Система 2-5 олігоаденілату в пухлинних та вірусінфікованих клітинах при дії інтерферонів та її модуляція ретиноїдами

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького

Міністерство охорони здоров'я України

Український науково-дослідний інститут онкології і радіології

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

14.01.07 - Онкологія

Система 2-5 олігоаденілату в пухлинних та вірусінфікованих клітинах при дії інтерферонів та її модуляція ретиноїдами

Завелевич Михайло Петрович

Київ 1999

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті експериментальної патології,онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Науковий керівник - академік НАН України, доктор медичних наук, професор Бутенко Зоя Андріївна, завідувач відділу механізмів лейкозогенезу Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України,

Офіційні опоненти:

- доктор медичних наук, професор Шляховенко Володимир Олексійович, завідувач відділу ензимотерапії пухлин Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України,

-член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор Дяченко Наталія Сергіївна, завідувач відділу молекулярної біології вірусів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України,

Провідна установа - Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, кафедри онкології і вірусології, м. Київ

Захист відбудеться 1999 р. о годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (252022, Київ-22, вул. Васильківська, 45)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР НАН України

Автореферат розісланий 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої Вченої ради доктор медичних наук І.В. Абраменко

1. Загальна характеристика роботи

інтерферон пухлина імунний вірус

Актуальність теми. Інтерферони (ІФН) посідають одне з перших місць серед цитокінів, які використовуються в сучасній медицині. Наявність протипроліферативних та імуномодуляторних ефектів у ІФН обумовила можливості їх застосування в онкологічній практиці. Клінічні дослідження, проведені з препаратами рекомбінантних ІФН, дозволили накопичити чималий досвід, необхідний для розробки раціональних схем інтерферонотерапії (Ершов 1996; Возианов с соавт. 1998; Talpaz 1995; Kantarjian et al 1996). Застосування ІФН в комплексі з хіміопрепаратами та іншими засобами протипухлинної терапії дозволило досягти значних результатів в лікуванні волосатоклітинного лейкозу (Golomb et al 1996), хронічного мієлолейкозу (Tura 1996) та метастазуючого раку нирки (Возианов с соавт. 1997). Разом з тим, не можна не зазначити, що й до цього часу клінічні схеми використання ІФН лишаються здебільшого емпіричними та неіндивідуалізованими, при цьому існує певний розрив між новітніми даними про молекулярні механізми дії ІФН та існуючими обгрунтуваннями схем їх застосування.

Згідно з сучасними уявленнями численні біологічні ефекти ІФН врешті решт пов'язані з обмеженим колом ефекторних механізмів системи ІФН, які запускаються в результаті взаємодії ІФН з рецепторами на поверхні клітин. Одне з центральних місць серед таких ефекторних ланок посідає система 2_5 олігоаденілату (2_5А), головним компонентом якої є специфічний фермент, 2_5А синтетаза (Kerr and Brown 1978). Саме цьому ферменту останнім часом приділяють значну увагу в спробах знайти загальний знаменник для пояснення різноманітних ефектів ІФН. Виявилось, що система 2_5А пов'язана з диференціюванням клітин, регулюванням їх проліферації та модулюванням ряду біосинтетичних процесів (Player and Torrenece 1998), вона бере участь в підтриманні клітинного гомеостазу та в таких фундаментальних процесах як апоптоз (Castelli et al 1998).

Оскільки дія ІФН на сприйнятливі до них клітини в більшості випадків супроводжується індукцією 2_5А синтетази, визначення активності цього ферменту може бути корисним як для прогнозування ефективності застосування ІФН, так і для моніторингу інтерферонотерапії (Ferbus et al 1990; Moritz et al 1992). Зміни активності 2_5A синтетази можна визначати не лише в клітинах пухлин, а й в ефекторних клітинах імунної системи, що може сприяти розумінню ефектів, які ІФН справляє опосередковано.

В роботах останніх років, присвячених вивченню численних зв'язків між клітинами, які опосередкуються цитокінами та факторами росту, чимала увага приділяється речовинам, які належать до ретиноїдів, посилився інтерес і до їх клінічного застосування в онкологічній практиці (Parkinson 1992; Berg 1997). Особливо цікавими є дані, що свідчать про можливості адитивних та синергічних протипроліферативних ефектів ретиноїдів в поєднанні з ІФН (Giandomenico et al 1998). При цьому, як виявилось останнім часом, ретиноїди можуть впливати безпосередньо на систему 2_5А, чим можуть хоча б частково бути пояснені подібні ефекти взаємодії (Lancillotti et al 1995; Gianni et al 1997; Pelicano et al 1997). Разом з тим в цих питаннях ще існує багато суперечностей і розробка раціональних схем комбінованої терапії з застосуванням ретиноїдів потребує подальших досліджень. Аналіз впливу ретиноїдів на проліферацію клітин та взаємодії ретиноїдів з системою ІФН не може проводитись відокремлено від аналізу впливу ретиноїдів на репродукцію вірусів з врахуванням, зокрема, взаємозалежності між ретровірусами та індукованими і спонтанними пухлинами в експериментальній онкології, а також клінічного значення ретровірусних інфекцій у людини, тим більше, що останнім часом певна увага приділяється можливому використанню ретиноїдів для терапії ВІЛ-асоційованої саркоми Капоші та ВІЛ-асоційованих лімфом (Baily et al 1995). До того ж всі аспекти, пов'язані з взаємодією між ретиноїдами та системою ІФН, важливі і для клінічного застосування ІФН та ретиноїдів в онкології.

За останнє десятиріччя ІФН все ширше застосовуються в комбінованій терапії солідних пухлин різних локалізацій (Воронцова 1996). Чільне місце серед них посідають деякі поширені пухлини органів сечовиведення, зокрема рак нирки та рак сечового міхура (Horoszewicz and Murphy 1989; Torti and Lum 1987). Застосування ІФН альфа у хворих на рак сечового міхура дозволяє запобігати рецидивуванню після хірургічного видалення первинної пухлини. При цьому використовуються переваги від створення локальних підвищених концентрацій ІФН завдяки можливості внутріміхурового введення препарату (Chodak 1989). Однак, нез'ясованим лишається питання, чому в ряді випадків пухлини є більш сприйтятливі до ІФН, а в інших випадках - відносно більш резистентними. Неясно також, яким є співвідношення безпосереднього впливу ІФН на пухлинні клітини та опосередкованої дії ІФН, враховуючи значну роль імунного компоненту, а можливо і порушень в системі ІФН, в патогенезі раку сечового міхура. Наскількі відомо з літератури, дослідження стану системи 2_5А в клітинах раку сечового міхура досі ще не проводились. Відносно маловивченими лишаються і проблеми взаємодії ІФН з ретиноїдами в терапії раку сечового міхура, незважаючи на те, що подібні схеми лікування вже почали випробуватись в клінічній практиці.

ІФН знайшли своє застосування і при лікуванні метастазуючого раку нирки, особливо в поєднанні з цитостатиками та інтерлейкіном-2 (ІЛ-2) (Возианов с соавт. 1997; Belldegrun et al 1996; Atzpodien 1995). Особливо перспективними є підходи з мобілізацією in vitro лімфоцитів, які інфільтрують пухлини (Finke et al 1994). Незважаючи на те, що вже накопичено чимало даних про вплив ІФН та ретиноїдів на деякі з ефекторних клітин імунної системи (Bonavida et al 1993), нез'ясованими лишаються питання щодо стану системи 2_5А як в природних кілерних клітинах, так і в лімфоцитах, які інфільтрують пухлини, особливо в плані спільного застосування ІФН та ІЛ_2.

Актуальність тематики досліджень, таким чином, визначається необхідністю обґрунтування раціональних схем застосування ІФН та ретиноїдів в клінічній практиці та розробки інформативних методів, які могли б свідчити про сприйнятливість до ІФН в поєданні з модифікаторами біологічної відповіді, зважаючи на досить широке клінічне застосування як ІФН, так і комбінованої терапії, яка включає інтерферонотерапію. В теоретичному аспекті особливий інтерес становило питання про роль системи 2_5А як можливої загальної ефекторної ланки, що обумовлює різноманітні ефекти ІФН.

Мета і задачі дослідження. Основна мета - одержання нових даних про функціонування ключового ферменту системи ІФН, 2_5А синтетази, в клітинах перещеплюваних лімфобластоїдних ліній, пухлинних клітинах та ефекторних клітинах імунної системи хворих на рак сечового міхура та рак нирки та аналіз можливості застосування методу тестування активності 2_5А синтетази для визначення сприйнятливості клітин різного генезу до екзогенного ІФН, а також аналіз механізмів модуляції ефектів ІФН під дією ретиноїдів.

Для досягнення цієї мети було поставлено такі завдання:

- проаналізувати противірусні та протипроліферативні ефекти ІФН при інтегративній вірусній інфекції, зокрема в клітинах перещеплюваних культур мишачих лімфом, які продукують ендогенні ретровіруси;

- проаналізувати основні параметри системи 2_5 А в клітинах різного генезу та при різних функціональних станах, зокрема в перещеплюваних лімфобластоїдних лініях людини, в перещеплюваних лініях мишачої лімфоми, в первинних клітинах раку сечового міхура та раку нирки людини, в мононуклеарах периферійної крові здорових донорів та хворих на вірусні інфекції, в природних кілерних клітинах здорових та хворих людей та в лімфоцитах, які інфільтрують пухлини;

- простежити взаємодію ретиноїдів з системою ІФН в перещеплюваних лініях клітин та в клітинах раку сечового міхура, а також проаналізувати можливості модуляції ефектів ІФН ретиноїдами як в пухлинних клітинах, так і при хронічних вірусних інфекціях людини;

-проаналізувати функціонування 2_5А синтетази, на молекулярному рівні, зокрема проаналізувати форми синтезованого продукту та природу активаторів ферменту.

Наукова новизна одержаних результатів. Одержано нові дані щодо стану системи 2_5А в пухлинних клітинах у хворих на рак нирки та рак сечового міхура, а також в мононуклеарах периферійної крові здорових і хворих людей в співставленні з аналогічними даними для перещеплюваних ліній пухлинних клітин. Вперше проаналізовано сприйнятливість клітин раку сечового міхура та раку нирки людини до різних типів рекомбінантних ІФН за визначенням активності індукованої 2_5А синтетази. Результати роботи свідчать про можливості застосування методу визначення 2_5А синтетази для одержання об'єктивних даних щодо сприйнятливості як пухлинних клітин, так і ефекторних клітин імунної системи до дії різних типів ІФН. Проведено порівняльне вивчення рівнів базальної та індукованої активності ферменту в перещеплюваних лініях клітин різного генезу, в первинних клітинах пухлин та в ефекторних клітинах імунної системи здорових людей, хворих на онкоурологічну патологію та хворих на вірусний гепатит; проаналізовані співвідношення між базальною та індукованою активністю 2_5А синтетази в різних системах. Показано, що співвідношення між базальними та індукованими рівнями активності 2_5А синтетази в мононуклеарах периферійної крові та первинних культурах пухлинних клітин принципово відрізняється від такого ж співвідношення в низці перещеплюваних ліній пухлинних клітин різного генезу. Продемонстровано кореляції між фунціональною спроможністю ефекторних клітин імунної системи, зокрема природних кілерів та лімфоцитів, які інфільтрують пухлини, при дії ІФН, та індукцією в цих клітинах 2_5А синтетази. Показано, що спільна дія ретиноїдів та ІФН як в культурах перещеплюваних ліній, так і в первинних культурах раку сечового міхура може призводити до синергічних ефектів щодо зростання рівнів індукованої активності 2_5А синтетази. Встановлено, що ретиноїди можуть за певних умов слугувати за індуктори ІФН людини, а також пригнічувати репродукцію як інтегрованих ендогенних ретровірусів, так і вірусу імунодефіциту людини.

При вивченні молекулярних аспектів функціонування 2_5А синтетази вперше було показано, що препарати тРНК можуть ефективно правити за активатор цього ферменту, що дозволяє передбачити можливості такого функціонування тРНК і в природних умовах. Одержані дані мають важливе значення для розкриття механізмів функціонування 2_5А синтетази в клітинах в нормі та при патологічних станах при відсутності вірусної інфекції.

В процесі виконання роботи вперше було одержано серію перещеплюваних ліній мишачих клітин з трансплантованих лімфом та охарактеризовано ретровіруси, які продукуються цими клітинами.

Практичне значення одержаних результатів. Метод визначення активності 2_5А синтетази, модифікований стосовно первинних культур пухлинних клітин та мононуклеарів периферійної крові, було апробовано в кліниці Українського НДІ урології і нефрології та Київській міській онкологічній лікарні для аналізу сприйнятливості до ІФН пухлин хворих на рак сечового міхура, які підлягали комбінованій терапії із застосуванням препарату рекомбінантного ІФН альфа. Дані, одержані в процесі виконання роботи, були використані в подальших дослідженнях, які проводяться в НДІ урології і нефрології , з метою застосування цього параметру для моніторингу інтерферонотерапії. Методика визначення синтетазної активності та одержані результати були впроваджені в НДІ епідеміології та інфекційних хвороб для скринінгу синтетичних та природних речовин як можливих індукторів ІФН. Результати щодо взаємодії ретиноїдів з системою ІФН можуть мати практичне значення для розробки методів комбінованої терапії з використанням ретиноїдів та ІФН. Одержані перещеплювані лінії клітин ОН, які можуть слугувати за модель, придатну для одночасного вивчення впливу ІФН та модулюючих факторів на проліферацію клітин і на репродукцію інтегрованих вірусів, впроваджені в лабораторіях інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології, інституту молекулярної біології і генетики та НДІ епідеміології та інфекційних хвороб.

Апробація результатів дослідження. Одержані результати були представлені на таких національних та міжнародних конференціях та симпозиумах:

ІІІ Всесоюзна конференція «Сучасні методи морфологічного дослідження в теоретичній та практичній онкології» (Тбілісі 1983); симпозиум з профілактики та лікування вірусних інфекцій (Любліце, Чехословаччина 1985); щорічні збори Міжнародного товариства з досліджень по інтерферону (ISIR) (Ніцца, Франція 1991 та Торонто, Канада 1992); Міжнародний симпозіум з алергології та клінічної імунології (Алма-Ата, Казахстан 1992); 8_й Міжнародний конгрес з імунології (Будапешт, Угорщина 1992); 4_а Міжнародна конференція з протиракових досліджень (Ретимнон, Греція 1992); 1_й з'їзд імунологів Росії (Новосибірськ, Росія 1992); 9_а Міжнародна конференція з СНІДу (Берлін, Німеччина 1993); науково-практична конференція онкологів України (Донецьк 1993); 7_й Пленум наукового товариства урологів України (Київ 1993); 18_й Міжнародний конгрес з хіміотерапії (Стокгольм, Швеція 1993); 19_й Міжнародний конгрес з хіміотерапії (Монреаль, Канада 1995); 1_а науково-практична конференція з проблем ВІЛ/СНІД з міжнародною участю (Київ, Україна 1995); 9_й Міжнародний конгрес з лікування раку (Париж, Франція 1999).

Публікації результатів досліджень. За результатами проведених досліджень опубліковано 4 журнальних статті в провідних фахових виданнях (одна з них - в закордонному виданні), 4 статті в збірниках праць (одна з них - в закордонному виданні) та 13 тез доповідей в вітчизняних та міжнародних збірниках матеріалів конференцій та симпозіумів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводились на базі Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України у відповідності з тематикою наукових досліджень Інституту, програмою ДКНТ України, а також Державною програмою досліджень з СНІДу. Дослідження були також узгодженні з тематиками НДІ епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л. Громашевського МОЗ України та Інституту урології та нефрології АМН України, на базі яких було виконано частину досліджень. Перещеплювані лінії клітин мишачої лімфоми, які продукують ендогенні ретровіруси, були одержані на основі штамів лімфом, що були індуковані Вас. megaterium H. в рамках досліджень, започаткованих чл.-кор. НАН України Д.Г.Затулою.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто було визначено план досліджень та виконано більшу частину експериментальної роботи, зокрема комплекс вірусологічних досліджень та експерименти з визначення активності 2_5А синтетази в первинних пухлинних клітинах, мононуклеарах периферійної крові здорових донорів та хворих, а також в перещеплюваних лініях пухлинних клітин різного генезу, включаючи і лінії мишачих лімфом, вперше одержаних автором з пухлин, індукованих бактеріями. Здобувач також особисто виконав експерименти по визначенню активності ІФН в культуральній рідині первинних та перещеплюваних ліній клітин та в сироватці здорових донорів і хворих, а також експерименти з визначення функціональної активності ефекторних клітин імунної системи. Здобувач виконав статистичну обробку одержаних даних та приймав безпосередню участь в оформленні матеріалів та підготовці їх до публікації.

На окремих етапах роботи дослідження проводились спільно з іншими співробітниками. Дослідження з клітинами, що продукують ВІЛ, проводили на базі лабораторії загальної вірусології НДІ епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л. Громашевського МОЗ України за участю д.м.н. С. Рибалко. Дослідження властивостей ендогенних ретровірусів мишей проводились разом з к.м.н. П. Верхацьким (ІЕПОР). При проведенні досліджень були використані оригінальні ліпідно-вітамінні композиції, розроблені к.м.н. І. Хаєцьким (ІЕПОР). Електрофоретичний аналіз синтезованих олігоаденілатів було проведено за допомогою к.б.н. З. Петрушенко (Інститут молекулярної біології і генетики НАНУ). Препарати тРНК, які були попередньо виділені та охарактеризовані, були люб'язно надані к.м.н. А.Верхацькою, дослідження ролі природних активаторів ферментів системи ІФН були проведені за її люб'язного сприяння. Клінічний та біохімічний аналіз у хворих на вірусний гепатит було проведено д.м.н. С.Федорченко (клініка НДІ епідеміології та інфекційних хвороб). Морфологічний аналіз препаратів раку сечового міхура та раку нирки хворих, які перебували на лікуванні в Українському НДІ урології і нефрології, було виконано на базі онкоурологічного відділення Київської міської онкологічної лікарні (керівник д.м.н. В.Кліменко). Відбір хворих та одержання операційного матеріалу проводили за сприяння к.м.н. В.Григоренка.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 188 стор. машинописного тексту. Вона складається з вступу, огляду літератури (2 розділи), чотирьох розділів власних досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел, який займає 30 стор. і містить 298 джерел. Дисертація містить 18 таблиць та 20 ілюстрацій.

2. Зміст роботи

Матеріали і методи. Дослідження проводили на первинних культурах мононуклеарів периферійної крові, первинних культурах клітин раку сечового міхура та нирки та перещеплюваних лініях пухлинних клітин різного генезу. Всього було проаналізовано 12 первинних культур мононуклеарів периферійної крові здорових донорів, 20 первинних культур мононуклеарів периферійної крові хворих на вірусний гепатит В, 7 первинних культур клітин раку нирки, 29 первинних культур раку сечового міхура, 18 первинних культурах мононуклеарів периферійної крові хворих на рак сечового міхура, 5 культур лімфоцитів, які інфільтрують пухлини (рак нирки). Показники інтерферонового статусу (рівні ІФН в сироватці та індукцію ІФН в мононуклеарах периферійної крові) аналізували у 34 здорових донорів та 34 хворих на рак сечового міхура. В процесі виконання досліджень автором було одержано 4 стабільних перещеплюваних лінії клітин мишачих лімфом.

Вірусологічні дослідження проведено як з ендогенними ретровірусами, асоційованими з клітинами мишачих лімфом, так і з ВІЛ в умовах гострої та хронічної інфекції культур лімфобластоїдних ліній людини.

В роботі використано рекомбінантні ІФН людини (альфа, бета та гамма), рекомбінантний інтерлейкін-2 та природні препарати мишачого ІФН, індукованого in vitro і in vivo.

В досліджуваних культурах було проаналізовано як базальну активність 2_5А синтетази, так і рівні її індукції при дії ІФН. Активність ферменту визначали за рівнем конверсії 3Н-АТФ до 2_5А. Для фракціонування синтезованого 2_5А від невключеного попередника використовували хроматографію на мініколонках ДЕАЕ-целюлози із ступінчатою елюцією та хроматографію на ДЕАЕ-целюлозі в суспензії в статичному варіанті. Окрім визначення сумарної активності 2_5А синтетази за інтегральним показником, проводили також аналіз продуктів синтетазної реакції за допомогою тонкошарової хроматографії та електрофорезу в поліакриламідному гелі з сечовиною (з використанням альфа-32Р_АТФ як міченого попередника).

ІФН титрували проти 100 ТЦПД50 вірусу везикулярного стоматиту (ВВС) на клітинах L41 (ІФН людини) та L929 (ІФН мишей). Типування ІФН проводили як за критерієм кислотолабільності, так і з використанням моноклональних антитіл проти людського ІФН альфа.

Визначення активності природних кілерів проводили в тесті з 3Н_уридином з використанням клітин К562 як мішеней. Визначення цитолітичної активності лімфоцитів, які інфільтрують пухлини, проводили в тесті з 3Н-уридином проти клітин Raji.

Результати та їх обговорення. Для визначення сприйнятливості клітин до екзогенного ІФН було проведено порівняльний аналіз величин базальної активності 2_5А синтетази та співвідношення між рівнями базальної та індукованої ІФН активності. Зведені дані по визначенню базальної та індукованої активності 2_5А синтетази в первинних культурах мононуклеарів периферійної крові та в деяких з досліджуваних перещеплюваних ліній лімфобластоїдних клітин наведені в таблиці 1.

В первинних культурах мононуклеарів периферійної крові здорових донорів величина базальної активності 2_5А синтетази була відносно низькою. Обробка клітин ІФН в усіх випадках призводила до підвищення цього рівня, причому найбільші значення індукованої активності спостерігали при застосуванні ІФН альфа. Не було жодного випадку, коли б клітини донорів не відреагували б на той чи інший ІФН, хоча певної кореляції між вихідним рівнем активності ферменту та кратністю його підвищення при дії ІФН не існувало.

При вивченні тих же показників в мононуклеарах периферійної крові хворих на вірусний гепатит В, було встановлено, що у деяких хворих базальний рівень не відрізняється суттєво від такого у здорових донорів, в той час як в інших випадках спостерігається підвищення базальних рівнів майже на порядок. Характер індукції ферменту після інкубації клітин з ІФН розрізнявся в залежності від вихідних рівнів активності ферменту, а саме, в підгрупі з високими значеннями базальних рівнів активності для жодного з ІФН не було відзначено подальшого суттєвого підвищення активності 2_5А синтетази.

Значення інтегральної базальної активності 2_5А синтетази в мононуклеарах периферійної крові хворих на рак сечового міхура були не набагато вищими за такі в мононуклеарах периферійної крові здорових донорів. Підвищення рівнів активності ферменту після інкубації мононуклеарів периферійної крові таких хворих з будь-яким з рекомбінантних ІФН виражене в меншій мірі в порівнянні з відповідними показниками для здорових донорів.

Аналіз показників активності 2_5А синтетази в перещеплюваних лініях трансформованих клітин показав, що в багатьох з них рівні базальної активності суттєво збільшені, разом з тим подальше зростання активності при індукції ІФН сягає в ряді випадків досить значних рівнів. Так, зокрема, в клітинах Raji активність 2_5А синтетази після інкубації клітин з ІФН альфа збільшувалась приблизно в 90 разів.

Середній показник базальної активності 2_5А синтетази в клітинах раку нирки був дещо вищим, ніж в мононуклеарах периферійної крові здорових донорів, але значно нижчим від базальних значень в перещеплюваних лініях клітин різного генезу. Практично такі ж дані були одержані і при визначенні базальної активності ферменту в клітинах раку сечового міхура (таблиця 2). Рівні індукованої активності ферменту свідчать про те, що в багатьох випадках клітини раку нирки та раку сечового міхура є сприйнятливими до дії ІФН, хоча відносний рівень зростання був порівняно невеликим. При аналізі індивідуальних даних в первинних культурах раку нирки можна було простежити зворотну залежність кратності зростання активності ферменту при дії ІФН альфа чи бета від вихідного рівня активності. У випадку раку сечового міхура середня кратність збільшення рівнів активності під впливом ІФН різних типів була вищою в порівнянні з клітинами раку нирки. Кратність збільшення активності синтетази була більш значною при застосуванні ІФН бета, причому найбільш вираженим ефект був в групах чоловіків старших за 50 років.

Таблиця 1 Вихідні та індуковані рівні активності 2-5А синтетази в мононуклеарах периферійної крові здорових донорів, хворих на вірусний гепатит В, хворих на рак сечового міхура та в лімфобластоїдних клітинах перещеплюваних ліній

Було проаналізовано також співвідношення між рівнями базальної та індукованої активності 2_5А синтетази та рівнями ендогенного ІФН, а також деякими показниками, що характеризують функціональну спроможність ефекторних клітин імунної системи. В перещеплюваних лініях як віруспродукуючих, так і віруснепродукуючих пухлинних клітин, незважаючи на підвищені рівні базальної активності ферменту, титри ендогенного ІФН в культуральному середовищі були на межі чутливості визначення.

У хворих на рак сечового міхура відносне зменшення сприйнятливості мононуклеарів периферійної крові до ІФН за критеріями індукції в них 2_5А синтетази супроводжується збільшенням рівнів ІФН гамма в сироватці крові та зменшенням функціональної спроможності природних кілерних клітин, яка частково відновлюється при їх інкубації з ІФН альфа (рис. 1).

Таблиця 2 Вихідні та індуковані рівні активності 2-5А синтетази в первинних культурах раку нирки та раку сечового міхура

Інкубація з ІФН альфа культур, одержаних при культивуванні in vitro в присутності ІЛ-2 лімфоцитів, які інфільтрують ракові пухлини нирки, призводить до збільшення показників їх цитолітичної активності, що супроводжується збільшенням рівнів активності індукованої 2_5А синтетази.

За допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі було проаналізовано профілі олігоаденілатів, синтезованих в безклітинних системах. В умовах стандартної синтетазної реакції з лізатами клітин, проінкубованих з ІФН, виявляються типові фосфорильовані та нефосфорильовані форми олігоаденілатів, причому в багатьох випадках переважають фосфорильовані форми. Вилучення дволанцюгової РНК з інкубаційної суміші призводить до повної втрати нефосфорильованих форм олігоаденілату. Саме використання цього методу аналізу продуктів 2_5А синтетазної реакції дозволило продемонструвати збільшення активності ферменту в лізатах, одержаних з культур лімфоцитів, які інфільтрують пухлини, що проявлялось як в збільшенні інтенсивності існуючих смуг 2_5А, так і в появі додаткових смуг.

Аналіз продуктів синтетазної реакції за допомогою тонкошарової хроматографії та електрофорезу дозволив продемонструвати, що очищені препарати тРНК можуть правити за активатори 2_5А синтетази, хоча для ефективного синтезу необхідно використовувати тРНК в кількостях, що практично на порядок перевищують такі для поліІ-поліЦ. Форми олігоаденілатів, що синтезуються в присутності тРНК, мало відрізняються від тих, що синтезуються в присутності поліІ-поліЦ.

Рис. 1 Вплив ІФН на активність природних кілерних клітин хворих на рак сечового міхура:1 - у здорових донорів; 2-5 - у хворих на рак сечового міхура:2-без обробки ІФН; 3-обробка ІФН альфа; 4-обробка ІФН бета; 5-обробка ІФН гамма

Цитотоксичність - в літичних одиницях на 107 клітин

Взаємодію ретиноїдів з системою ІФН та безпосередні ефекти ретиноїдів на проліферацію клітин та репродукцію вірусів вивчали в перешеплюваних лініях пухлинних клітин (в тому числі і в системах інтегрованої ретровірусної інфекції), а також в первинних культурах клітин раку сечового міхура. Ретиноїди справляють помітний гальмівний ефект на проліферацію клітин мишачої лімфоми. При цьому в тій же системі гальмування продукції ендогенних ретровірусів було виявлено лише за умови постійного підтримання культури в експоненційній фазі росту, при досягненні культурою стаціонарної фази було виявлено навіть деяке підсилення репродукції вірусів.

Культивування ВІЛ-інфікованих клітин в присутності ретиноїдів в системах як гострої, так і хронічної інфекції не супроводжується помітними змінами експресії вірусу, але при цьому відбувається суттєве пригнічення його інфекційності (табл. 3).

Попередня інкубація клітин Нер-2 в присутності ретиноєвої кислоти спричинює потенціювання щодо наступної індукції синтетази під впливом екзогенного ІФН альфа. Збільшення рівнів індукованої активності синтетази є досить суттєвим і носить дозозалежний характер.

Аналогічний ефект підсилення індукції синтетази при інкубуванні з ретиноєвою кислотою та ІФН альфа було виявлено і в первинних культурах пухлинних клітин деяких хворих на рак сечового міхура Таким чином, ефекти модулювання дії ІФН ретиноїдами в первинних та перещеплюваних культурах пухлинних клітин можуть частково опосередковуватись через систему 2_5А.

Таблиця 3 Вплив ІФН та ретиноїдів на репродукцію та інфекційність ВІЛ в хронічно інфікованих клітинах МТ4/ВІІІ

Висновки

1.Проведено порівняльний аналіз залежності між вихідними та індукованими ІФН рівнями 2-5А синтетази в перещеплюваних лініях та первинних культурах пухлинних клітин людини, в мононуклеарах периферійної крові здорових донорів, онкоурологічних хворих та хворих на вірусний гепатит В. Показано, що первинні культури клітин раку сечового міхура та раку нирки в більшості випадків сприйнятливі до дії ІФН. Рівень індукції 2-5А синтетази в мононуклеарах периферійної крові онкологічних хворих нижчій за такий у здорових людей, а мононуклеари периферійної крові значної частини хворих на вірусний гепатит В з підвищеними вихідними рівнями активності ферменту були рефрактерними до дії ІФН за цим показником.

2.Встановлено, що зменшення сприйнятливості мононуклеарів периферійної крові онкоурологічних хворих до екзогенного ІФН супроводжується зниженням функціональної активності природних клітин-кілерів та підвищенням рівнів ІФН гамма в сироватці цих хворих. Підсилення цитолітичної активності лімфоцитів, асоційованих з пухлинами, при інкубації цих клітин з ІФН альфа супроводжується збільшенням активності 2_5А синтетази.

3.Одержано серію перещеплюваних клітинних ліній мишачих лімфом, які можуть слугувати за модель для одночасного вивчення впливу факторів, що модулюють дію ІФН, на проліферацію клітин та репродукцію інтегрованих ретровірусів.

4.Показано, що в безклітинних системах очищені препарати природних тРНК можуть правити за активатори 2-5А синтетази замість штучних активаторів - длРНК, що дозволяє передбачати можливості такого функціонування тРНК і в природних умовах.

5.Доведено, що ретиноїди можуть за певних умов бути індукторами ІФН. Інкубація з ретиноїдами призводила до помітного гальмування росту клітин перещеплюваних ліній мишачих лімфом та до суттєвого зниження інфекційного титру ВІЛ. Показано, що ефекти модулювання дії ІФН ретиноїдами в первинних та перещеплюваних культурах пухлинних клітин можуть опосередковуватись через систему 2_5А.

6.Показники активності 2_5А синтетази, ключового ферменту системи ІФН, можуть використовуватись для визначення сприйнятливості клітин до ІФН та модуляції дії ІФН під впливом ретиноїдів.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Верхацкая А.А., Прохневская Е.Л., Завелевич М.П., Мацука Г.Х. Повышение активности 25-олигоаденилатсинтетазы в клетках рака почки и мочевого пузыря, обработанных интерфероном // Биополимеры и клетка. - 1991. - Т. 7, №6. - С. 102-106

2. Возианов А.Ф., Дранник Г.Н., Верхацкая А.А., Завелевич М.П., Прохневская Е.Л., Верхацкий П.П., Клименко И.А. Влияние различных типов рекомбинантного интерферона на индукцию 2,5-олигоаденилатсинтетазы в естественных киллерах и клетках опухоли у больных раком мочевого пузыря // Урология и нефрология. - 1993. - №5. - С. 22-25

3. Vosianov A.F., Drannik G.N., Verkhatskaya A.A., Zavelevich M.P., Grigorenko V.N., Klimenko I.A. Responsiveness of bladder cancer cells to interferon inducibility of 2'-5' - oligoadenylate synthetase in vitro // Experimental Oncology. - 1995. - V. 17, №2. - P. 95-98.

4. Tkachuk Z.Y, Rybalko S.L., Semernikova L.L., Tkachuk V.V., Zavelevich M.P., Tkachuk L.V., Eremenko T., Mikhailopulo I.A., Matsuka G.Kh. The effect of trimeric 2'5'-oligoadenylic acid and its epoxy-derivative on human immunodeficiency virus (HIV-1) reproduction and retroviruses reverse transcriptase activity // Microbiologica. - 1998. - V. 21,N2. - P. 197-201

5. Затула Д.Г., Лихтенштейн В.Е., Жмарева Е.Н., Завелевич М.П., Верхацкий П.П. Морфология перевиваемых культур мышиных лимфом, индуцированных Вас.megaterium H. // Материалы ІІІ Всесоюзной конференции “Современные методы морфологического исследования в теоретической и практической онкологии.” -Тбилиси. 1983. -Т.1.- С 118-119

6. Затула Д.Г., Завелевич М.П., Верхацкая А.А., Верхацкий П.П., Пинчук В.Г. Угнетение продукции ретровирусов и индукция ферментов интерфероном в культуре мышиной лимфомы // Вирусы и вирусные заболевания. -1987. - вып. 15. - С. 26-29

7. Верхацкий П.П., Завелевич М.П., Верхацкая А.А., Рыбкинска Т.А. Активация 2'5'-олигоаденилатсинтетазы дрожжевой тРНК // Вирусы и вирусные заболевания 1990. - вып. 18. - С. 19-124

8. Верхацкая А.А., Листопад Н.К., Завелевич М.П., Верхацкий П.П. Активация 2'5'-олигоаденилатсинтетазы у больных вирусным гепатитом В // Вирусы и вирусные заболевания.- 1991. -вып. 19. - С. 116-119

9. Verkhatskaya A.A., Zavelevich M.P., Verkhatsky P.P., Drannik G.N. tRNA - activator of 2',5'-oligoadenylate synthetase // Recent Advances in Chemotherapy. Proceedings of the 18th International Congress of Chemotherapy. -Stokholm, Sweden, June 27 - July 2, 1993. Ed. Einborn J., Nord C.E., Norrby S.R. American Society of Microbiology. Washington D.C. - 1993. - P. 657-658

10. Zavelevich M.P., Verkhatskaya A.A., Verkhatsky P.P. Interferon-induced suppression of retrovirus production and changes in enzyme activities in cells of murine lymphomas // Proceedings of Symposium “Prevention and treatment of viral infections”. - Liblice, Czechoslovakia. - June 1985

11. Matsuka G.C., Verkhatskaya A.A., Zavelevich M.P., Verkhatsky P.P. Comparison of susceptibility of leukemic cells from patients with chronic lymphocytic leukemia to different types of human recombinant interferon // Annual meeting of the International Society for Interferon Research. November 3-8, 1991, Nice, France // J. Interferon Research. - 1991.- V. 11,suppl.1. - P. S259

12. Verhatskaya A.A., Zavelevich M.P., Lystopad N.K., Verkhatsky P.P. Immunological control of ovarian cancer // Тезисы докладов Международного симпозиума по аллергологии и клинической иммунологии. Раздел 2. Клиническая иммунология. - Алма-Ата. - 28 сентября - 1 октября 1992 г. - С.72

13. Verhatskaya A.A., Zavelevich M.P., Verkhatsky P.P, Matsuka G.C. Comparative study of the oligoadenylate profiles in cells treated with interferon // Annual meeting of the International Society for Interferon Research. September 28 - October 2, 1992, Toronto, Canada. // J. Interferon Research.- 1992.- V. 12.,suppl.1.- P. S188

14. Verhatskaya A.A., Zavelevich M.P., Matsuka G.C. Involvement of the 2-5A pathway in the augmentation of TIL cytotxicity // Abstracts of the 8th International Congress of Immunology. - Budapest, Hungary. - August 23-28, 1992. - P. 190

15. Verhatskaya A.A., Zavelevich M.P., Verkhatsky P.P, Matsuka G.C. Oligoadenylate profiles in cancer cells treated with interferon // Abstracts of the 4th International Congress of Anticancer Research. October 21-25.- 1992.- Rethymnon, Greece.// Anticancer Res.- 1992.- V. 12,N6A. - P.1875-1876

16. Верхацкая А.А., Завелевич М.П., Верхацкий П.П. Чувствительность лимфоцитов больных хроническим лимфолейкозом к различным типам интерферона // Тезисы докладов I Съезда иммунологов России. - Новосибирск. - 1992. - С. 77.

17. Verhatskaya A.A., Zavelevich M.P., Kalachnjuk L.I., Matsuka G.C. Comparative study of rIFN alpha and yeast tRNA influence on NK-cell activity // Abstracts of IX International Conference on AIDS. - Berlin. - June 6-11, 1993

18. Клименко І.О., Григоренко В.М., Сакало В.С., Рябов М.Ф., Черненко О.Д., Каменець Л.Я., Хаєцький І.К., Завелевич М.П. Імунотропні фактори в комплексному лікуванні раку сечового міхура // Тези доповідей Науково-практичної конференції онкологів України. -Донецьк. - 1993. - С. 132-133.

19. Григоренко В.М., Клименко І.О., Дранник Г.М., Черненко О.Д., Верхацька А.О., Завелевич М.П. Інтерферон в комплексному лікуванні раку сечового міхура та прогнозування його дії // Праці VII пленуму наукового товариства урологів України. -Київ. - 1993. - С. 278-279.

20. Verkhatskaya A.A., Zavelevich M.P., Grigorenko V.N., Khaetsky I.K. Effects of retinoic acid on response of bladder cancer cells to interferon // Abstracts of the 19th International Congress of Chemotherapy. - Canada. - July 16-21, 1995. - P. 317

21. Верхацька А., Завелевич М., Рибалко С., Порівняльне вивчення профілів 2,5-олігоаденілатів у мононуклеарах периферійної крові хворих на гепатит В та на СНІД // Збірник тез першої Національної науково-практичної конференції з проблем ВІЛ/СНІД з міжнародною участю. Київ. - 24-26 січня 1995. - С. 48-49

Анотація

Завелевич М.П. Система 2-5 олігоаденілату в пухлинних та вірусінфікованих клітинах при дії інтерферонів та її модуляція ретиноїдами. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07 - онкологія. - Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України, Український науково-дослідний інститут онкології і радіології МОЗ України, Київ, 1999.

Дисертацію присвячено питанням функціонування 25_олігоаденілатсинтетази, ключового ферменту системи інтерферону, в перещеплюваних лініях та первинних культурах пухлинних клітин та в ефекторних клітинах імунної системи хворих на рак нирки та рак сечового міхура. Проаналізовано сприйнятливість цих клітин до інтерферонів за визначенням активності цього ферменту. Встановлено, що модуляція дії інтерферонів ретиноїдами в пухлинних клітинах може опосередковуватись через систему 25_олігоаденілату. Одержано перещеплювані лінії клітин мишачої лімфоми та охарактеризовано асоційовані з ними ретровіруси. При аналізі функціонування 25_олігоаденілатсинтетази в безклітинних системах показано, що препарати природних тРНК можуть правити за її активатори.

Ключові слова: інтерферон, 25_олігоаденілатсинтетаза, рак нирки, рак сечового міхура, культури пухлинних клітин, перещеплювані лінії лімфом, ретиноїди, тРНК

Аннотация

Завелевич М.П. Система 2-5 олигоаденилата в опухолевых и вирусинфицированных клетках при действии интерферонов и его модуляция ретиноидами. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.07 - онкология. - Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е.Кавецкого НАН Украины, Украинский научно-исследовательский институт онкологии и радиологии МЗ Украины, Киев, 1999.

Диссертация посвящена вопросам функционирования 25_олигоаденилатсинтетазы, ключевого фермента системы интерферона, в культурах перевиваемых линий, в первичных культурах мононуклеаров периферической крови здоровых доноров и больных вирусным гепатитом В, в первичных культурах опухолевых клеток и мононуклеаров периферической крови больных раком почки и раком мочевого пузыря, а также в культурах лимфоцитов, инфильтрирующих раковые опухоли почки, после их выращивания in vitro c интерлейкином-2. Проведено сравнительное изучение соотношений между исходными и индуцированными уровнями активности синтетазы и проанализирована чувствительность исследуемых клеток к интерферонам по определению активности этого фермента. Показано, что клетки первичных культур рака почки и рака мочевого пузыря в большинстве случаев были восприимчивы к действию рекомбинантных интерферонов. Индуцированные уровни активности 25_олигоаденилатсинтетазы в мононуклеарах периферической крови онкологических больных были ниже таковых у здоровых людей, а мононуклеары периферической крови значительной части больных вирусным гепатитом В с повышенными исходными значениями активности фермента были рефрактерными к действию интерферона. Исходные уровни активности синтетазы в клетках перевиваемых лимфобластоидных линий были существенно выше в сравнении с таковыми как в мононуклеарах периферической крови, так и в клетках первичных культур рака почки и рака мочевого пузыря. Вместе с тем, при действии интерферонов, в особенности интерферона альфа, отмечается значительное увеличение уровней активности 25_олигоаденилатсинтетазы, существенно превышающее таковое в первичных культурах опухолевых клеток.

Показано, что снижение чувствительности мононуклеаров периферической крови больных раком мочевого пузыря к интерферонам сопровождается снижением функциональной активности природных клеток-киллеров этих больных, что происходит на фоне повышения титров интерферона гамма в сыворотке крови. При этом титры интерферона альфа остаются практически неизменными. Инкубация природных клеток-киллеров онкоурологических больных с интерфероном альфа приводит к частичному восстановлению показателей их функциональной активности. Усиление цитолитической активности лимфоцитов, инфильтрирующих опухоли, при действии интерферона сопровождается повышением уровней индуцированной активности 25_олигоаденилатсинтетазы.

Установлено, что модуляция действия интерферонов ретиноидами в первичных культурах и перевиваемых линиях опухолевых клеток может частично осуществляться через систему 25_олигоаденилата. Предобработка клеток перевиваемых линий ретиноевой кислотой приводит к значительному усилению индукции в них синтетазы при последующей инкубации с интерфероном альфа. Усиление индукции синтетазы при действии интерферона отмечается и в некоторых первичных культурах клеток рака мочевого пузыря при их инкубации с ретиноевой кислотой. Инкубация клеток перевиваемых линий лимфом с ретиноидами приводит к существенному замедлению их пролиферации и при определенных условиях - к ингибированию продукции эндогенных ретровирусов. Инкубация инфицированных клеток с ретиноидами приводит к существенному снижению инфекционного титра вируса иммунодефицита человека в системах острой и хронической инфекции лимфобластоидных клеток in vitro.

При анализе функционирования 25_олигоаденилатсинтетазы в бесклеточных системах показано, что препараты тРНК могут служить в качестве ее активаторов в бесклеточных системах.

Ключевые слова: интерферон, 25_олигоаденилатсинтетаза, рак почки, рак мочевого пузыря, культуры опухолевых клеток, ретиноиды, тРНК

Summary

Zavelevich M.P. Effects of interferons on the state of 2-5 olygoadenylate system in cancer cells and virus-infected cells and modulation of these effects by retinoids. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by speciality 14.01.07 - oncology.- R.E.Kavetsky Institute of experimental pathology, oncology and radiobiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Ukranian Research Institute of Oncology and Radiology Ministry of Health Care of Ukraine, Kyiv, 1999.

The dissertation deals with the problems of the 25 oligoadenylate synthetase functions in transplantable cell lines, primary cultures of cancer cells and effector cells of immune system of renal cell carcinoma and bladder cancer patients. The susceptibility of the cells under study to interferons has been analysed in vitro by the 25 oligoadenylate synthetase assay. The modulation of interferon effects by retinoids in cancer cells has been shown to be partially mediated by 25-oligoadenylate system. Analysis of synthetase reaction products in cell-free system suggested that natural tRNA could serve as the activators of. 25 oligoadenylate synthetase

Key words: interferon, 25 oligoadenylate synthetase, renal cell cancer, bladder cancer, cancer cell cultures, retinoids, tRNA

Размещено на Allbest.ru