Вплив гострого та хронічного стресу на вміст цинку в клітинах

Малько М. М. Вплив гострого та хронічного стресу на вміст цинку в клітинах. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 - фізіологія людини і тварин. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2000.

Дисертація присвячена вивченню нейрогуморальних та клітинномолекулярних механізмів стресу. В роботі вперше досліджено загальні закономірності змін вмісту цинку в клітинах при одноразових і багаторазових фізичному навантаженні, іммобілізації та алкоголізації. При гострому стресі концентрація цинку в клітинах підвищується, а при хронічному - знижується. Накопичення цинку в клітинах відбувається також при введенні адреналіну та преднізолону, а пілокарпін, навпаки, знижує вміст цього металу в них. Зміна вмісту секреторних гранул в панкреатичних інсуліноцитах та клітинах Панета базальних відділів кишкових крипт при екстремальних впливах відповідає зміні в них концентрації досліджуваного металу. Зниження вмісту цинку в клітинах гіпокампу хронічно алкоголізованих тварин супроводжується розвитком у них алкогольної мотивації. Розроблені методи та принципова схема досліджень можуть застосовуватися для вивчення впливу різноманітних факторів на вміст цинку в клітинах, а також для оцінки функціонального стану клітин імунної, ентероінсулярної систем та гіпокампу.

Ключові слова: алкоголізація, алкогольна мотивація, гіпокамп, зернисті лейкоцити, іммобілізація, інсулінпродукуючі клітини, клітини Панета, стрес, фізичне навантаження, цинк.

нейрогуморальний стрес цинк панкреатичний інсуліноцит

АННОТАЦИЯ

Малько М.Н. Влияние острого и хронического стресса на содержание цинка в клетках. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2000.

Диссертация посвящена изучению нейрогуморальных и клеточномолекулярных механизмов стресса. Исследование содержания цинка в клетках проводились у 75 нетренированных людей, подвергавшихся острой и хронической алкоголизации, однократной и многократной физической нагрузке, а также у 613 животных (мышей и крыс), которые в острых и хронических опытах подвергались физической нагрузке, иммобилизации и алкоголизации.

Для цитохимического определения цинка использованы разработанные нами методики с применением высокочувствительных металлохромных индикаторов дитизона и 8-ТСХ. Роль симпатоадреналовой, адренокортикальной и парасимпатической нервной систем в регуляции содержания цинка в клетках оценивали в опытах с введением гидрохлорида адреналина и пилокарпина, а также преднизолона. Функциональное состояние системы регуляции обмена глюкозы оценивали методом Хаггедорна-Йенсена. Алкогольную мотивацию изучали на белых беспородных мышах и крысах, предрасположенных к потреблению алкоголя. Доказательством алкогольной зависимости экспериментальных животных являлось добровольное потребление ними раствора этанола в условиях свободного доступа к воде.

Материалом исследований служили мазки крови людей, мышей и крыс. У животных также исследовались поджелудочная железа, тонкий кишечник и гиппокампальная формация головного мозга.

Показано отличие содержания цинка в клетках при остром и хроническом стрессе. Изменения клеточной концентрации цинка при алкоголизации, физической нагрузке и иммобилизации имеют одинаковую направленность и не зависят от характера стрессового воздействия. Изменения концентрации цинка в клетках при экстремальных воздействиях развиваются в две фазы. Первая фаза характеризуется накоплением цинка в клетках. Такие же изменения наблюдаются при введении адреналина и преднизолона. У животных, подверженных острому стрессу, пилокарпин снижает концентрацию цинка в клетках. Повышение содержания цинка в клетках при остром воздействии экстремальных факторов связано с активизацией симпатоадреналовой и адренокортикальной систем, а также снижением активности парасимпатической нервной системы.

При хроническом действии экстремальных факторов развивается вторая фаза - снижение содержания цинка в клетках. Такие же изменения наблюдаются при введении пилокарпина. При хроническом стрессе адреналин и преднизолон повышают концентрацию цинка в клетках. Развитие второй фазы связано со снижением активности симпатоадреналовой и адренокортикальной систем и преобладанием парасимпатической нервной системы.

Изменение содержимого секреторных гранул в панкреатических инсулиноцитах и клетках базальных отделов кишечных крипт (клетках Панета) при остром и хроническом стрессе соответствует изменению в них концентрации цинка. Содержание цинка в клетках может служить показателем их функционального состояния и указывает на угнетение секреторной функции клеток при однократном экстремальном воздействии и ее истощении - при многократном.

Хроническая алкоголизация уменьшает содержание цинка в гиппокампе экспериментальных животных. Выявлена отрицательная корреляционная связь между концентрацией цинка в клетках гиппокампа и количеством добровольно потребляемого этанола алкоголизированными животными. Эти изменения более выражены у молодых мышей и крыс, а также у животных, которые подвергались многократным физическим нагрузкам и иммобилизации. Добровольное потребление этанола хронически алкоголизированными животными, видимо, является попыткой увеличить концентрацию цинка в клетках, а следовательно повысить их защитные свойства.

Показано наличие положительной корреляционной связи между содержанием цинка в зернистых лейкоцитах и содержанием цинка в панкреатических инсулиноцитах, а также клетках Панета и гиппокампа, что указывает на возможность тестирования уровня обеспечения цинком клеток всего организма при остром и хроническом стрессе на основании исследования содержания этого металла только в гранулоцитах крови.

Разработанные методы и принципиальная схема исследований могут применяться для изучения влияния различных факторов на содержание цинка в клетках, а также оценки функционального состояния клеток иммунной, энтеро-инсулярной систем и гиппокампа.

Ключевые слова: алкоголизация, алкогольная мотивация, гиппокамп, зернистые лейкоциты, иммобилизация, инсулинпродуцирующие клетки, клетки Панета, стресс, физическая нагрузка, цинк.

ANNOTATION

Malko M.M. Influence of acute and chronic stress on zinc content in the cells. - Manuscript.

Thesis for a candidates of biological sciences degree by speciality 03.00.13 - Physiology of man and animals. - The Taras Shevchenko Kyiv National University, Kyiv, 2000.

The Dissertation is devoted studying of neuro-humoral and cell-molecular mechanisms of stress. Zinc content the cells under extreme influences (physical loading, immobilization and alcoholization) was studied in work for the first time. It was ascertained that under acute organism stressing zinc concentration in the cells increased, but under chronic one - decreased. Accumulation of zinc in the cells was also observed after injection of adrenaline and prednisolone, but pilocarpine, on the contrary, reduced the content of this metal in them. Changing the secretion of granule content in insulin producing cells and paneth cells under extreme influences corresponds to changes in them of investigated metal concentrations. Reduction of zinc content in hippocampus cells of chronic alcoholized animals was accompanied by the development of alcoholic motivation in them. Elaborated methods and principle of study scheme may be used for studying an influence of different factors on zinc content in the cells, as well as evaluation of functional state of the cells immune, entero-insular systems and hippocampus.

Keywords: alcoholic motivation, alcoholization, granular leukocytes, hippocampus, immobilization, insulin producing cells, paneth cells, physical load, stress, zinc.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вперше концепцію стресу запропонував Г. Сел'є, під яким він розумів вироблений в процесі еволюції, шляхом відбору, неспецифічний комплекс реакцій, що забезпечує живій системі перехід на новий рівень існування. І сьогодні вивчення клітинно-молекулярних і нейрогуморальних механізмів стресу є однією з актуальних проблем біології та медицини.

В літературі недостатньо вивчене питання про роль цинку в механізмах клітинних реакцій на дію стресових факторів, що пов'язано з методичними складностями визначення цього металу. Разом з цим цинк є необхідною складовою активного центру великої кількості металоензимів [Vallec B. L., 1988, Hooper N. M., 1994]. Він бере участь в процесах секреції та гранулоутворення [Huang S.T. et al., 1997], стабілізує клітинні мембрани [Shaheen A. A. et al., 1995]. При дії екстремальних факторів змінюється активність ферментів, секреторна активність та лабілізуються клітинні мембрани [Браун А.Д. и соавт., 1987]. Враховуючи це можна передбачити, що зміни клітинної концентрації цинку при стресі є одним з важливих факторів, який обумовлює таку реакцію.

Оскільки цинк стабілізує клітинні мембрани, а таку ж функцію виконують гормони надниркових залоз [Браун А.Д. и соавт., 1987], можна припустити, що останні відіграють провідну роль в регуляції вмісту цинку в клітинах при стресі. Крім того, гормони надниркових залоз відносяться до контрінсулярних, а цинк бере участь в здійсненні інсуліноцитами інкреторної функції [Huang S. T. et al., 1997, Chausmer A.B., 1998]. В зв'язку з цим, становлять інтерес дослідження вмісту цинку в клітинах інсулярного апарату підшлункової залози при стресових станах.

При вивченні механізмів стресу в якості моделей цього стану традиційно використовують фізичне навантаження та іммобілізацію [Панин Л.Е., 1983]. В якості хімічного фактора стресу можна використовувати алкоголізацію організму [Буров Ю.В. и соавт., 1985]. Остання заслуговує особливої уваги і тому, що цинк є необхідною складовою алкогольдегідрогенази [Caballeria J. et al., 1997], яка каталізує перетворення етанолу в організмі. В літературі наводяться дані про зниження вмісту цинку в плазмі крові при алкоголізмі, але відсутні відомості про зміни його концентрації в клітинах [Maes M. et al., 1994, Sandstead H. H., 1995].

Особливої уваги заслуговують дослідження змін вмісту цинку в гіпокампі при формуванні алкогольної залежності. Цей відділ головного мозку містить значну кількість цинку [Haug F. M., 1975, Bergman T. et al., 1993], бере активну участь в механізмах розвитку мотивацій [Симонов П.В., 1987]. Можна передбачити, що зміни концентрації цинку в гіпокампі при хронічній алкоголізації позначаються на поведінкових реакціях організму. В літературі відомий факт більш важкого перебігу алкоголізму у підлітків [Буров Ю.В. и соавт., 1985]. В зв'язку з цим становлять інтерес дослідження вмісту цинку в гіпокампі молодих хронічно алкоголізованих тварин. Стресові стани є одним з факторів, що сприяють розвитку алкоголізму [Litman G.V., 1974]. Важливо простежити, як вони впливають на зміни вмісту цинку в гіпокампі, викликані етанолом. В якості критерію розвитку алкогольної залежності ми використовували тест на добове споживання етанолу тваринами в умовах вільного доступу до води.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертацію виконано відповідно до основного плану науково-дослідної роботи Запорізького державного університету, вона є фрагментом держбюджетної теми “Розробка і обгрунтування методів діагностики, моделювання та корекції патологічних процесів за допомогою хелантів“(№ державної реєстрації 0197U012782).

Мета і задачі дослідження. Мета дослідження полягала у виявленні загальних закономірностей змін вмісту цинку в клітинах при дії екстремальних факторів, а також ролі симпатоадреналової, адренокортикальної та парасимпатичної нервової систем в цих змінах при гострому і хронічному стресі, вивченні зв'язку між мотиваційними змінами поведінки хронічно алкоголізованих тварин і вмістом цинку в гіпокампі. Для цього поставлені такі задачі:

Визначити вміст цинку в гранулоцитах крові при гострій та хронічній алкоголізації, а також одноразовому і багаторазовому фізичному навантаженні та іммобілізації.

Визначити вміст цинку в клітинах ентероінсулярної системи при дії зазначених факторів.

Вивчити вплив адреналіну, преднізолону та пілокарпіну на вміст цинку в клітинах.

Вивчити зв'язок між змінами вмісту цинку в гіпокампі та мотиваційними змінами поведінки тварин при хронічній алкоголізації.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчений вміст цинку в клітинах при одноразових і багаторазових алкоголізації, фізичних навантаженнях та іммобілізації. Для цитохімічного визначення цього металу використані розроблені нами цитохімічні методики із застосуванням високочутливих металохромних індикаторів дитизону та 8-ТСХ.

Екстремальні фактори, використані в роботі в якості моделей стресу, викликають однотипний характер змін вмісту цинку в клітинах. Встановлено, що зміни концентрації цинку в клітинах при стресових впливах розвиваються у дві фази. Перша фаза характеризується накопиченням цинку в клітинах. Такі ж зміни спостерігаються при введенні адреналіну та преднізолону, що свідчить про роль симпатоадреналової та адренокортикальної систем в розвитку цієї фази. Друга фаза - зниження вмісту цинку в клітинах. Такі ж зміни спостерігаються при введенні пілокарпіну. Висунуте припущення, що розвиток другої фази пов'язаний зі зниженням активності симпатоадреналової та адренокортикальної систем і переважанням впливу парасимпатичної нервової системи.

Гострий та хронічний стрес змінюють вміст цинку в гранулоцитах крові. Концентрація цинку в клітинах може слугувати показником їх функціонального стану. Оскільки цинк стабілізує клітинні мембрани можна вважати, що підвищення його клітинної концентрації при гострому стресі є захисною реакцією організму. Виснаження клітинних депо цинку при хронічному стресі відображає зниження адаптивних можливостей клітин.

Дослідження вмісту цинку та інсуліну в панкреатичних острівцях становлять інтерес з точки зору з'ясування ролі цинку в інкреторній функції підшлункової залози. Виходячи із здатності іонів цинку викликати реакцію полімеризації інсуліну, можна припустити, що накопичення цього металу в панкреатичних інсуліноцитах в гострих дослідах пригнічує інкреторну активність клітин і сприяє розвитку гіперглікемії. Зниження вмісту цинку в В-інсуліноцитах при хронічному стресі позитивно корелює зі зниженням в них концентрації інсуліну. Вміст цього металу в клітинах може слугувати показником інсулінових резервів підшлункової залози.

Визначення вмісту цинку в клітинах базальних відділів кишкових крипт (клітинах Панета) показало їх виражену реакцію на стресові впливи. Оскільки клітини Панета відносяться до так званого “відкритого типу”, можна припустити, що зміни вмісту цинку в цих клітинах при гострому стресі свідчать про затримку досліджуваного металу в організмі. Зменшення клітинної концентрації цинку в панетівських клітинах при хронічному стресі можна розглядати як втрату цього металу організмом.

Дослідженнями показано зниження концентрації цинку в гіпокампі хронічно алкоголізованих тварин. Відзначений зв'язок між ступенем дефіциту цинку в гіпокампі та кількістю добровільно спожитого етанолу. Ці зміни більш виражені у алкоголізованих молодих мишей і щурів, а також у тварин, яких піддавали багаторазовим фізичним навантаженням та іммобілізації. Добровільне споживання етанолу хронічно алкоголізованими тваринами можливо є спробою збільшити концентрацію цинку в клітинах і підвищити їх адаптаційні можливості.

Практичне значення одержаних результатів полягає насамперед в тому, що використані в роботі методи та принципова схема досліджень можуть застосовуватись для вивчення впливу різних факторів, в тому числі екологічно несприятливих, на вміст цинку в клітинах. Простота методів дозволяє застосовувати їх в масових дослідженнях.

Встановлення клітинного дефіциту цинку у досліджуваних осіб дозволяє призначати засоби корекції порушень у вигляді препаратів цинку або дієти багатої цим металом. Такі заходи можна застосовувати для підвищення ефективності адаптації організму при дії екстремальних факторів. Показано, що перша фаза змін клітинного вмісту цинку нівелюється М-холіноміметиками, а другу фазу можна нівелювати симпатоміметиками та глюкокортикоїдами.

Важливе практичне значення мають дослідження зв'язку між дефіцитом цинку в гіпокампі та добовим споживанням етанолу хронічно алкоголізованими тваринами в умовах вільного доступу до води. Отримані дані становлять інтерес з точки зору профілактики та лікування алкоголізму.

Показана можливість тестування рівня забезпечення цинком клітин усього організму при гострому та хронічному стресі на підставі дослідження концентрації цього металу тільки в гранулоцитах крові.

Особистий внесок здобувача. Усі дослідження вмісту цинку в клітинах при гострій та хронічній алкоголізації, одноразовому і багаторазовому фізичному навантаженні та іммобілізації, при введенні адреналіну, преднізолону і пілокарпіну та вивчення зв'язку між вмістом цинку в гіпокампі і добовим споживанням етанолу хронічно алкоголізованими тваринами виконані особисто автором.

Апробація результатів дисертації. Матеріали досліджень, які включені до дисертації, доповідалися і обговорювалися на засіданнях кафедри, наукових конференціях викладачів та студентів Запорізького державного університету 1993-1999 р.р., Всеукраїнській олімпіаді з фізіології (Запоріжжя, 1993); міжнародній науково-практичній конференції “Геоэкологические и медико-экологические проблемы промышленно-городских аггломераций” (Сімферополь, 1994); міжнародних симпозіумах “Біологічні механізми старіння” (Харків, 1996, 1998), регіональній (Запоріжжя, 1997) та міжнародній (Запорiжжя, 1998) наукових конференціях з біоіндикації.

Публікації. Матеріали досліджень опубліковані у 17 наукових роботах, в тому числі 1 винахід і 7 статей.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 139 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури та розділів власних досліджень, обговорення результатів, висновків, списку використаної літератури (90 робіт вітчизняних та 129 зарубіжних авторів, обсягом 24 стор.), і додатків (обсягом 14 стор.). Робота ілюстрована 11 рисунками та 33 таблицями.

Висловлюю щиру подяку за велику повсякденну допомогу у виконанні роботи науковому керівнику професору Бовт Валентині Дем'янівні, а також завідувачу кафедри фізіології людини і тварин та зоології Запорізького державного університету професору Єщенку Віталію Андрійовичу.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження

З метою вирішення поставлених завдань проведені дослідження з залученням 75 нетренованих людей та 613 лабораторних тварин (мишей та щурів). Для вивчення впливу одноразових фізичних навантажень у людей застосовували їзду на велоергометрі “Здоров'я” впродовж 15-30 хв при потужності 1 вт/кг, а в хронічних дослідах обстеженню підлягали особи, що виконували щоденну інтенсивну фізичну роботу впродовж 12-26 днів [Загрядский В.П., Сулимо-Самуйлло З.К., 1976]. В дослідах на тваринах з фізичним навантаженням використовували акваріуми з температурою води 32С, в яких миші плавали впродовж 1 год, а щурі - 2 год. При багаторазових фізичних навантаженнях тварин піддавали такому впливу щодня впродовж 10 діб. В дослідах з примусовою іммобілізацією тварин прив'язували м'якими пов'язками до станка в положенні "на спині" (мишей - на 6 год, щурів - на 8 год). У випадках з багаторазовою іммобілізацією такі досліди повторювали щодня впродовж 10 діб [Панин Л.Е., 1983].

Гостру алкоголізацію проводили однократним введенням в шлунок (тваринам - через зонд) 20%-ного розчину етанолу з розрахунку 10 мл/кг. В хронічних дослідах тварин піддавали дев'ятиразовому введенню етанолу з інтервалами в 3 дні [Буров А.Д. и соавт., 1987]. Доказом алкогольної залежності експериментальних тварин було добровільне вживання ними 15%-ного розчину етанолу за умов вільного доступу до води [Винглинская И.В. и соавт., 1995]. Кількісну оцінку спожитого розчину алкоголю визначали за об'ємом рідини, що зник з поїлки. З метою вивчення особливостей формування алкогольної залежності при впливі стресових факторів алкоголізованих мишей та щурів піддавали щоденним фізичним навантаженням та іммобілізації протягом всього терміну примусової алкоголізації [Буров А.Д. и соавт., 1987].

В окремих серіях дослідів людям і тваринам вводили гідрохлорид адреналіну та пілокарпіну, а також преднізолон. Людям підшкірно вводили 1 мл 0,1%-ного розчину адреналіну гідрохлориду, а також призначали 10-15 мг преднізолону у вигляді таблеток. В експериментах на тваринах гідрохлорид адреналіну вводили підшкірно з розрахунку 0,05 мг/кг; преднізолон вводили внутрішньом'язово в дозі 5-10 мг/кг, а пілокарпін - підшкірно з розрахунку 1 мг/кг [Западнюк И.П. и соавт., 1962, Чекман И.С. и соавт., 1986]. Вміст цукру в крові визначали модифікованим методом Хаггедорна-Йенсена [Гольдберг Е.Д. и соавт., 1993].

Тканини людини і тварин для цитохімічних досліджень брали через 2 год з початку фізичного навантаження, після закінчення терміну іммобілізації і через 2 год після введення етанолу. В хронічних дослідах тканини досліджували через 1 добу після останнього фізичного навантаження та іммобілізації, через 3 доби після останньої алкоголізації. У людей кров відбирали з пальця, а у тварин - з хвоста.

Проби крові використовували для визначення глікемії та приготування мазків. Останні фіксували впродовж 5 хв в парах формаліну і фарбували впродовж 3 год 0,2%-ним водно-аміаковим розчином дитизону, або водночас фіксували і флуорохромували впродовж 1 хв 0,01%-ним ацетоновим розчином 8-ТСХ [Ещенко В.А., 1978]. Цитохімічні реакції дитизону та 8-ТСХ використовували для визначення клітинного вмісту цинку.

У забитих тварин витягали головний мозок, з якого готували заморожені зрізи. Останні флуорохромували ацетоновим розчином 8-ТСХ і досліджували під люмінесцентним мікроскопом. Шматочки підшлункової залози і тонкого кишківника фіксували в холодному ацетоні - для цитохімічного визначення цинку, рідині Буена - для виявлення специфічної зернистості В-інсуліноцитів, нейтральному формаліні - для виявлення зернистості панетівських клітин. Зрізи підшлункової залози і тонкого кишківника флуорохромували ацетоновим розчином 8-ТСХ і досліджували під люмінесцентним мікроскопом. Депарафіновані зрізи підшлункової залози фарбували альдегідфуксином, а тонкого кишківника - гематоксилін-флоксином.

Інтенсивність цитохімічних реакцій оцінювали напівкількісним методом в умовних одиницях за бальною системою, запропонованою В. В. Соколовським [1971], а також Ф. Хейхоу та Д. Квагліно [1983]. За один бал приймали слабопозитивну, за два - помірну, три бали - виражену за інтенсивністю реакцію. Середні значення інтенсивності цитохімічної реакції визначали на основі підрахунку 100 клітин.

Одержаний фактичний матеріал обробляли методом кореляційного аналізу. Визначали середню арифметичну (X) та похибку (m). Достовірність різниць (p) оцінювали за критерієм Ст'юдента.

Результати дослідження та їх обговорення