Вплив факторів кріоконсервування на збереження фрагментів селезінки свиней
Дослідження впливу швидкостей охолодження і кріопротекторів (ДМСО, гліцерин, ПЕО-400 і ПЕО-1500 в концентраціях 5, 10 і 20 процентів) на збереження фрагментів селезінки свиней. Використання і розробка способу кріоконсервування досліджуваного біоматеріалу.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 22.02.2014 |
| Размер файла | 35,0 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
УДК 615.361.41.014.41:577.117:57.043
03.00.19 - кріобіологія і кріомедицина
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Вплив факторів кріоконсервування на збереження
фрагментів селезінки свиней
Мамонтова Антоніна Василівна
Харків- 2000
Дисертацією є рукопис
Роботу виконано у відділі експериментальної кріомедицини інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Бондаренко Валерій Антонович, зав. відділом кріофізіології клітини ІПКіК НАН України
Офіційні опоненти:
Доктор біологічних наук, професор Жегунов Геннадій Федорович, Харківський медичний університет, кафедра медичної біології, зав. кафедрою медичної біології.
Кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник, Леонтьєва Фріда Соломонівна, Харківський науково-дослідний інститут ортопедії і травматології ім. проф. М.І. Ситенка, завідуюча лабораторією клінічної діагностики.
Провідна установа: Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, кафедра біофізики, м. Харків
Захист відбудеться " 23 " травня 2000 р. о 13 30 годині на засіданні спеціалізованої Вченої Ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України 61015, Харків-15, вул. Переяславська, 23
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІПКіК НАН України 61015, Харків-15, вул. Переяславська, 23
Автореферат розісланий "22"квітня 2000 р.
Вчений секретар спеціалізованої Вченої Ради докт. мед. наук, професор А.М. Гольцев
Анотації
Мамонтова А.В. Вплив факторів кріоконсервування на збереження фрагментів селезінки свиней. - Рукопис.
Дисертація на здобуття вченого ступеню кандидата біологічних наук зі спеціальності 03.00.19 - кріобіологія і кріомедицина. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2000.
У роботі було досліджено вплив швидкостей охолодження і кріопротекторів (ДМСО, гліцерин, ПЕО-400 і ПЕО-1500 в концентраціях 5, 10 і 20 процентів) на збереження фрагментів селезінки свиней. Вивчалось збереження таких показників життєздатності як інтенсивність ендогенного дихання фрагментів, а також деякі показники функціонально-метаболічного стану спленоцитів.
На підставі отриманих даних розроблено спосіб кріоконсервування досліджуваного біоматеріалу, який включає заморожування фрагментів зі швидкістю 1 оС/хв у присутності 20% ПЕО-400 або ПЕО-1500 і дозволяє створити їх певний запас у кріобанку для подальшого використання в медичній практиці, наукових дослідженнях, біотехнології.
Ключові слова: фрагменти селезінки, спленоцити, кріоконсервування, ендогенне дихання, перекисне окислення, хемілюмінісценція.
Мамонтова А.В. Влияние факторов криоконсервирования на сохранность фрагментов селезенки свиней. - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология и криомедицина. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2000.
Важное место в решении проблемы компенсации септических состояний занимают методы, основанные на использовании экстракорпоральных систем очистки и модуляции состава крови контурами, включающими в себя функционально-активные клетки или фрагменты тканей различных органов, в том числе селезенки. В клинической практике широкое распространение получило использование фрагментов ткани селезенки свиней. Но эффективное их использование, как
и большинства других биологических объектов, возможно только при наличии этого материала в достаточном количестве. Эта задача может быть решена путем создания банка криоконсервированных фрагментов ксеноселезенки.
В работе было исследовано влияние скоростей охлаждения и криопротекторов (ДМСО, глицерин, ПЭО-400 и ПЭО-1500 в концентрациях 5, 10 и 20%) на сохранность фрагментов селезенки свиньи. Изучалась сохранность таких показателей жизнеспособности, как интенсивность эндогенного дыхания фрагментов и перекисных процессов в них, сорбционная способность фрагментов, а также некоторых показателей функционально-метаболического состояния спленоцитов. При подготовке биологического материала к криоконсервированию важным фактором является его исходное состояние, которое зависит от времени тепловой ишемии, температуры хранения и временихранения до замораживания. Наиболее щадящими при временном хранении являются гипотермические температуры.
Полученные результаты позволяют утверждать, что интенсивность дыхания фрагментов практически не уменьшается при хранении селезенки при 4 0С в течении одних суток, наблюдается ее уменьшение к полутора суткам и значительное уменьшение через двое суток хранения. Это может быть объяснено истощением эндогенных субстратов, а также повреждением клеток и их органелл в связи с развитием перекисных процессов, которые через 36 часов увеличиваются больше чем в два раза, а через двое суток хранения - в четыре раза. Сохранность спленоцитов также остается на уровне контроля в течение одних суток, а потом снижается.
При изучении влияния криопротекторов и скоростей охлаждения на сохранность эндогенного дыхания фрагментов селезенки установлено, что если в качестве криопротекторов используются ДМСО и глицерин, то интенсивность дыхания составляет максимум 70% от контроля при медленных скоростях охлаждения. ПЭО-400 и ПЭО-1500 проявляет более выраженный криозащитный эффект. Таким образом можно сделать вывод, что наиболее перспективными криопротекторами в плане разработки технологии криоконсервирования фрагментов селезенки свиньи является ПЭО-400 и ПЭО-1500.
Из полученных результатов по динамике перекисных процессов можно сделать вывод, что криопротекторы, которые использовалисьв работе приводят к значительному уменьшению интенсивности перекисных процессов после криоконсервирования по сравнению с замораживанием без криопротектора. Об уровне сохранности спленоцитов после низкотемпературного консервирования можно судить по различным показателям, в том числе по интенсивности дыхания и сопряженности дыхания и окислительного фосфорилирования. Одним из показателей сохранности энергетического потенциала клеток после криоконсервирования может быть содержание в них АТФ. Полученные данные позволяют утверждать, что при использовании в качестве криопротекторов ПЭО-400 или ПЭО-1500 в концентрациях 20% и скорости охлаждения 1 оС/мин изученные показатели остаются на уровне контроля и сохраняются в течение 3 часов после отогрева. На основании полученных результатов разработан способ криоконсервирования исследуемого биоматериала, которая включает замораживание фрагментов со скоростью 1 оС/мин в присутствии 20 % ПЭО-400 или ПЭО-1500 и позволяет создать их определенный запас в криобанке для последующего использования в медицинской практике, научных исследованиях, биотехнологии.
Ключевые слова: фрагменты селезенки, спленоциты, криоконсервирование, эндогенное дыхание, перекисное окисление, хемилюминисценция.
Mamontova A.V. Effect of the factors of cryopreservation on the integrity of pig's spleen fragments.- Manuscript
The thesis for the obtaining of PhD scientific degree in biological sciences on the speciality - 03.00.19 - cryobiology and cryomedicine. - Institute for Problems of Cryobiology & Cryomedicine of the National Academy of Sciences of the Ukraine, Kharkov, 2000.
In the work the effect of cooling rates and cryoprotectants
(DMSO, glycerol, PEO-400 and PEO-1500 in the concentrations of 5, 10, and 20%) on the integrity of pig's spleen fragments was studied. The integrity of such viability indices as the intensity of endogenous respiration of fragments and peroxidation processes in them, sorptional ability of frgaments as well as some indices of functional metabolic state of splenocytes has been investigated.
Onthe basis of the results obtained the cryopreservation
technology of the biomaterial studied, including fragment freezing down with the rate of 1C/min in the presence of 20% PEO-400 and PEO-1500 and allowing to create their certain stocks in the cryobank for further application in medical practice, researches, biotechnology, was developed.
Key words: spleen fragments, splenocytes, cryopreservation, endogenous respiration, peroxidation, hemiluminescence
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Важливе місце у вирішенні проблеми компенсації септичних станів займають методи, засновані на використанні екстракорпоральних систем очищення і модуляції складу крові контурами, які містять в собі функціонально активні клітини або тканинні фрагменти різних органів, у тому числі селезінки (Грищенко В.І., 1997, Сандомирський Б.П., 1995). У клінічній практиці широке розповсюдження отримало використання фрагментів тканини селезінки свині (Оніщенко Н.А., 1995). Але ефективне їх використання, як і більшості інших біологічних об'єктів, можливе тільки при наявності цього матеріалу в достатній кількості. Ця задача може бути вирішена шляхом створення банку кріоконсервованих фрагментів ксеноселезінки. Проте, в теперішній час відсутні науково обгрунтовані методи і технології кріоконсервування фрагментів селезінки.
У 1975 р. вперше були отримані соматичні гібридні клітини-гібридоми, які утворюються з мієломних клітин і лімфоцитів селезінки. На основі лімфоїдних і гібридомних клітин одержують цінні культуральні біопродукти медичного призначення, які застосовуються в діагностиці, терапії і профілактиці різних патологій, для тонкої хімічної очистки біологічно активних речовин і т.д. Кріоконсервовані фрагменти селезінки можуть бути також джерелом лімфоїдних клітин для біотехнології і біологічних досліджень. кріопротектор селезінка охолодження
Розробка технології кріоконсервування біологічних об'єктів тісно пов'язана з з'ясуванням механізмів кріопошкодження і кріозахисту матеріалу, який підлягає кріоконсервуванню. Розуміння цих механізмів дозволяє розробляти програми кріоконсервування біооб'єктів з високим рівнем збереження деконсервованих зразків. Під час заморожування велика кількість факторів може визивати пошкодження клітин і, в першу чергу, мембранних структур. До таких факторів відносяться кристалізація розчинів, яка приводить до створення на певних етапах заморожування гіперконцентрованих розчинів солей і змінення рН. При цьому відбувається зневоднення клітин, що може призводити до негативних наслідків. Зменшити вплив цих наслідків можливо підбором оптимальної швидкості охолодження.
Другим фактором, за допомогою якого можливо впливати на результат кріоконсервування, є застосування кріопротекторів, які можуть захищати клітини від пошкодження під час кріоконсервування. Їх ефективність у залежності від об'єкта кріоконсервування частіше за все визначають емпірично.
Об'єктом дослідження в цій роботі були фрагменти селезінки свиней. У зв'язку з недостатньою кількістю даних про ефективність кріопротекторів у залежності від швидкості охолодження і про вплив цих швидкостей на збереження фрагментів селезінки і спленоцитів, які входять до їх складу, у роботі використовувались кріопротектори, що належать до різних класів хімічних речовин:гліцерин (спирт), ДМСО (оксид), ПЕО-400 і ПЕО-1500 (полімери). Оскільки провідну роль у долі клітини відіграє стан як плазматичних мембран, так і внутрішньоклітинних органел, у роботі особлива увага приділялась їх стану після відігріву. Для цього використовувались методи, що дозволяють виявляти як грубі пошкодження мембран (наприклад, фарбування трипановим синім), так і методи, що дозволяють виявити більш тонкі її порушення (за інтенсивністю перекисних процесів, мембранному потенціалу і т.д.). Використовувались також методи інтегральної оцінки збереження біоматеріалу.
Зв'язок роботи з науковими програмами. Дисертація виконана відповідно з планом науково-дослідних робіт по темі НДР N 75(2.2.6) Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України по проблемі 2.28.7.4, "Клітинна фізіологія, механізми пошкодження, адаптації, старіння і репарації клітин".
Ціль і задачі дослідження. Цілью даної роботи є вивчення впливу швидкостей охолодження і різних кріопротекторів в залежності від їх концентрації на функціональні показники (ендогенне дихання, інтенсивність перекисного окислення в фрагментах, їх сорбційну здатність, сполучення дихання і окислювального фосфорилювання в спленоцитах, вміст АТФ, збереження мембранного потенціалу, життєздатність по фарбуванню трипановим синім, хемілюмінісцентну відповідь на додавання латексу),які відображають рівень збереження фрагментів селезінки і спленоцитів. На основі отриманих даних розробити спосіб кріоконсервування фрагментів селезёнки свиней.
Конкретними задачами дослідження були наступні:
1. Визначити допустимий час гіпотермічного зберігання селезінки (при 4о 0С).
2. Дослідити ефективність таких кріопротекторів як ДМСО, гліцерин, ПЕО-400 і ПЕО-1500 у залежності від концентрації і швидкості охолодження при кріоконсервуванні фрагментів селезінки.
3. Визначити оптимальний режим кріоконсервування фрагментів селезінки.
4. Вивчити динаміку показників збереження деконсервованого матеріалу в часі.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що кріопротектори ПЕО-400 і ПЕО-1500 у концентрації 20% дозволяють отримати максимальний рівень збереження фрагментів селезінки і спленоцитів при швидкості охолодження 10 оС/хв. При швидкості 1000 оС/хв спостерігається другий максимум збереження. Гліцерин і ДМСО, в даному випадку, є менш ефективними кріопротекторами, ніж поліетиленоксиди.
Практичне значення одержаних результатів. У результаті проведених досліджень отримані експериментальні дані, які дозволили розробити спосіб кріоконсервування фрагментів селезінки свиней, що відзначаються високим рівнем збереження і можуть бути придатними для клінічного використання. Високий рівень збереження спленоцитів після кріоконсервування фрагментів за оптимальною програмою дозволяє рекомендувати їх для використання в біотехнології і наукових дослідженнях.
Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проведені: патентно-інформаційний пошук, експериментальні дослідження, статистична обробка і аналіз експериментальних даних. Розроблені основні положення і висновки дисертації.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи були представлені і обговорені на I-му з'їзді Українського товариства кріобіології і кріомедицини (Харків, 1995), міжнародній конференції Cryo-96 (Індіанополіс, 1996), міжнародній конференції Cryo-97 (Барселона, Іспанія, 1997), науковому семінарі (Харків, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 1998).
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи видано 7 робіт, із них 3 - статті у фахових наукових журналах.
Обсяг та структура дисертації. Дисертацію викладено на 102 сторінках друкованого тексту, вона складається із вступу, огляду літератури, методів дослідження, власних експериментальних досліджень (6 глав), заключення, висновків і списку літератури. Текст проілюстровано 22 таблицями та 17 рисунками. Бібліографія містить 150 найменувань робіт.
Зміст роботи
Об'єкти та методи експериментальних досліджень
Об'єктом дослідження були фрагменти селезінки статевозрілих свиней. Селезінку отримували на Харківському м'ясокомбінаті і доставляли в лабораторію у льоду. Селезінку подрібнювали на фрагменти вагою 5 - 10 мг і три рази відмивали в 10-кратному об'ємі фізіологічного розчину. У ролі кріопротекторів використовували гліцерин, ДМСО (дімексид), ПЕО-400 і ПЕО-1500 (поліетиленоксиди з м.м. 400 і 1500) в кінцевих концентраціях 5, 10 і 20 процентів. Розчини кріопротекторів, що містили їх подвійну концентрацію, добавлялись краплинно до фрагментів тканини у співвідношенні 1:1. Завись фрагментів розфасовувалась у пластикові контейнери об'ємом 1 мл або в контейнери з фольги товщиною 30 мкм для надшвидкого заморожування. Розмір контейнерів із фольги 40х 50 мм, товщина заморожуваного шару 0,25 мм, об'єм 0,5 мл. Заморожування зі швидкостями 1, 10 і 100 оС/хв проводилось з допомогою програмного заморожувача УОП-6, а з більшими швидкостями - зануренням у рідкий азот (1000 оС/хв) і за допомогою обладнання для заморожування біологічних об'єктів (8 000 і 80 000 0С/хв) (В.І.Грищенко і ін., 1989). Відігрів проводили на водяній бані при +40 оС. Відмивання від кріопротекторів проводили сахарозними середовищами з наступною їх заміною на фізіологічний розчин.
Інтенсивність дихання вимірювали на полярографі фірми Radelkis. До ячейки полярографа вносили 30-40 мг тканини. Динаміку ендогенного дихання реєстрували на самописці і розраховували в нмоль О 2/хв мг тканини.
Інтенсивність перекисних процесів у тканині і її стійкість до цих процесів визначали хемілюмінісцентним методом, додаючи в ячейку хемілюмінометра, яка містить 1 мл фізіологічного розчину і 100 мкл гомогенату тканини, 1 ммоль двовалентного заліза або 200 мкл 5%-го розчину перекису водня. Результати вимірювання представляли у відносних одиницях або як нормоване значення (відношення отриманої величини до контролю)(А.І. Журавльов, 1975).
Поглинання ДСМ (n-толуолсульфонат 4 - (4'-діметиламіносте-рил)-1-метилпіридіній) фрагментами селезінки визначали, пропускаючи його розчин через колонку, що містить 1г тканини. Величину поглинання визначали по різниці концентрацій ДСМ до і після проходження колонки. Концентрацію ДСМ визначали по калібровочному графіку при довжині хвилі збудження 480 нм і флуоресценції 602 нм (Г.Є. Добрецов, 1986)
Спленоцити отримували шляхом щадящого диспергування фрагментів в охолодженому до +4 оС Рінгер-фосфатному буфері, рН -7,4. Суспензію фільтрували. Клітини осаджували центрифугуванням при 250g протягом 10 хвилин і ресуспендували в тому ж самому буфері. Кількість ізольованих клітин підраховували в камері Горяєва. Їх життєздатність визначали шляхом фарбування трипановим синім (А.О. Цуцаєва, 1983).
Для визначення вмісту АТФ у спленоцитах клітини осаджували центрифугуванням і ресуспендували в 0,3 мл охолодженого буфера Кребса-Гензелейта. Додавали 0,2 мл 12% розчину HClO 4, перемішували і залишали на 10 хв при кімнатній температурі. Після завершення екстракції осадок білків відділяли центрифугуванням. Вміст АТФ у екстракті визначали за допомогою люциферин-люциферазного методу на хемілюмінометрі і перераховували на 108 клітин(Ф.І. Атаулаханов, 1981).
Збереження мембранного потенціалу визначали за допомогою зонда ДСМ. До суспензії клітин (106 кл/мл) додавали водний розчин ДСМ до кінцевої концентрації 10 мкмоль. Інтенсивність флуоресценції зонда в клітинах вимірювали на спектрофлуориметрі при 520 нм. Такий підхід дозволяє оцінити сумарний потенціал мітохондрій і плазматичної мембрани. Результати представляли в відносних одиницях (Г.Є. Добрецов, 1986).
Хемілюмінісценцію спленоцитів при додаванні латекса реєстрували на хемілюмінометрі, що працює в режимі рахунку фотонів. У ячейку хемілюмінометра вносили 1 мл розчину Хенкса, 106 кл/мл, 5 . 107 частинок латексу і 50 мкмоль люмінолу. Вимірювання проводились через 15 хв після змішування при + 37 оС (А.В. Зурочка, 1989). У роботі використовувались реактиви марки не нижче ХЧ. Розчини для хемілюмінісцентних досліджень готувались на бідистильованій воді. Вміст АТФ визначали з допомогою біолюмінісцентного реагенту "МИКРОЛЮМ" виробництва Інституту імунобіотехнології, м. Москва.
Статистичну обробку отриманих результатів проводили за методом Стьюдента-Фішера на персональному комп'ютері. Кількість зразків в експериментах від 5 до 10.
Результати досліджень та їх обговорення
1. Вплив гіпотермічного зберігання селезінки на збереження отриманих з неї фрагментів і клітин
При підготовці біологічного матеріалу до кріоконсервування важливим фактором є його початковий стан, який залежить від часу теплової ішемії, температури зберігання і часу збереження до заморожування. Найбільше щадящими при короткочасному зберіганні є гіпотермічні температури. Отримані результати дозволяють стверджувати, що інтенсивність дихання фрагментів практично не зменшується при зберіганні селезінки при +4оС впродовж однієї доби, спостерігається її зменшення до 36 годин і значне зменшення через дві доби зберігання. Це може бути пояснено виснаженням ендогенних субстратів, а також пошкодженням клітин і їх органел у зв'язку з розвитком перекисних процесів, які через півтори доби збільшуються більше, ніж в два рази, а через дві доби зберігання - в чотири рази. Збереження спленоцитів також залишається на рівні контролю впродовж однієї доби, а потім знижується. Таким чином, із отриманих даних можна зробити висновок, що гіпотермічне зберігання селезінки до отримання з неї фрагментів і іх кріоконсервування не повинно тривати більше однієї доби.
2. Вплив режимів кріоконсервування і кріопротекторів на інтенсивність дихання фрагментів селезінки
Швидкість охолодження біологічних об'єктів є одним із основних факторів, що визначають збереження клітин в процесі кріоконсервування. Ефективність кріопротекторів залежить від біологічного об'єкта, хімічної природи кріопротектора і його концентрації. Ця ефективність також залежить від швидкості охолодження, що іноді дозволяє зменшити його концентрацію (В.І.Грищенко, 1993). У цьому розділі своєї роботи ми вивчали вплив кріоконсервування на інтенсивність дихання фрагментів селезінки свині в залежності від концентрації кріопротекторів різної природи і швидкості охолодження. Як кріопротектори використовували гліцерин (спирт), ДМСО (оксид), ПЕО-400 і ПЕО-1500 (полімери).
Заморожування фрагментів селезінки без кріопротектора не дозволяє зберегти інтенсивність дихання на рівні, більшому ніж 50% від контроля. Якщо кріопротекторами були ДМСО і гліцерин, то інтенсивність дихання складала максимум 70% від контролю при повільних швидкостях охолодження. ПЕО-400 і ПЕО-1500 виявляють більший кріозахисний ефект. В табл. 1 представлені дані щодо інтенсивності дихання фрагментів селезінки в залежності від концентрації ПЕО-400 і швидкості охолодження. Як видно із цих даних, при повільних швидкостях охолодження і концентрації кріопротектора 10-20% інтенсивність дихання не відрізняється від контролю (незаморожені фрагменти). Подібні результати отримані і для ПЕО-1500.
Таким чином можна зробити висновок, що найбільш перспективними кріопротекторами в плані розробки технології кріоконсервування фрагментів селезінки свині є ПЕО-400 або ПЕО-1500.
3. Вплив режимів кріоконсервування на характер перекисних процесів в тканині
Вивчаючи характер перекисних процесів у фрагментах селезінки, ми отримали інформацію про процеси, що відбуваються в мембранах на молекулярному рівні після впливу на неї факторів кріоконсервування.
В зв'язку з тим, що кріопротектори захищають біологічні структури від впливу негативних факторів під час заморожування - відігріву, а деякі з них, наприклад, ДМСО і гліцерин, є радіопротекторами і володіють антиоксидантною активністю, уявляється цікавим визначити їх вплив на динаміку перекисних процесів залежно від режимів кріоконсервування (В.А. Барабой, 1986).
В табл. 2 наведені дані щодо інтенсивності перекисних процесів у тканині фрагментів селезінки в залежності від концентрації ПЕО-400 і швидкості охолодження. Подібні результати отримані і для ПЕО-1500.
Таблиця 1 Інтенсивність дихання фрагментів селезінки (нмоль О 2/хв мг тканини), заморожених з різними швидкостями в залежності від концентрації ПЕО-400
|
1оС/хв |
10оС/хв |
100оС/хв |
1000оС/хв |
8000оС/хв |
80000С/хв |
||
|
5% |
0,29 0,02* |
0,23 0,01 |
0,12 0,01 |
0,24 0,02 |
0,20 0,02 |
0,11 0,01 |
|
|
10% |
0,34 0,02* |
0,31 0,02* |
0,14 0,01 |
0,29 0,01 |
0,21 0,01 |
0,15 0,01 |
|
|
20% |
0,33 0,03* |
0,32 0,03* |
0,18 0,01 |
0,25 0,02 |
0,26 0,01 |
0,20 0,01 |
*) Відмінності недостовірні в порівнянні з контролем: Р > 0,05 Примітка: інтенсивність дихання контролю 0,34 0,02 нмоль О 2 / [ хв мг тканини
Таблиця 2 Інтенсивність хемілюмінісценції фрагментів селезінкі (відн. од. і нормовані значення), індукованої Fe++ в залежності від швидкості охолодження і концентрації ПЕО-400
|
Контроль |
1оС/хв |
10оС/хв |
100оС/хв |
1000оС/хв |
8000оС/хв |
80000оС/хв |
|||
|
5% |
Світло-сума |
208 21 |
270 30* |
480 42 |
617 54 |
494 42 |
514 49 |
812 71 |
|
|
Нормовка |
1,0 |
1,3 |
2,3 |
3,0 |
2,4 |
2,5 |
3,9 |
||
|
10% |
Світло-сума |
220 18 |
240 23* |
413 39 |
564 49 |
461 48 |
561 52 |
730 65 |
|
|
Нормовка |
1,0 |
1,1 |
1,9 |
2,6 |
2,1 |
2,3 |
3,3 |
||
|
20% |
Світло-сума |
211 22 |
240 26* |
365 33 |
452 39 |
291 24* |
408 44 |
618 59 |
|
|
Нормовка |
1,0 |
1,1 |
1,7 |
2,1 |
1,4 |
1,9 |
2,9 |
*) Відмінності недостовірні в порівнянні з контролем: Р > 0,05
Із отриманих результатів можна зробити висновок, що кріопротектори, які використовувались в роботі, приводять до значного зменшення інтенсивності перекисних процесів після кріоконсервування в порівняннё з заморожуванням без кріопротектора. При цьому максимальна інтенсивність цих процесів спостерігається при швидкості охолодження 100 і 80 000 0С/хв, що корелює з інтенсивністю дихання фрагментів. Спостерігається також залежність інтенсивності пероксидації від концентрації кріопротектора. При цьому ДМСО володіє більш вираженою антиоксидантною активністю.
Також нами показано, що стійкість тканини до перекисного окислення збільшується із підвищенням концентраціє кріопротектора. Кріопротектори різної хімічної природи при заморожуванні фрагментів тканини виявляють приблизно однакову захисну дію на стійкість до перекисного окислення. Нами також показано, що відношення нормованих значень показників інтенсивності перекисного окислення до нормованих показників інтенсивності дихання фрагментів при повільних швидкостях охолодження і концентраціях кріопротектора 10 і 20% близьке до одиниці. Тобто, можна припустити, що в даному випадку основним фактором, який визначає інтенсивність дихання, є перекисне окислення ліпідів.
Таким чином, на підставі даних про інтенсивність перекисних процесів у деконсервованих фрагментах селезінки і їх стійкості до перекисних процесів можна зробити висновок, що підбором кріопротекторів і їх концентрації можна добитися мінімальної стимуляції перекисних процесів при кріоконсервуванні.
4. Вплив режимів кріоконсервування на сорбційну здатність фрагментів селезінки
Структурну основу всіх лімфоїдних органів складають ретикулярні клітини, які здатні поглинати, накопичувати і руйнувати чужорідні сполуки. Такою ж здатністю повинні володіти і фрагменти селезінки. В даному випадку ми визначали захват фрагментами селезінки зонда ДСМ із розчину, який пропускали через колонку, заповнену фрагментами селезінки до і після кріоконсервування з використанням різних режимів. Як кріопротектори використовувались ПЕО-400 і ПЕО-1500 в різних концентраціях.
При заморожуванні фрагментів селезінки без кріопротектора захват не перевищував 50% від контролю і слабо залежав від швидкості охолодження. Якщо заморожування проводилося в присутності ПЕО-400 або ПЕО-1500, то при швидкості охолодження 1 оС/хв захват ДСМ складав більше 90% від контролю.
5. Вплив режимів кріоконсервування на збереження спленоцитів
Про ступінь збереження спленоцитів після низькотемпературного консервування можна судити за різними показниками, у тому числі за інтенсивністю дихання і сполученню дихання і окислювального фосфорилювання. Одним із показників збереження енергетичного потенціалу клітин після кріоконсервування може бути вміст у них АТФ.
Однією з причин зменшення кількості АТФ може бути виникнення умов, що приводять до більш активного розщеплення АТФ ферментами внаслідок порушення притаманних нативним клітинам структурної ізоляції нуклеотидів від таких ферментів, як аденозинтрифосфатаза або дезаміназа. Не виключена можливість втрати аденозинфосфатів у результаті порушення проникності мембран клітин.
В табл. 3 наведені дані по інтенсивності дихання, сполучення дихання і окислювального фосфорилювання і стимуляції дихання сукцинатом у залежності від кріопротектора, його концентрації і швидкості охолодження. Із цих даних видно, що ПЕО-400 і ПЕО-1500 в концентрації 20% дозволяє зберегти ці показники на рівні, близькому до контролю. Зменшення концентрації кріопротектора або збільшення швидкості охолодження призводить до зменшення збереження клітин.
Кількість АТФ у деконсервованих клітинах достовірно зменшується, але залишається на досить високому рівні при заморожуванні фрагментів селезінки зі швидкістю 1 оС/хв і концентрації ПЕО-400 або ПЕО-1500 20%. В табл. 4 наведені дані щодо життєздатності спленоцитів, визначеної по прокрашуванню трипановим синім, мембранному потенціалу і по хемілюмінісцентній відповіді на додавання латексу. Із наведених даних видно, що кріоконсервування фрагментів селезінки зі швидкістю охолодження 1 оС/хв дозволяє зберегти ці показники на досить високому рівні.
Таблиця 3 Дихання і окислювальне фосфорилювання у спленоцитах, виділених з фрагментів селезінки після їх кріоконсервування в залежності від кріопротектора і його концентрації (нмоль О 2/хв 108 кл). Швідкість охолодження - 1оС/хв
|
Vo |
VДНФ/ Vo |
Vсукц /Vо |
||
|
Контроль |
9,1 0,9 |
1,9 0,1 |
1,0 0,1 |
|
|
Без криопрот. |
3,1 0,1 |
1,2 0,1 |
2,2 0,2 |
|
|
ПЕО-400 10% |
8,3 0,9 |
1,5 0,2 |
1,2 0,2 |
|
|
20% |
8,0 1,00 |
1,8 0,2 |
1,1 0,2 |
|
|
ПЕО-1500 10% |
7,1 0,8 |
1,4 0,1 |
1,3 0,1 |
|
|
20% |
7,8 1,2 |
1,7 0,1 |
1,1 0,1 |
*) Відмінності недостовірні в порівнянні з контролем: Р > 0,05
Таблиця 4 Кількість життєздатних спленоцитів, виділених із фрагментів селезінки після їх кріоконсервування, визначаєма по прокрашуванню трипановим синім (в %), мембранний потенціал (ДСМ, відн. од.) і хемілюмінісцентна відповідь на додавання латексу (ХЛ відповідь, % від контролю). Швидкість охолодження - 1оС/хв
|
% |
ДСМ (відн. од.) |
ХЛ відповідь |
||
|
Контроль |
93 |
137 14 |
100 |
|
|
Без кріопрот. |
37 |
58 13 |
- |
|
|
ПЕО-400 10% |
87 |
120 16* |
78 |
|
|
20% |
91 |
129 12* |
89 |
|
|
ПЕО-1500 10% |
83 |
113 18* |
75 |
|
|
20% |
89 |
130 19* |
85 |
*) Відмінності недостовірні в порівнянні з контролем: Р > 0,05
6. Збереження фрагментів селезінки в часі після відігріву
Заморожування клітин і тканин приводить до появи як явних кріопошкоджень, так і латентних, які можуть проявлятися з часом.
У зв'язку з цим ми вивчали динаміку деяких показників збереження деконсервованого матеріалу в часі. При цьому в якості кріопротекторів використовувались ПЕО-400 і ПЕО-1500 в концентраціях 10 і 20 процентів. Швидкості охолодження були 1 і 10 оС/хв. В результаті були отримані дані, що при швидкості охолодження 1 оС/хв ендогенне дихання фрагментів тканини протягом трьох годин зберігається на рівні, близькому до інтенсивності дихання зразу після відігріву. Збільшення швидкості охолодження приводить до значного зменшення інтенсивності дихання через три години інкубації. Це зменшення більш виражене при використанні як кріопротектора ПЕО-1500. Це може бути пов'язане з тим, що цей кріопротектор не проникає в клітини, і в меншій мірі захищає внутрішньоклітинні органели.
Інтенсивність перекисних процесів, яка після відігріву незначно відрізняється від контрольних значень, через три години інкубації збільшується на 50-70 процентів. Стійкість до перекисного окислення за цей час зменшується несуттєво, якщо використовується кріопротектор в концентрації 20%. При концентрації 10% стійкість також зменшується на 50-70 процентів. Ці процеси в деконсервованому матеріалі можуть пояснити характер залежності ендогенного дихання в часі від кріопротектора, що використовується, і його концентрації. Інші показники збереження матеріалу в часі корелюють з наведеними вище даними.
Таким чином, можна зробити висновок, що вивчені показники зберігаються протягом трьох годин після відігріву матеріалу при його кріоконсервуванні за оптимальними режимами.
Висновки
1. Широке використання фрагментів селезінки і спленоцитів у клінічній практиці, біотехнологіі і наукових дослідженнях стримується відсутністю науково обгрунтованих способів кріоконсервування даного біологічного матеріалу. Результати, одержані при вивченні ефективності різних кріопротекторів в залежності від їх концентрації і швидкості охолодження дозволяють створити банк кріоконсервованого матеріалу.
2. За допомогою полярографічного і хемілюмінісцентного методів дослідження встановлено, що час гіпотермічного зберігання (при +4 оС) селезінки до кріоконсервування її фагментів не повинен перевищувати однієї доби.
3. Максимальне збереження ендогенного дихання фрагментів селезінки спостерігається при їх кріоконсервуванні в присутності 10-20% ПЕО-400 або ПЕО-1500, і при швидкості охолодження 1 оС/хв. При цьому інтенсивність дихання достовірно не відрізняється від контролю. ДМСО і гліцерин у цьому плані ефективні менше.
4. Використання як кріопротекторів ПЕО-400 і ПЕО-1500 при повільних швидкостях охолодження дозволяє зберегти інтенсивність перекисних процесів і стійкість до перекисного окислення на рівні, близькому до контролю.
5. При кріоконсервуванні фрагментів селезінки зі швидкістю охолодження 1 оС/хв такі показники збереження спленоцитів, як ендогенне дихання, сполучення дихання і окислювального фосфорилювання, мембранний потенціал і деякі інші показники залишаються на рівні, близькому до контрольного, якщо використовуються кріопротектори ПЕО-400 або ПЕО-1500 в концентрації 20%. При цьому показники збереження фрагментів селезінки практично не змінюються протягом трьох годин інкубації після відігріву.
6. Отримані результати дозволяють рекомендувати використання кріоконсервованого біоматеріалу в клінічній практиці, а також як джерело спленоцитів для біотехнології і наукових досліджень.
Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації
1. Гальченко С.Е., Мамонтова А.В., Сандомирский Б.П. Влияние режимов криоконсервирования фрагментов селезенки свиньи на интенсивность перекисных процессов //Проблемы криобиоло гии.-1998.- N1.- С.58-61.
2. Гальченко С.Е., Мамонтова А.В., Тыныныка Л.Н., Сандомирский Б.П. Влияние криоконсервирования на интенсивность дыхания фрагментов ксеноорганов //Проблемы криобиологии.- 1998.-N3.-С.45-48.
3. Гальченко С.Е., Мамонтова А.В., Сандомирский Б.П. Сохранность спленоцитов после криоконсервирования фрагментов селезенки //Проблемы криобиологии.- 1998.- N4.- С.52-54.
4. Cандомирский Б.П.,Гальченко С.Е.,Тыныныка Л.Н.,Мамонтова А.В. Разработка технологии криоконсервирования фрагментов ксеноорганов для клинического применения //I З'їзд українського товариства кріобіології і кріомедицини.- Харків, 1995.-С.222
5. Sandomirsky B.P., Galchenko S.E., Volkova N.A, Mamontova A.V., Tynynyka L.N., Belochkina I.V. Xenogenic fragments preservation for clinical application // CRYO'96 "The 33-rd Annual Meeting of the Society for Cryobiology" USA Indiana Indianapolis, 1996, Р. 164.
6. Sandomirsky B.P., Galchenko S.E., Volkova N.A, Belochkina I.V., Mamontova A.V., Tynynyka L.N. High cooling rate effect on the integrity of some tissue fragments// CRYO'97 "The 34-th Annual Meeting of the Society for Cryobiology" Spain, Barcelone, June, 8 - 12, 1997, P. 171.
7. Сандомирский Б.П.,Гальченко С.Е.,Мамонтова А.В.,Тыныныка Л.Н. Криоконсервирование фрагментов ксеноорганов для клинического применения//Актуальные вопросы репродуктологии и криомедицины. Сб. научн. трудов. - Харьков, 1998. - С. 198 - 201.
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Створення ефективної технології низькотемпературного консервування кров’яних пластинок. Вплив факторів кріоконсервування. Антирадикальні властивості кріопротекторів різних класів. Швидкість охолодження кріобіологічної системи у температурному інтервалі.
автореферат [44,0 K], добавлен 09.03.2009Мікрогемоциркуляторні зміни в печінці щурів з експериментальним цирозом після дії дозованої кріогепатодеструкції. Введення екстрактів кріоконсервованих фрагментів печінки і селезінки та при їхньому спільному застосуванні. Їх спільне застосування.
автореферат [47,0 K], добавлен 09.03.2009Загальний огляд проблем стану здоров'я населення на сучасному етапі, аналіз причин їх виникнення та факторів розвитку. Особливості стилю життя сучасної людини. Здоровий спосіб життя як чинник формування, збереження і зміцнення здоров'я населення.
курсовая работа [433,7 K], добавлен 05.01.2011Определение дизентерии свиней. Историческая справка, распространение и степень опасности. Возбудитель дизентерии свиней, эпизоотология, патогенез, клиническое проявление, патологоанатомические признаки, диагностика, профилактика, лечение и меры борьбы.
реферат [19,5 K], добавлен 23.09.2009Характеристика стану здоров’я школярів та його динаміка протягом навчання в початковій школі. Вплив факторів внутрішньошкільного середовища на стан здоров’я учнів. Розробка комплексу профілактичних заходів з оптимізації дії керованих факторів ризику.
автореферат [70,0 K], добавлен 09.03.2009Эпизоотическое состояние хозяйства. Источник возбудителя инфекции. Ветеринарно-санитарные правила по профилактике заболеваний. Составление плана мероприятий по ликвидации сальмонеллеза свиней ф-ла СХК ЗАО "Устье" Оршанского района Витебской области.
курсовая работа [28,7 K], добавлен 21.06.2015Історія відкриття вірусу імунодефіциту людини. Збільшення лімфатичних вузлів, розмірів печінки і селезінки, порушення темпів фізичного розвитку у людей з ВІЛ-інфекцією. Зміст теорій про походження ВІЛ. Найбільше вражені ВІЛ-інфекцією регіони України.
контрольная работа [5,3 M], добавлен 02.06.2019Сальмонеллез свиней – инфекционная болезнь, характер острого и хронического течения. Эпизоотологические данные; инкубационный период; клинические симптомы, патологоанатомические изменения. Диагностика, профилактика, мероприятия по ликвидации заболевания.
курсовая работа [40,8 K], добавлен 24.05.2012Возбудитель хламидиоза свиней. Историческая справка, распространение, степень опасности и ущерб от болезни. Степень напряженности эпизоотической ситуации: стационарность хламидиоза. Патогенез, течение и клиническое проявление, иммунитет и профилактика.
реферат [18,1 K], добавлен 25.09.2009Медична деонтологія - філософія медичної діяльності. Збереження моральності і боротьба із стресовими чинниками в медицині в цілому як основна мета деонтології. Фактори, що впливають на вибір форми спілкування з хворими. Збереження таємниці хворого.
контрольная работа [17,5 K], добавлен 18.04.2010Гостро протікаюча контагіозна хвороба. Профузна діарея з домішками крові і слизу у фекаліях і некротичними змінами в шлунково-кишковому тракті. Патогенез дизентерії свиней, перебіг і клінічний прояв. Імунітет, специфічна профілактика, заходи боротьби.
презентация [863,9 K], добавлен 10.11.2016Инфекционный атрофический ринит свиней. Способствующие факторы: недостаток полноценного белка, витаминов, баланса по кальцию и фосфору в питании, условия содержания супоросных свиноматок, отсутствие моциона. Диагностика, иммунитет, профилактика.
реферат [15,7 K], добавлен 25.09.2009Распространение энзоотической пневмонии свиней. Возбудитель болезни, его морфологические признаки. Длительность скрытого периода болезни, распространение возбудителя контактным или аэрогенным (воздушно-капельным) путем. Лечение и профилактика болезни.
реферат [19,3 K], добавлен 25.09.2009Структура системи ветеринарно-профілактичних заходів. Етіологічні чинники основних інфекційних захворювань респіраторної системи. Поняття про асоційовані хвороби. Збудники респіраторних хвороб. Особливості найбільш поширених респіраторних хвороб свиней.
реферат [32,6 K], добавлен 13.04.2014Епізоотична ситуація щодо дизентерії свиней у тваринницьких господарствах України. Серологічний моніторинг, симптоматика захворювання; виділення, ідентифікація та визначення біологічних властивостей збудника; удосконалення існуючих методів лікування.
дипломная работа [238,6 K], добавлен 12.10.2011Характеристика вируса африканской и классической чумы свиней. Особенности культивирования в различных живых системах. Характеристика клинических признаков данных заболеваний. Этапы репродукции вируса. Идентификация вирусов и постановка диагноза.
реферат [2,2 M], добавлен 14.03.2020Відносні й прямі показання та наслідки кесарева розтину. Дослідження впливу факторів на відновлення здоров’я та фізичний розвиток дітей, народжених шляхом кесарева розтину. Розробка комплексу заходів по впровадженню програми реабілітації таких дітей.
дипломная работа [266,5 K], добавлен 14.12.2010Вивчення антиоксидантної системи організму та впливу на її стан різних факторів. Вивчення тютюнопаління як одної з проблем цивілізованого суспільства. Лабораторне дослідження стану антиоксидантної системи щурів, які підлягали дії тютюнового диму.
дипломная работа [379,3 K], добавлен 21.03.2015Історія вивчення та використання лікарських рослин. Коротка ботанічна характеристика, сировина, хімічний склад на застосування деяких лікарських рослин, які впливають на захворювання дихальної системи. охорона і збереження лікарської рослинної сировини.
курсовая работа [49,4 K], добавлен 21.11.2008Орган зору людини як унікальний і складний витвір природи. Дослідження хвороб зорової сенсорної системи. Аналіз захворюваності на орган зору в Україні та учнів школи №130 та їх причини. Екологічна ситуація в Кривому Розі і її вплив на загострення хвороби.
научная работа [6,0 M], добавлен 09.10.2013
