінічної імунології. Збірник наукових праць. Вип. 3. - Луганск, 1997. - С. 151-155.

3. Слюсаренко А.В., Дуган А.М. Оценка общей токсичности и потенциальной мутагенности на примере исследований проб воды из Днепровского водопровода // Вісник проблем біології і медицини. - 1998. - Вип. 19. - С. 100 - 105.

4. Слюсаренко А.В. Использование эритроцитарной модели для гигиенической характеристики приоритетных веществ-загрязнителей воды и воздуха // Гигиена населенных мест. Сборник научных трудов Научно-исследовательского института общей и коммунальной гигиены им. А.Н.Марзеева и Центра медицинской генетики. - Киев. - 1998. - С.362 - 366.

5. Слюсаренко А.В., Елизаров В.А. Прогнозирование токсикологических параметров веществ на основе метода определения скорости гемолиза эритроцитов и математического моделирования // Вісник проблем біології і медицини. - 1998. -Вип. 19. - С. 105 - 108.

6. Слюсаренко А.В. К вопросу о закономерностях изолированного действия приоритетных загрязнителей водной и воздушной среды на моделях системы крови // Галицький лікарський вісник. - 1998. - №1, Т. 5.- С. 72 - 75.

7. Слюсаренко А.В. Оценка общетоксического действия водных загрязнителей на моделях системы крови //Актуальные вопросы гигиены окружающей среды. Сборник научных трудов Научно-исследовательского института общей и коммунальной гигиены им. А.Н.Марзеева. - Киев. - 1995. - С. 150-153.

8. Слюсаренко Г. В. Біотестування загальнотоксичної безпеки на моделях крові // Тези доповідей XIII з'їзду гігієністів України "Пріоритетні проблеми гігієнічної науки, медичної екології, санітарної практики та охорони здоров'я". - Київ: Академія медичних наук України, Наукове товариство гігієністів України. - 1995. -С. 190

АНОТАЦIЯ

Слюсаренко Г. В. Експрес-оцінка хімічних факторів водного та повітряного середовища на підставі еритроцитарної моделі. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.02.01 - гігієна. - Український науковий гігієнічний центр МОЗ України, Київ, 1999.

Дисертацію присвячено розробці методичних підходів до використання еритроцитарної моделі для гігієнічного оцінки гемотоксичної дії хімічних факторів водного та повітряного середовища. У роботі було використано такі методи: визначення кислотної резистентності еритроцитів, визначення складу окси-, дезокси- та метгемоглобіну, а також експрес-метод Еймса. Розроблено підходи до вживання еритроцитарної моделі для гігієнічного оцінювання факторів оточуючого середовища (на прикладі 19 хімічних речовин - водних та повітряних забруднювачів, а також проб води р. Дніпро на різних етапах водопідготовки та проб аерозольної частини атмосферного повітря деяких міст України). Запропоновано методику розрахунку параметрів гемотоксичності, яка дозволяє визначити мінімальні гемолітичні концентрації, які можуть бути використані як допоміжні характеристики при гігієнічній оцінці речовин з явним гемолізуючим ефектом.

Висловлюємо подяку старшому науковому співробітнику, завідувачу лабораторії біоіндикації мутагенів Українського наукового центру медичної генетики МОЗ і НАН України, кандидату біологічних наук ДУГАНУ Олексію Мартем'яновичу за консультативну та організаційну допомогу при виконанні даного дослідження.

Ключові слова: гемотоксичність, гемоліз еритроцитів, хімічні фактори середовища, мінімальні гемолітичні концентрації.

АННОТАЦИЯ

Слюсаренко А.В. Экспресс - оценка химических факторов водной и воздушной среды на основе эритроцитарной модели. - Рукопись.

Диссертация на соискание степени кандидата биологических наук по специальности 14.02.01 - гигиена. - Украинский научный гигиенический центр МЗ Украины, Киев, 1999.

Диссертация посвящена разработке методических подходов к использованию эритроцитарной модели для гигиенической оценки токсического действия химических факторов водной и воздушной среды.

В задачи исследования входило:

1. Выявить закономерности изолированного действия (зависимости "время -эффект", "концентрация - эффект") некоторых химических факторов окружающей среды (продуктов хлорирования и озонирования воды, органических растворителей и солей тяжелых металлов) на гемотоксичность с использованием эритроцитарной модели іп vitro.

2. Исследовать гемотоксичность проб водной и воздушной среды на основе эритроцитарной модели іn vitro.

3. Сопоставить результаты собственных исследований по гемотоксичности и мутагенности химических факторов водной и воздушной среды с данными по общей токсичности этих факторов.

4. Разработать методику расчета параметров гемотоксичности в качестве вспомогательных характеристик при гигиенической оценке химических факторов окружающей среды.

В работе были использованы следующие методы: определения кислотной резистентности эритроцитов, определения содержания окси-, дезокси- и метгемоглобина, а также экспресс-метод Эймса. В тесте Эймса было использовано два тест-штамма Salmonella typhymurium ТА 98 (выявляет мутагены, индуцирующие мутации по типу сдвига рамки считывания генетического кода) и ТА 100 (выявляет мутагены, индуцирующие мутации по типу замены пар оснований ДНК).

Было проведено 58 серий экспериментов, из них 47 посвящено изучению гемотоксичности и 11- мутагенности. Исследовано 19 химических веществ: ацетат свинца, бензальдегид, бензол, бихромат калия, бутанол-1, гидрохинон, дихлорэтан, монохлоруксусная кислота, нитрат свинца, нитрат церия, селенит натрия, уксусная кислота, четыреххлористый углерод, фенол, формальдегид, фурфурол, хлоралгидрат, хлорид лантана, хлорид стронция.

Разработаны подходы по применению эритроцитарной модели для гигиенической оценки химических факторов окружающей среды (на примере 19 химических веществ - водных и воздушных загрязнителей, а также проб питьевой воды из Днепровского водопровода на различных стадиях водоподготовки в июне 1996 года (исходная вода; хлорирование в дозах 5 мг/л и 10 мг/л активного хлора; озонирование в дозах 4,25 мг/л и 6 мг/л; коагуляция; отстаивание; фильтрация; вторичное хлорирование) и проб аэрозольной части атмосферного воздуха некоторых городов Украины: Донецк, Мариуполь, Ровно, Севастополь, Северодонецк, Сумы, отобранных в период 1992 года).

С использованием теста Эймса проведен анализ мутагенности вышеуказанных проб водной и воздушной среды. Отмечена взаимосвязь результатов по изучению гемотоксичности и мутагенности.

Проведен сравнительный качественный анализ полученных результатов изучения проб питьевой воды и атмосферного воздуха с данными Киевводоканала по содержанию органических соединений в исходной воде реки Днепр за 1996 год и данных Укргидромета 1992-1996 годов по качественному и количественному уровню загрязненности исследованных городов.

При исследовании изменения резистентности эритроцитов от различных концентраций 19 веществ было установлено три разных типа зависимостей - позитивный, негативный и нейтральный, связанные, видимо, с различными механизмами действия.

Также доказано, что при хлорировании питьевой воды (взятой из Киевского водопровода в летний период 1996 года) в дозе 5 мг/л активного хлора показатели ее гемотоксичности были максимальными (достоверное превышение контроля в 2 раза). Уровень мутагенности, по показателям теста Эймса, в 11,5 раз превышал контроль. Применение озона в качестве дезинфектанта улучшало показатели гемотоксичности и потенциальной мутагенности воды. Уровень гемотоксичности воды сокращался в 1,5 раза и ее мутагенность - 3,8 раза по сравнению с хлорированием.

При исследовании проб атмосферного воздуха 6 городов Украины (Донецк, Северодонецк, Ровно, Мариуполь, Сумы, Севастополь) с использованием метода определения кислотной резистентности эритроцитов выявлено, что наиболее неблагоприятным является атмосферный воздух городов Мариуполь (показатели гемолиза в 1,4 раза превышали контроль). Донецк (в 1,3 раза). Северодонецк (в 1,2 раза). Показатели гемолиза пробы аэрозольной части воздуха города Севастополь практически совпадали с контрольными.

Разработана модель динамики гемолиза эритроцитов. Предложена методика расчета параметров гемотоксичности, которая позволяет определить минимальные гемолитические концентрации веществ-гемолитиков. Эти концентрации в перспективе могут быть использованными как вспомогательные характеристики при гигиенической оценке этих веществ.

Научная новизна работы заключается в установлении зависимости «доза-эффект» для гемотоксического действия химических веществ на эритроцитарной модели in vitro. Впервые установлены закономерности влияния таких веществ как фенол, ацетат свинца и хлоралгидрат на процесс метгемоглобинобразования.

На основе проведенных исследований и математического моделирования впервые разработана методика расчета параметров гемотоксичности веществ, обладающих гемолитическими свойствами.

По материалам работы опубликовано 7 статей, 1 тезисы и 1 информационное письмо.

Ключевые слова: гемотоксичность, гемолиз эритроцитов, химические факторы среды, минимальные гемолитические концентрации.

ANNOTATION

Slyusarenko А. V. Express-assessment for chemical factors of water and air environment using erythrocital model. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree in biological sciences by speciality 14.02.01 -hygiene. - Ukrainian Scientific Centre of Hygiene of the Ministry of Health of Ukraine, Kyiv, 1999.

The dissertation is devoted to the development of methodological approaches to using model erythrocyte for hygienic determination of toxicological action of water and air chemical factors. The follows methods were used: method of determination of acid resistance of erythrocytes, method of contents determination for oxy-, desoxy- and inethemoglobulin and Ames express-method. The approaches are elaborated for model erythrocyte as additional ways for hygienic assessment of surrounding factors (for example 19 chemical substances - water and air contaminators, Dnipro water samples during different stages of water preparation and aerosol part of atmospheric air samples from some Ukrainian sites). Calculated method of hemotoxic parameters has been proposed. This method allows to determine minimal hemolytic concentrations. These parameters would be used as additional characteristics for hygienic assessment of hemolitical substances .

Key words: hemotoxicity, erythrocyte hemolysis, chemical environmental factors, minimal hemolytic concentrations.

Размещено на Allbest.ru

...