Розробка апіанатоксину для профілактики та терапії інтоксикацій бджолиною отрутою

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Академія медичних наук України

Інститут фармакології та токсикології

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

«Розробка апіанатоксину для профілактики та терапії інтоксикацій бджолиною отрутою»

Сопіна Ірина Леонідівна

Київ - 1999

Вступ

Актуальність проблеми. Отрути тваринного походження - унікальні за своєю хімічною будовою та біологічною дією групи речовин, до яких відносяться отрути комах, павукоподібних, земноводних, плазунів.

Найбільш практичне значення в умовах України мають отрути бджіл, ос, джмелів, шершнів, змій (В.С. Даниленко, Ю.М. Максимов, І.Л. Сопіна, 1995; В.С. Даниленко., Л.А. Могирьова, Б.М. Бондаренко., 1997; Н.Н. Асафова, 1987).

Якщо по відношенню до отруєнь деякими зміїними отрутами існують надійні засоби специфічної терапії, стосовно інших отрут ефективні препарати практично відсутні. До категорії останніх відноситься і отрута бджоли (В.Н. Крылов, 1994).

При інтоксикації бджолиною отрутою відбувається розвиток гострих патологічних процесів, які можуть мати як місцевий (біль, гіперемія, свербіж, печіння і набряк в місці ужалення), так і системний характер внаслідок надходження отрути в кров (лихоманка, нудота, блювання, головний біль тощо).

Поодинокі ужалення можуть викликати алергічні реакції, особливо при гіперчутливості до отрути бджоли, що може призвести до загибелі людини.

Слід наголосити, що алергія до отрут перетинчастокрилих комах (бджоли, оси, джмелі, шершні) достатньо поширене явище (В.И. Пыцкий, Н.В. Адрианова, 1991; S.E. Barr, 1970). Так, 0,5%-2% населення Землі страждає підвищеною чутливістю до ужалень названими комахами (Б.Н. Орлов, 1980). Дані статистики свідчать про те, що укуси бджіл викликають більше смертельних наслідків, ніж укуси павуків та змій

(S.E. Barr, 1971; 1974). Зокрема, в США кожного року реєструється 80-100 смертей внаслідок ужалення комахами, в Англії - 4-5, в Німеччині - 40, в Японії - до 800 (D.Charpin,1995). В Україні, на жаль, таких статистичних даних в доступній нам літературі знайти не вдалось.

В наш час описані випадки інтоксикацій отрутою “бджоли-вбивці” (Apis mellifera scutellata) - виду бджіл, які виникли внаслідок схрещування африканської і европейської бджіл (D.B. Ferreira, 1994; F.O. Franca, 1994). Не виключена можливість міграції “бджоли-вбивці” з американського континенту і південно-західної Азії в Європу . Слід зазначити, що отрута цієї особини у декілька разів токсичніша, ніж сірої медоносної бджоли.

Наведені факти свідчать про широту розповсюдження алергічних реакцій до укусів перетинчастокрилих комах і про необхідність розробки ефективних засобів їх профілактики і лікування.

Виходячи з того, що алергія до отрути бджоли сама по собі, як правило, не зникає, і у 68% людей, ужалених цими комахами, реакції на повторні ужалення протікають важче (В.И. Пыцкий, Н.В. Адрианова, 1991), гіперчутливість до отрути є показанням до проведення десенсибілізуючого лікування. Зараз найбільш ефективним засобом лікування є імунотерапія специфічним алергеном.

В останні роки розробляються якісно нові лікувальні препарати (мікст-форми, модифіковані та депоновані форми) для специфічної імунотерапії хворих на різні види алергій. Проте лікування людей, гіперчутливих до ужалень бджолами, проводиться на сьогоднішній день нативною бджолиною отрутою (єдиний затверджений Міністерством охорони здоров'я України метод). Цей метод потребує значної кількості ін'єкцій на протязі тривалого часу, що часто призводить до виникнення місцевих та системних реакцій організму.

За кордоном застосовують модифіковані форми бджолиної отрути, лікування якими здійснюють більшими дозами у значно коротший термін (G. Kanny, 1993; F. Rance, 1994). Найбільш перспективним вважається розробка гіпосенсибілізуючого препарату типу анатоксину, який створюється на основі хімічної модифікації нативної бджолиної отрути, внаслідок чого значно зменшується токсичність та алергенність отрути при збереженні її специфічної активності (П. Павель, Л.И. Краснопришина, 1988; Л.А. Могирьова, 1997).

Слід зауважити, що сорбовані форми анатоксинів, які отримують сорбцією анатоксинів на різних сорбентах - гідроксид алюмінію, алганат натрію, фосфат алюмінію, алюмокалієвий галун, тощо (Li Yung-Long, 1990), мають значно вищу антигенність та імуногенність, а сорбенти виконують роль ад'юванту.

Однак, до теперішнього часу в Україні відсутній препарат такого типу дії, за допомогою якого можна проводити швидке та ефективне лікування людей, ужалених бджолою.

Мета і задачі роботи. Метою роботи було розробити апіанатоксин для профілактики та терапії інтоксикацій бджолиною отрутою, дослідити його біологічні властивості, лікувальний ефект та профілактичну дію в порівнянні з нативною бджолиною отрутою.

Для досягнення цієї мети були поставлені такі задачі:

1) розробити оптимальні умови одержання нативного апіанатоксину;

дослідити біологічну активність нативного апіанатоксину в дослідах in vivo та in vitro;

розробити раціональну схему застосування нативного апіанатоксину на експериментальних моделях;

створити сорбовану форму апіанатоксину;

провести експериментальну оцінку лікувальної та профілактичної дії нативного апіанатоксину та його сорбованої форми;

дослідити нешкідливість нативного апіанатоксину та його сорбованої форми на морських свинках.

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблені оптимальні умови знешкодження бджолиної отрути під впливом формальдегіду і певного температурного режиму.

Вперше досліджені фармако-токсикологічні параметри та специфічна активність апіанатоксину для профілактики та терапії алергічних ускладнень при ужаленні бджолами.

Встановлено, що апіанатоксин та його сорбована форма проявляють профілактичні та лікувальні гіпосенсибілізуючі властивості при інтоксикаціях бджолиною отрутою.

Вперше експериментально доведено, що при введенні свідомо збільшених доз (20 лікувальних) апіанатоксин та його сорбована форма не мають загально-токсичної та місцево-подразнюючої дій, не впливають на показники периферійної крові та стан серцево-судинної системи, а також не викликають морфологічних змін внутрішніх органів, що свідчить про їх нешкідливість.

Науково-практичне значення одержаних результатів. Отриманий нативний апіанатоксин та його сорбована форма дають змогу вирішити проблему лікування алергічних ускладнень при інтоксикаціях бджолиною отрутою.

Результати експериментальних досліджень свідчать про перевагу застосування апіанатоксину перед існуючим методом з використанням нативної бджолиної отрути.

Лікування сенсибілізованих бджолиною отрутою щурів за розробленою нами раціональною схемою застосування апіанатоксину зменшує інтенсивність розвитку реакції гіперчутливості сповільненого типу на 67,2%, в той час як лікування нативною бджолиною отрутою - на 5%.

Нативний і сорбований апіанатоксини проявляють профілактичну активність при застосуванні за 7, 14 і за 30 діб до початку сенсибілізації щурів бджолиною отрутою, зменшуючи інтенсивність реакції гіперчутливості сповільненого типу на 50-60%.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом особисто проведений патентно-інформаційний пошук, визначені мета та завдання експериментального дослідження, розроблені методичні підходи, опрацьовані моделі, згідно з якими особисто виконані всі токсикологічні, фармакологічні, імунологічні та біохімічні дослідження, здійснена статистична обробка та аналіз одержаних результатів, оформлення їх у вигляді графіків і таблиць. Патоморфологічні дослідження виконані сумісно з к. м. н. Писарєвим О.А. Виконані аналіз та систематизація експериментальних матеріалів досліджень. Розроблені основні положення та висновки дисертації.

Результати дослідження викладені дисертантом у статтях, матеріалах конференцій та доповідях і є її здобутком. В опублікованих роботах у співавторстві більше 90% розробок та матеріалу належить здобувачеві.

1. Матеріали та методи досліджень

Досліди проведені на 150 статевозрілих нелінійних білих щурах обох статей розведення Інституту фармакології та токсикології АМН України, 173 морських свинках, 730 мишах та 8 кролях. Тварин утримували на стандартному водно-харчовому раціоні при вільному доступі до води та їжі. Морфологічні дослідження тварин проводили після декапітації, тварин після інших досліджень виводили з досліду шляхом поміщення їх в камеру з атмосферою, насиченою парами етилового ефіру.

В роботі була використана отрута медоносної бджоли, зразок якої був сертифікований за ГОСТом 30.426-97, розробленим Центром досліджень продуктів бджільництва ім. П.І. Прокоповича.

Апіанатоксин для активної профілактики отруєнь бджолиною отрутою виготовляли методом формольного анатоксин утворення, який засновано на модифікації молекули токсину формальдегідом при певній температурі інкубації. При цьому утворюється формолпохідна отрути, яка біологічно повністю нешкідлива, але є повноцінним антигеном.

Ефективність знезараження бджолиної отрути формальдегідом при +370С контролювали за показниками ЛД50 на протязі 2 місяців (В.Б. Прозоровский, 1978).

Гостру токсичність апіанатоксину вивчали за показниками ЛД50 на білих мишах та щурах при внутрішньо очеревинному та підшкірному введенні за методом Літчфілда та Уілкоксона.

Антигенні властивості вивчали в реакції подвійної імунодифузії в агаровому гелі по Оухтерлоні, використовуючи агар “Діфко” (США), контролюючи наявність антитіл, комплементарних до бджолиної отрути.

Імуногенні властивості апіанатоксину досліджували в реакції загальної анафілаксії та активної шкірної анафілаксії на морських свинках згідно з “Методичними рекомендаціями по оцінці алергенних властивостей фармакологічних речовин”, Москва,1988.

Алергічні реакції з апіанатоксином вивчали в реакції гіперчутливості сповільненого типу (ГСТ). Величину ГСТ оцінювали за різницею в товщині задніх лапок тварин, вимірюючи мікрометром МК-025 інтенсивність набряку лапи після введення завершальної ін'єкції бджолиної отрути. Результати досліджень виражали в умовних одиницях (у. о.), де 1 у. о. = 0,01 мм товщини набряку.

Сорбовану форму апіанатоксину одержували сорбцією нативного апіанатоксину на 0,3% гелі гідроксиду алюмінію Харківського заводу бакпрепаратів (Серія 41 б 2) до кінцевої концентрації сорбенту 0,025 % (А.А. Воробьев, Н.Н. Васильев, 1965).

Імунний стан організму під впливом апіанатоксину та його сорбованої форми характеризували, оцінюючи враженість гуморальної імунної відповіді у щурів за титрами циркулюючих в крові антитіл (Медодические рекомендации по экспериментальному (фармакологическому) и клиническому испытанию иммуномодулирующего действия фармакологических средств, Москва, 1984).

Морфологічні дослідження внутрішніх органів морських свинок здійснювали після ефтаназії тварин, фіксація - в 10% розчині формаліну з наступним фарбуванням зразків гематоксиліном та еозином.

Лікувальний ефект анатоксину та його сорбованої форми вивчали на сенсибілізованих бджолиною отрутою мишах та щурах обох статей в реакції гіперчутливості сповільненого типу.

Профілактичну дію апіанатоксину та його сорбованої форми досліджували при введенні апіанатоксину та його сорбованої форми за 7, 14 і 30 діб до сенсибілізації тварин.

Стан показників периферійної крові всіх груп тварин реєстрували до сенсибілізації (інтактні тварини), перед введенням завершальної дози бджолиної отрути і через 1,5 год. після її введення.

Стан серцево-судинної системи (під легким наркозом етаміналу натрію, 20 мг/кг, внутрішньоочеревинно) контролювали за показниками електрокардіограми в II стандартному відведенні, які реєстрували на комп'ютерному електрокардіографі DEGO Cardio Med 12 (Німеччина).

Нешкідливість апіанатоксину та його сорбованої форми вивчали на морських свинках при введенні підшкірно в різні боки по 1 мл, тобто в дозі, яка перевищує в 20 разів початкову лікувальну дозу, оцінюючи їх вплив на загальну температуру тіла тварин, температуру шкіри в місці введення, товщину шкірної складки, опір шкіри електричному струму, масу тіла, показники периферійної крові та ЕКГ, які є критеріями загально-токсичної та місцево-подразнюючої дії. Досліди проводили на 1, 7, 14, 30 добу після введення апіанатоксинів.

Отримані результати обробляли за методом варіаційної статистики з визначенням t-критерія Стьюдента (Ю.И. Иванов, 1990).

2. Результати досліджень та їх обговорення

Результати дослідження токсичних властивостей апіанатоксину, створеного на основі бджолиної отрути з використанням методу формольного анатоксиноутворення (рис.1), показали, що поетапне застосування формаліну 0,2%; 0,3%; 0,5%; рН 7,2, інкубація при температурі 370С на протязі 60 діб зменшує токсичність бджолиної отрути на 94% для білих мишей та на 95,2% для щурів при внутрішньо-очеревинному введенні обом видам тварин.

Рис. 1. Зміни токсичності (ЛД50, мг/кг) бджолиної отрути в процесі анатоксиноутворення

Таблиця 1 - Показники гострої токсичності апіанатоксину при різних шляхах введення білим мишам та щурам (п=30)

Оскільки алергія на ужалення комахами відноситься переважно до реакцій гіперчутливості сповільненого типу (ГСТ), ми використовували модель цієї реакції для виявлення алергічних властивостей отриманого апіанатоксину. Дослідження показали, що здатність апіанатоксину індукувати розвиток реакції ГСТ зменшилась на 98% порівняно з бджолиною отрутою.

Специфічні властивості апіанатоксину (антигенність та імуногенність) біли досліджені в реакціях in vitro та in vivo на 4-х видах тварин (білі миші, щурі, морські свинки та кролі).

В реакції подвійної імунодифузії в агаровому гелі апіанатоксин проявляв антигенні властивості, спричиняючи утворення антитіл, комплементарних до отрути бджоли.

В реакції загальної анафілаксії на морських свинках показано, що апіанатоксин зберігав початкові, характерні для бджолиної отрути сенсибілізуючі та анафілактогенні властивості, тобто він є повноцінним імуногеном.

Відомо, що в механізмі дії бджолиної отрути головними є алергійні та токсичні реакції (В.С. Даниленко, 1995; Б.Н. Орлов, 1978).

Виходячи з цього, для виявлення гіпосенсибілізуючих властивостей та розробки раціональної схеми нами були використані відповідні моделі: а) реакція гіперчутливості сповільненого типу (ГСТ); б) визначення “захисного” ефекту при інтоксикації бджолиною отрутою в дозі ЛД50 (табл. 2). Вивчали ефективність апіанатоксину при різних схемах його введення сенсибілізованим бджолиною отрутою білим мишам. В результаті проведених досліджень встановлено, що найбільш ефективною була схема №4, яка включала 4 щоденних підшкірних ін'єкції апіанатоксину в дозах 0,01; 0,02; 0,1 та 1,0 мг/кг. Застосування цієї схеми спричиняло зменшення інтенсивності реакції гіперчутливості сповільненого типу на 98% та сприяло виживанню 86,6% мишей, при інтоксикації ЛД50 бджолиної отрути.

Подальші експерименти проводили з урахуванням даної схеми десенсибілізуючої терапії.

Таблиця 2 - Вплив апіанатоксину при різних схемах його введення на інтенсивність гіперчутливості сповільненого типу (М m; п=10) у мишей.

Лікувальний ефект апіанатоксину та його сорбованої форми досліджували порівняно з лікуванням бджолиною отрутою (зростаючі дози) на сенсибілізованих бджолиною отрутою щурах в реакції ГСТ, контролюючи показники периферичної крові та ЕКГ всіх груп тварин.

Отримані результати порівняльного вивчення апіанатоксину, його сорбованої форми та бджолиної отрути показали, що найбільш ефективним було лікування нативним (4 ін'єкції) та сорбованим (2 ін'єкції) апіанатоксинами (табл. 3). Лікування бджолиною отрутою спричиняло зменшення інтенсивності ГСТ на 5% і підвищувало кількість лейкоцитів в периферичній крові щурів, що свідчило про наявність запального процесу.

Таблиця 3 - Дослідження лікувального ефекту апіанатоксину та його сорбованої форми в реакції гіперчутливості сповільненого типу на щурах (М m; п=10)

Виявлення профілактичних властивостей апіанатоксину та його сорбованої форми досліджували при введенні їх не сенсибілізованим мишам та щурам за 7, 14 та 30 діб до сенсибілізації, використовуючи схему 0,1-0,2-0,3 мл з інтервалом між ін'єкціями 3 доби. Встановлено, що апіанатоксин та його сорбована форма виявляють профілактичну дію, особливо за 14 діб, зменшуючи інтенсивність розвитку реакції гіперчутливості сповільненого типу на 66,2% і на 57,5% відповідно (Рис. 2).

Рис. 2. Профілактична дія апіанатоксину та його сорбованої форми при введенні білим мишам на моделі гіперчутливості сповільненого типу

При вивченні нешкідливості нативного та сорбованого апіанатоксину показано, що вони не мають загально-токсичної ( за показниками маси тіла, ЕКГ, стану периферичної крові) (табл. 4) та місцево-подразнюючої дії (за показниками температури тіла та шкіри в місці введення, товщини шкірної складки, опору шкіри електричному струму). Зміни показників температури тіла та шкіри в місці введення, які спостерігали на 7 добу після введення, характерні для препаратів типу анатоксинів, збільшення ЧСС під впливом апіанатоксинів не виходили за межі фізіологічних норм для морських свинок, морфологічна структура внутрішніх органів не була порушена, що свідчило про нешкідливість апіанатоксину та його сорбованої форми.

Таблиця 4 - Вплив нативного і сорбованого анатоксинів на деякі фізіологічні показники морських свинок в умовах “хронічного” досліду (М m; п=10)

Висновки

Розроблено метод одержання з отрути бджоли нативного апіанатоксину і його сорбованої форми та вивчено їх основні властивості.

Середня летальна доза (ЛД50) апіанатоксину складає 60 мг/кг при внутрішньо-очеревинному введенні та 112 мг/кг при підшкірному введенні білим мишам. Для щурів ці показники складають відповідно 89 мг/кг та 112 мг/кг.

Апіанатоксин зберігає антигенні та імуногенні властивості, специфічні для бджолиної отрути, але в протилежність останній практично не індукує розвиток алергії.

На моделі гіперчутливості сповільненого типу визначено, що оптимальна схема застосування апіанатоксину складає 4 підшкірних щоденних ін'єкції в дозах 0,01; 0,02; 0,1 та 1,0 мг/кг.

При отруєнні мишей бджолиною отрутою (ЛД 50) нативний апіанатоксин при його профілактичному введенні за оптимальною схемою сприяє виживанню 86,6% мишей.

В дослідах на сенсибілізованих бджолиною отрутою щурах встановлено, що нативний апіанатоксин та його сорбована форма проявляють лікувальні властивості: нативний апіанатоксин (4 ін'єкції) зменшує вираженість реакції гіперчутливості сповільненого типу на 67,2%, сорбований (2 ін'єкції) - на 60,3%, в той час як бджолина отрута (4 дози) лише на 5%.

Нативний апіанатоксин та його сорбована форма проявляють профілактичну активність при їх введенні за 7, 14 та 30 діб до сенсибілізації щурів бджолиною отрутою. Інтенсивність реакції гіперчутливості сповільненого типу зменшувалась на 58% та 40% відповідно, при введенні щурам нативного апіанатоксину за 14 та 30 діб.

При одноразовому введенні морським свинкам 20 лікувальних доз апіанатоксину та його сорбованої форми встановлено, що вони не спричиняють токсичного впливу на організм, не змінюють функціонального стану життєво важливих органів та систем, не викликають порушень морфологічної структури внутрішніх органів, не мають місцево подразнюючої дії, що свідчить про їх нешкідливість.

апіанатоксин нативний бджолиний лікувальний

Література

Сопіна І.Л, Могирьова Л.А., Даниленко В.С. Сучасний стан проблеми фармакотерапії отруєнь бджолиною отрутою (Огляд літератури) // Ліки.-1998. - №1, С. 47-59.

Сопіна І.Л. Вивчення нешкідливості нативного і сорбованого апіанатоксинів. // Ліки. - 1998. - №4, С. 79-81

Сопіна І.Л. Експериментальне дослідження специфічних властивостей апіанатоксину. // Ліки. - 1998. - №3. - С. 72-76.

Сопіна І.Л. Оцінка впливу апіанатоксинів на серцево-судинну систему. // Ліки. - 1998. - №5. - С. 98-100.

Писарєв О.А., Сопіна І.Л. Патоморфологічні дослідження впливу апіанатоксину на внутрішні органи // Ліки. - 1998. - №6. - С. 68-73.

Сопина И.Л. О разработке и изучении анатоксина, обладающего гипосенсибилизирующим эффектом при отравлении пчелиным ядом. // Досягнення сучасної фармації -в медичну практику. Матеріали наук.-практ. конф., присвяч. 75-річчю Української фармацевтичної академії. Харків. - 1996, С. 345-346.

Сопіна І.Л., Дмитренко С.О., Барбашева Н.В. Оцінка впливу апіанатоксину на гіперчутливість сповільненого типу у мишей та щурів. // Тез.доп. 2 Міжнародного медичного конгресу студентів і молодих вчених .- Тернопіль, 1998. - С. 85-86.

Сопина И.Л., Даниленко В.С., Могирева Л.А. Разработка анатоксина на основе пчелиного яда // Тез.докл. 5 Российский национальный конгресс “Человек и лекарство”. - Москва, 21-25 апреля 1998 г. - С. 409.

9. Sopina I.L., Danilenko V.S., Mogiriova L.A. Investigation of a hyposensitive bee venom praparation. // Archives of Pharmacology. 125-th Anniversary. - 1998. - V.358. - №1, P. 444.

Размещено на Allbest.ru